CN111534525A - 禾谷镰刀菌FgARL1基因及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种禾谷镰刀菌FgARL1基因及其应用，属于植物病害防控技术领域。本发明从禾谷镰刀菌基因组中发现了一个新的致病基因FgARL1，基因FgARL1的全长gDNA序列如SEQ ID NO.1所示；基因FgARL1的cDNA序列如SEQ ID NO.2所示；所编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。该基因对禾谷镰刀菌的菌落生长发育速率以及禾谷镰刀菌对小麦的侵染能力均有影响，可以利用该基因或该基因编码的蛋白作为靶标开发新型抗真菌药剂，对于小麦赤霉病的防治具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明涉及植物病害防控技术领域，具体涉及一种禾谷镰刀菌FgARL1基因及其应用。
背景技术
小麦赤霉病是一种世界性的病害，是小麦的主要病害之一(董金皋主编《农业植物病理学》)。该病由多种镰刀菌引起，其中的优势种为禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)。小麦赤霉病不仅引起小麦产量严重损失，降低小麦的品质，并且由禾谷镰刀菌产生的脱氧雪腐镰刀菌烯醇(Deoxynivalenol，DON)等多种真菌毒素，危及人、畜健康(McMullen,M.,etal.(1997).Scab of Wheat and Barley:A Re-emerging Disease of DevastatingImpact.Plant Dis 81(12):1340-1348.)。
禾谷镰刀菌可在植物病残体上存活越冬，病残体上的子囊壳和分生孢子是小麦赤霉病的主要侵染源。小麦扬花期时，子囊壳会产生成熟的子囊孢子，并随风、雨或昆虫传播至寄主植物小麦上(董金皋主编《农业植物病理学》)。在田间，被病原菌侵染的小麦由于穗轴输导组织被破坏而导致褪绿，小麦麦穗中间若干小穗提前褪绿变白是小麦赤霉病的典型症状(Trail,F.(2009).For blighted waves of grain:Fusarium graminearum in thepostgenomics era.Plant Physiol 149(1):103-110.)。
目前对于禾谷镰刀菌抗药性的问题日益严重。在我国，从二十世纪七十年代以来，多菌灵一直是防治小麦赤霉病的主要药剂。由于40多年连续使用，目前在江苏、安徽、河南、浙江等多个省份出现了多菌灵抗性菌株。病菌抗药性快速发展，加大了病害防治难度，影响了病害防治效果，加重了毒素污染问题(陈云等，小麦赤霉病发生危害形势及防控对策，植物保护，2017，43(5):11-17)。因此，新型抗真菌的药剂研究的重要性越来越突出。
随着病原分子生物学的发展，大量的研究表明，许多的致病相关基因与植物病原菌的病理过程有着密切的关系。因此通过对致病基因的研究，从而发明或改良新型抗真菌药物，对致病菌的防治具有重要的价值和意义。
发明内容
针对上述现有技术，本发明从禾谷镰刀菌基因组中发现了一个新的致病基因FgARL1，该基因对禾谷镰刀菌的菌落生长发育速率以及禾谷镰刀菌对小麦的侵染能力均有影响，可以利用该基因或该基因编码的蛋白作为靶标开发新型抗真菌药剂，对于小麦赤霉病的防治具有重要的意义。
本发明的第一方面，提供一种与致病力相关的禾谷镰刀菌FgARL1基因，所述FgARL1基因为如下a)-d)中任一项所述的DNA片段：
a)SEQ ID NO.1所示的DNA片段；或
b)SEQ ID NO.2所示的DNA片段；或
c)除a)或b)以外的编码SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的DNA片段
d)DNA片段，与a)或b)或c)限定的DNA片段具有90％或90％以上同一性，且编码的蛋白在功能上与SEQ ID NO.3所示的蛋白等价。
本发明的第二方面，提供上述禾谷镰刀菌FgARL1基因编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明的第三方面，提供上述禾谷镰刀菌FgARL1基因或者禾谷镰刀菌FgARL1基因编码的蛋白作为靶标在如下(1)-(4)至少一项中的应用：
(1)减弱禾谷镰刀菌的致病性；
(2)减慢禾谷镰刀菌的菌落生长发育速率；
(3)防治禾谷镰刀菌引起的植物病害；
(4)构建抗小麦赤霉病转基因植物。
本发明的第四方面，提供上述禾谷镰刀菌FgARL1基因或者禾谷镰刀菌FgARL1基因编码的蛋白在制备抗真菌药剂中的用途。
上述用途中，禾谷镰刀菌FgARL1基因或者禾谷镰刀菌FgARL1基因编码的蛋白是作为靶标用于新型抗真菌药剂的研制。
优选的，所述抗真菌药剂为抗小麦赤霉病药剂。
本发明的第四方面，提供含有禾谷镰刀菌FgARL1基因的表达载体、细胞系或者宿主菌在防治小麦赤霉病中的用途。
本发明的第五方面，提供一种降低禾谷镰刀菌致病性的方法，包括：使所述禾谷镰刀菌FgARL1基因表达降低或不表达的步骤。
优选的，使所述禾谷镰刀菌FgARL1基因表达降低或不表达的方法包括：突变或敲除所述FgARL1基因的全部或部分序列；或者构建干涉载体干扰所述FgARL1基因的表达；或者使用基因沉默系统使所述FgARL1基因的表达沉默。
本发明的第六方面，提供一种防治小麦赤霉病的方法，包括以下步骤：
在小麦生长过程中，外源喷施能够抑制禾谷镰刀菌FgARL1基因表达的物质或者外源喷施能够降低禾谷镰刀菌FgARL1基因编码蛋白活性的物质；
或：
将靶向禾谷镰刀菌FgARL1基因且使禾谷镰刀菌FgARL1基因表达下降或不表达的沉默靶基因片段转化至小麦中，获得抗小麦赤霉病的转基因植物。
本发明的第七方面，提供一种防治小麦赤霉病的药剂，所述药剂中含有抑制禾谷镰刀菌FgARL1基因表达的物质；或者含有抑制禾谷镰刀菌FgARL1基因编码的蛋白的活性的物质。
本发明的有益效果：
本发明经过了大量的实验证明，将基因FgARL1从禾谷镰刀菌中成功敲除后，所得到的禾谷镰刀菌敲除突变体的菌落生长发育速率减慢，气生菌丝较稀疏，菌丝分支增多。致病性实验表明，该敲除突变体在小麦麦穗上发病程度明显下降；基因FgARL1的缺失可导致禾谷镰刀菌对小麦的侵染能力下降。筛选能够破坏该基因的表达、剪切及其产物的表达、修饰与定位的药物，是本发明的一个重要的应用。FgARL1编码的蛋白或/和其在其他病原真菌中的同源蛋白均可作为重要的候选靶标，以该基因或蛋白为靶标所研制的新型抗真菌药剂(特别是抗小麦赤霉病药剂)，可破坏该基因的正常表达或蛋白功能，可以有效的防控真菌病害。
附图说明
图1为禾谷镰刀菌基因FgARL1的敲除片段构建示意图及敲除转化子验证示意图。
图2为禾谷镰刀菌敲除突变体基因FgARL1的PCR检测(验证M)。
图3为禾谷镰刀菌敲除突变体潮霉素基因HPH的PCR检测(验证K1、K2)。
图4为禾谷镰刀菌敲除突变体ΔFgArl1在CM、V8、5×YEG、MM培养基上的菌落形态。
图5为禾谷镰刀菌野生型PH-1与突变体ΔFgArl1在CM、V8、5×YEG、MM四种培养基上的菌落直径比较；注：*表示p＜0.05。
图6为禾谷镰刀菌野生型PH-1与突变体ΔFgArl1气生菌丝的变化；注：a和b表示p＜0.05。
图7为禾谷镰刀菌野生型PH-1与突变体ΔFgArl1菌丝分支的变化；Bar＝100μm。
图8为禾谷镰刀菌野生型PH-1与突变体ΔFgArl1对小麦麦穗的致病性；注：禾谷镰刀菌分生孢子接种浓度为2×105个/mL，于接种14天后进行观察；Mock：清水对照；注：a和b表示p＜0.05。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
正如背景技术部分所介绍的，禾谷镰刀菌是小麦和大麦生产上一类重大的病原真菌，由禾谷镰刀菌引发的小麦赤霉病，不仅造成作物严重减产和品质降低，其产生的真菌毒素也会严重危害人体健康，给农业生产造成双重经济损失。因此，发掘和鉴定新的禾谷镰刀菌致病基因对研制新型抗真菌药物以及小麦赤霉病的防治具有重要的价值和意义。
禾谷镰刀菌菌株PH-1(NRRL31084)的全基因组序列已经测出，这对于寻找禾谷镰刀菌的致病基因提供了便利，但是，禾谷镰刀菌PH-1菌株基因组大小为36.1Mb，分布在4条染色体上，由长度大于2kb的511个重叠群组成，预测含有11640个基因，且禾谷镰刀菌基因组中含有大量的SNPs，大多数分布在染色体端粒附近的不连续区域。因此，从禾谷镰刀菌庞大的基因组中寻找、定位以及验证致病基因无异于大海捞针，难度极大。
本发明经过长期的研究才得到一个新的与致病力相关的禾谷镰刀菌FgARL1基因。禾谷镰刀菌FgARL1基因的全长gDNA序列如SEQ ID NO.1所示(包含ORF区的543bp(ATG到TAA)+后面355bp的UTR区域)；禾谷镰刀菌FgARL1基因的cDNA序列如SEQ ID NO.2所示；所编码蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明通过Split-marker重组技术构建基因敲除载体，将其导入禾谷镰刀菌原生质体内；利用同源重组方法将该基因FgARL1从禾谷镰刀菌中敲除，获得敲除突变体ΔFgarl1；所得到的敲除突变体与野生型相比，生长发育速率减慢，气生菌丝较稀疏，菌丝分支增多。致病性实验表明，该敲除突变体在小麦麦穗上发病程度明显下降；基因FgARL1的缺失可导致禾谷镰刀菌对小麦的侵染能力下降。FgARL1编码的蛋白或/和其在其他病原真菌中的同源蛋白均可作为重要的候选靶标，以该基因或蛋白为靶标所研制的新型抗真菌药剂，可破坏该基因的正常表达或蛋白功能，可以有效的防控真菌病害。
基于上述发现的禾谷镰刀菌FgARL1基因，本发明的保护范围还包括与上述基因同源的DNA片段，只要它们编码的蛋白与SEQ ID NO.3所示的蛋白功能等价。本文所指的“与SEQ ID NO.3所示的蛋白功能等价”意味着目标DNA片段所编码的蛋白在生物学功能和生理生化特征等方面与本发明中SEQ ID NO.3所示的蛋白相同或相近。SEQ ID NO.3所示的蛋白典型的生物学功能是调控禾谷镰刀菌的致病性和禾谷镰刀菌的菌落生长发育速率。通过下调SEQ ID NO.3所示的蛋白的表达量和/或活性，可以降低禾谷镰刀菌的菌落生长发育速率以及对小麦的侵染能力。
这些与基因FgARL1同源的DNA片段包括本发明核苷酸序列(SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2)对应的等位基因、同源基因、突变基因和衍生基因；它们编码的蛋白类似于本发明SEQID NO.3所示的蛋白，或存在一个、数个或数十个氨基酸的替换、删除或插入现象，都属于本发明内容。
本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的禾谷镰刀菌FgARL1基因的非关键位置的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有与本发明禾谷镰刀菌FgARL1基因的核苷酸序列90％或者更高同一性的核苷酸，例如90％、92％、94％、96％、97％、98％或者99％，只要编码的蛋白与SEQ ID NO.3所示的蛋白功能等价，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。
这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有90％或更高，或95％或更高，或99％或更高同一性的核苷酸序列。氨基酸或核苷酸序列的等同率可采用BLAST算法测定(Altschul etal.1990.Journal of Molecular Biology 215:403-410；Karlin andAltschul.1993.Proceedings of the National Academy of Sciences 90:5873-5877)。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。
本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。未注明详细条件的实验方法是按照常规试验方法或按照供应商所建议的操作说明书进行的。其中：
禾谷镰刀菌为模式菌种PH-1，供试小麦为“济麦22”，克隆载体为pYF11。
实施例中所使用的部分培养基(培养液)的组成及配制方法为：
(1)PDA培养基：
注意事项：将新鲜的马铃薯洗净除皮，称取200g，将马铃薯切成小块后放入去离子水中加热煮沸30min，用四层纱布过滤并收集滤液，加入15g葡萄糖并用去离子水定容至1L，每200mL分装到提前加入了3g琼脂粉的250mL锥形瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20min。
(2)V8培养基：
121℃高压蒸汽灭菌20min。
(3)5×YEG培养基：
121℃高压蒸汽灭菌20min。
(4)MM固体培养基：
注意事项：调节pH＝6.9，加入200μl Trace elements，用磁力搅拌仪混合均匀后用去离子水定容至1L，每200mL分装到提前加入了3g琼脂粉的250mL锥形瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20min。
Trace elements(100mL):
(5)CM培养基：
注意事项：调节pH＝6.5，加ddH2O定容到1L，121℃高压蒸汽灭菌20min。CM固体培养基仅不加Agar。
20×Nitrate Salts：
加ddH2O定至到100ml，4℃保存。
1000×Trace Elements(Bing):
加ddH2O定至到100ml，4℃保存。
Vitamin Solution
加ddH2O定至到100ml，4℃避光保存。
(6)CMC培养液：
注意事项：CMC室温下较难溶解，先将1.5g CMC提前加入250mL锥形瓶，再将配制好的液体培养基按照100mL每瓶分装，用玻璃棒将CMC搅拌至其悬浮在液体中，121℃高压蒸汽灭菌20min。
(7)YEPD培养液：
121℃高压蒸汽灭菌20min。
(8)TB3培养液：
注意事项：TB3固体培养基，每100mL需加入0.9g琼脂粉，121℃高压蒸汽灭菌20min。
(9)LB培养液：
注意事项:用NaOH调节pH至7.2-7.4，蒸馏水定容至1L。LB固体培养基，每100mL需另加入0.9g琼脂粉。121℃高压蒸汽灭菌20min。
主要试剂配方：
(1)0.5M TRIS·HCl(pH 8.0)：称取6.057g Tris(分子量121.14)，加纯水90ml，用浓盐酸调节pH 8.0，蒸馏水定容至100ml。121℃高压蒸汽灭菌20min，4℃储存备用。
(2)1.2M KCl：
KCl 8.946g
蒸馏水 定容至100mL
(3)STC buffer：
121℃高压蒸汽灭菌25min，4℃储存备用。
(4)PTC溶液：
PEG 8000 40g
STC buffer 定容至100mL
无机细菌滤器(0.45μm)过滤除菌，4℃储存备用。
(5)酶解液(30mL)：
涡旋震荡仪振荡25min，在冰上静置30min，无机细菌滤器(0.45μm)过滤除菌，-20℃储存备用。
(6)100mg/mL G418：
G418 5g
蒸馏水 50mL
完全溶解后，定容至50mL，无机细菌滤器(0.22μm)过滤除菌，再分装到1.5mL EP管中，-20℃冰箱储存备用。
(7)Amp+(100mg/mL)：
Amp+ 10g
蒸馏水 100mL
无机细菌滤器(0.22μm)过滤除菌，-20℃储存备用。
实施例1：禾谷镰刀菌基因FgARL1的敲除、互补载体的构建及原生质体转化
1、敲除载体的构建：
在基因FgARL1的上游和下游各选取长度大小为1000bp左右的序列，并设计引物：
| FgArl1-AF | TAGAAGTTCGGGTGGCTGTG |
| FgArl1-AR | ttgacctccactagctccagccaagccGTGGTGGTTTCTTTCGCTCC |
| FgArl1-BF | gaatagagtagatgccgaccgcgggttTCTTCTTCTGCCTCGGTTTG |
| FgArl1-BR | CGGCTGCTTATGGACAGGAG |
以禾谷镰刀菌基因组DNA为模板，分别用这两对引物扩增获得基因FgARL1的上游同源片段(FgARL1-A)和下游同源片段(FgARL1-B)。
潮霉素基因片段扩增引物：
| HYG-F/H1-F | GGCTTGGCTGGAGCTAGTGGAGGTCAA |
| HY-R/H1-R | GTATTGACCGATTCCTTGCGGTCCGAA |
| YG-F/H2-F | GATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCT |
| HYG-R/H2-R | AACCCGCGGTCGGCATCTACTCTATTC |
以质粒pCB1003为模板，分别用这两对引物扩增获得潮霉素(HYG)抗性基因片断HY(H1)和YG(H2)；
采用重叠延伸PCR技术(OverlapPCR)将FgARL1-A与H1，H2与FgARL1-B连接起来，融合成FgARL1-A-H1和H2-FgARL1-B这两个片段，作为禾谷镰刀菌基因敲除片段。
PCR扩增体系：
PCR反应条件为：
2、回补载体的构建：
根据基因FgARL1的核苷酸序列，在起始密码子和终止密码子处分别设计该基因的上游和下游同源扩增引物FgArl1-C-F/C-R，序列如下：
| FgArl1-C-F: |
| ATCGTGGTTCTCATCACCATCACCATCACTCGAGCCTTCGCTTGGCGTTGTAG |
| FgArl1-C-R： |
| GTGGAATGATGGGATCCAAGCTCGAGCACAAGTTTTGTCTTACCCAGAAGG |
采用CTAB法抽提禾谷镰刀菌野生型基因组DNA；取1μL的基因组DNA，用引物FgArl1-C-F/C-R进行PCR扩增，PCR扩增体系：
PCR反应条件为：
pYF11载体的线性化：在LB液体培养基中摇培含有pYF11的大肠杆菌，参照质粒小提试剂盒说明书提取质粒，质粒pYF11用XhoI酶切，酶切体系如下：
载体与片段连接：
用移液器轻轻吸打混匀，短暂离心，50℃水浴5min，然后放于冰上。
大肠杆菌热激转化：
(1)将DH5α感受态细胞从-80℃拿出，迅速置于冰上融化，取PCR小管加入50μL感受态和目的片段连接产物，并用枪轻轻吸打混匀，冰上静置30min。
(2)42℃水浴热激90s，不要摇动离心管，快速将离心管放到冰上2min。注意：这一步操作一定要快，才能达到热激的目的。
(3)取1.5mL离心管，加入600μL LB培养基(不含抗生素)，混匀后37℃，200rpm，摇1h。
(4)将1.5mL离心管放入离心管中5000rpm离心3min，弃去部分上清，剩余量大约100μL，用枪吸打沉淀，吸取100μL均匀加到LB+Amp的培养基上，用涂布器涂布至液体完全干掉。
(5)将平板倒置放于37℃培养箱中，12h后观察。
(6)挑取培养基上的单菌落进行菌落PCR验证，验证出的转化子送去测序。
3、禾谷镰刀菌原生质体的转化
(1)活化PH-1菌种，使用三代以内的新鲜平板，培养3-4天，用0.5cm的打孔器打菌饼，取平板菌丝边缘活力旺盛的区域。
(2)打取PH-1菌饼5个，接种到100mL CMC培养基中，25℃，200rpm摇培5天。
(3)全部100mL CMC菌液，过1层纱布，收集野生型菌株PH-1分生孢子，4000rpm，5min离心，弃上清，无菌水重悬，然后接种到100mL YEPD培养基中，25℃，200rpm，摇培12h。
(4)准备漏斗和3层无菌的擦镜纸，用1.2M KCL溶液润湿滤纸使其贴壁。下一步用较厚的那一面擦镜纸过滤，收集幼嫩芽管，用1mL大枪吸取1.2M KCl打到菌丝上，快速冲洗，直到菌丝由红棕色变为白色。
(5)取50mL离心管先去空白，超净台上加入菌丝，盖上盖子后，称量菌丝的量(0.1g菌丝+5mL酶解液+5mL1.2M KCl)，充分悬浮并混合，30℃100rpm酶解1.5h。酶解完用血球计数板检测原生质体的数量，每个小格5-6个原生质体即可。
(6)按照10mL酶解液过一层擦镜纸的量，过滤至10mL离心管，并用1.2M KCl冲洗，2000rpm，5min水平离心，弃上清，用STC buffer重悬原生质体，调节浓度至2×107个/mL。
(7)取200μL原生质体，至10mL离心管中，用未剪过的枪头，各取2μg A+H1和B+H2片段直接加入原生质体液体里面，片段加入后混匀，室温静置20min。
(8)用剪过的枪头，分两次加入1.5mL 40％PTC，斜晃旋转混匀至溶液透明，室温静置20min。
(9)加入5mL TB3培养液，5μL Amp(100μg/ml)，25℃，100rpm，摇培16h。
(10)在50℃200mL培养基中加入终浓度为100μg/mL的潮霉素B和100μg/mL的Amp+，取25-30mL TB3培养基，在其中加入5mL的摇培产物，混合均匀后倒2-3个平板，待其凝固后，倒上层培养基：为含有终浓度为200μg/mL的潮霉素B和终浓度为100μg/mL的Amp+的TB3固体培养基。
(11)25℃黑暗培养2-4天，待转化子长出后，挑取转化子至含有终浓度为200μg/mL的潮霉素B的PDA平板上，进行筛选验证。
4、禾谷镰刀菌敲除突变体的筛选验证
(1)设计验证引物M、K1、K2验证基因FgARL1是否被敲除。引物FgArl1-M-F/M-R设计在目的基因FgARL1内部，条带大小为673bp，FgArl1-K1-F设计在引物FgARL1-AF前面，FgArl1-K1-R设计在潮霉素基因HPH内部，条带大小为2160bp，FgARL1-K2-F设计在潮霉素基因HPH内部，FgArl1-K2-R设计在引物FgARL1-BR后面，条带大小为2071bp。
验证引物M、K1和K2的序列如下：
| FgArl1-M-F | TGGTCCGAGACGCTAACGA |
| FgArl1-M-R | GTCCTGGTTGACGGTTTGCTA |
| FgArl1-K1-F | CGTAGAGGTAGGGGCTATCCAT |
| FgArl1-K1-R | ATGTTGGCGACCTCGTATTGG |
| FgArl1-K2-F | TTCCTCCCTTTATTTCAGATTCAA |
| FgArl1-K2-R | GTTGTGCGGCCTGGGATG |
(2)CTAB法提取野生型PH-1和疑似转化子的DNA为模板，用引物M-F/M-R、K1-F/K1-R和K2-F/K2-R进行PCR验证。
(3)电泳验证：野生型能扩出M但扩不到K1和K2，突变体不能扩到M但能扩到K1和K2。
结果分析：禾谷镰刀菌基因组DNA的提取，利用特异性引物的PCR扩增，根据图1的示意图的验证方法，对5个禾谷镰刀菌潮霉素阳性转化子进行了分析。M的验证结果表明，5个禾谷镰刀菌转化子均没有扩增到基因FgARL1，说明这5个转化子不含有基因FgARL1(图2)；进一步验证K1、K2发现这五个转化子均有潮霉素抗性基因片段，且K1符合2160bp，K2符合2071bp(图3)，进一步说明该转化子均为阳性转化子。
实施例2：禾谷镰刀菌基因FgARL1在真菌生长发育中的作用
1、禾谷镰刀菌菌落形态的观察和生长速度的测量
(1)在PDA培养基上活化禾谷镰刀菌野生型PH-1、突变体ΔFgarl1(ΔFgarl1-3、ΔFgarl1-4)、回补ΔFgarl1/FgARL1，在平板边缘用打孔器打取菌饼，置于25℃培养箱中黑暗培养3天。
(2)用25mm打孔器在菌落边缘打取菌饼，接种到CM、MM、V8、5×YEG培养基上，放置25℃培养箱中黑暗培养3天，每个菌种重复三个，十字交叉法量取菌落直径并拍照。
结果分析：在CM、V8、5×YEG和MM四种培养基上，突变体ΔFgarl1较野生型PH-1来说菌丝的生长发育明显变缓(图4)；统计结果表明：突变体ΔFgarl1与野生型PH-1的菌丝营养生长存在显著性差异(图5)。
2、禾谷镰刀菌气生菌丝的测定
(1)准备12支直径为2cm的长试管，灭菌，在试管中加入3mL PDA培养基，试管直立放置于通风处，直至试管壁上没有水雾即可。
(2)活化野生型PH-1、突变体ΔFgarl1(ΔFgarl1-3、ΔFgarl1-4)、回补ΔFgarl1/FgARL1，用打孔器在菌落边缘打取菌饼，用长竹签接种于试管内，每个菌株重复三个，放入25℃培养箱中黑暗直立放置培养4-5天，观察并测量气生菌丝高度，拍照。
结果分析：禾谷镰刀菌野生型的气生菌丝浓密，而突变体ΔFgarl1的气生菌丝较稀疏，并且与野生型相比，突变体ΔFgarl1的气生菌丝生长速度缓慢(图6)。
3、禾谷镰刀菌菌丝分支的观察
(1)在PDA平板上活化野生型PH-1、突变体ΔFgarl1(ΔFgarl1-3、ΔFgarl1-4)、回补菌株ΔFgarl1/FgARL1，培养两天。
(2)盖玻片提前用75％的乙醇浸泡消毒，擦干后斜插进PDA平板，让菌丝长至盖玻片上，生长一天后，取下盖玻片，在显微镜下观察菌丝分支情况并拍照。
结果分析：相比于禾谷镰刀菌野生型PH-1，突变体ΔFgarl1菌丝分支现象更为明显，菌丝分支增多(图7)。
实施例3：禾谷镰刀菌基因FgARL1在致病性中的作用
1、禾谷镰刀菌致病力测定
(1)活化野生型PH-1、突变体ΔFgarl1(ΔFgarl1-3、ΔFgarl1-4)、回补菌株ΔFgarl1/FgARL1，在CMC培养基中进行产孢诱导，过滤后将分生孢子的浓度调到2×105个/mL，放置于冰上，用于田间接种。
(2)供试植株为济麦22，在扬花期进行麦穗接种。
(3)选择生长状况良好、长型一致的小麦麦穗，每个菌株接种30株小麦，接种前混匀孢子悬浮液，用移液器吸取10μL孢子悬浮液打在小麦麦穗的外稃和内稃之间，接种后挂上标签，做好标记。
(4)接种后向麦穗喷洒无菌水，套上袋子保湿两天。
(5)取下保湿的自封袋，接种14天后观察发病情况，统计计算发病指数并拍照。
结果分析：相比于禾谷镰刀菌野生型PH-1，突变体ΔFgarl1接种后，病穗数明显减少(图8)。该结果说明敲除禾谷镰刀菌基因FgARL1后，其致病力明显下降。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 山东农业大学
<120> 禾谷镰刀菌FgARL1基因及其应用
<130> 2020
<160> 19
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 898
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atgggaaact caatgtcatg gttttccaac ctactgttct cgaaaaagga gattagaata 60
ttgattcttg gcctggacaa cgcaggcaag accactttgt tataccgact caaggttggc 120
gaggtcgtca caacgatacc cacgatcggg tttaacgtcg aatctgtcac atacaagaat 180
cttaacttca atgtctggga tctcggtggt caaacaagca tccggccata ctggcggtgt 240
tactatgcca acacggcagc tgtcatcttc gtcgtagact ccaccgatat cgagcgatta 300
catacggctt cagaagagct gtcggccatg ttgaacgagg aggagctcaa ggatgcggcg 360
ctgctagtgt ttgccaacaa gcaggaccag cctggtgcca agggcgcggg cgagatctcg 420
gaagcgctgc gcctgggtga gctccgagat cgcaactgga gcatcatggc ctgttcggcg 480
gtcgacggta gcggtgtgaa cgagggtatg gactggcttg tgcaaaccgt caaccaggac 540
taaagcccaa tcatgatttc ttcttctgcc tcggtttggc attgtataac agacgacatg 600
aaatgatagt accacctcac ctttccgtcg caacccggta gacagcgtgt gcaaggagga 660
tgagggaagg aaagagaaag ggcagagagc cgggacgtgt tatgtgggag gacgaggagg 720
atatatgata gtataacttt ataatgctac ggcccaggtc cgatcgagcc ctggttacga 780
ttctcaaact gacaccttga gtcactcctt tgtcgcggga cacacgagac gatctctgtt 840
cgaaacgata aagacttgtg atatatgcag aacccttctg ggtaagacaa aacttgtg 898
<210> 2
<211> 543
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
atgggaaact caatgtcatg gttttccaac ctactgttct cgaaaaagga gattagaata 60
ttgattcttg gcctggacaa cgcaggcaag accactttgt tataccgact caaggttggc 120
gaggtcgtca caacgatacc cacgatcggg tttaacgtcg aatctgtcac atacaagaat 180
cttaacttca atgtctggga tctcggtggt caaacaagca tccggccata ctggcggtgt 240
tactatgcca acacggcagc tgtcatcttc gtcgtagact ccaccgatat cgagcgatta 300
catacggctt cagaagagct gtcggccatg ttgaacgagg aggagctcaa ggatgcggcg 360
ctgctagtgt ttgccaacaa gcaggaccag cctggtgcca agggcgcggg cgagatctcg 420
gaagcgctgc gcctgggtga gctccgagat cgcaactgga gcatcatggc ctgttcggcg 480
gtcgacggta gcggtgtgaa cgagggtatg gactggcttg tgcaaaccgt caaccaggac 540
taa 543
<210> 3
<211> 180
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 3
Met Gly Asn Ser Met Ser Trp Phe Ser Asn Leu Leu Phe Ser Lys Lys
1 5 10 15
Glu Ile Arg Ile Leu Ile Leu Gly Leu Asp Asn Ala Gly Lys Thr Thr
20 25 30
Leu Leu Tyr Arg Leu Lys Val Gly Glu Val Val Thr Thr Ile Pro Thr
35 40 45
Ile Gly Phe Asn Val Glu Ser Val Thr Tyr Lys Asn Leu Asn Phe Asn
50 55 60
Val Trp Asp Leu Gly Gly Gln Thr Ser Ile Arg Pro Tyr Trp Arg Cys
65 70 75 80
Tyr Tyr Ala Asn Thr Ala Ala Val Ile Phe Val Val Asp Ser Thr Asp
85 90 95
Ile Glu Arg Leu His Thr Ala Ser Glu Glu Leu Ser Ala Met Leu Asn
100 105 110
Glu Glu Glu Leu Lys Asp Ala Ala Leu Leu Val Phe Ala Asn Lys Gln
115 120 125
Asp Gln Pro Gly Ala Lys Gly Ala Gly Glu Ile Ser Glu Ala Leu Arg
130 135 140
Leu Gly Glu Leu Arg Asp Arg Asn Trp Ser Ile Met Ala Cys Ser Ala
145 150 155 160
Val Asp Gly Ser Gly Val Asn Glu Gly Met Asp Trp Leu Val Gln Thr
165 170 175
Val Asn Gln Asp
180
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tagaagttcg ggtggctgtg 20
<210> 5
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
ttgacctcca ctagctccag ccaagccgtg gtggtttctt tcgctcc 47
<210> 6
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
gaatagagta gatgccgacc gcgggtttct tcttctgcct cggtttg 47
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cggctgctta tggacaggag 20
<210> 8
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
ggcttggctg gagctagtgg aggtcaa 27
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<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gtattgaccg attccttgcg gtccgaa 27
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
gatgtaggag ggcgtggata tgtcct 26
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<212> DNA
<213> 人工序列
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aacccgcggt cggcatctac tctattc 27
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<211> 53
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
atcgtggttc tcatcaccat caccatcact cgagccttcg cttggcgttg tag 53
<210> 13
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
gtggaatgat gggatccaag ctcgagcaca agttttgtct tacccagaag g 51
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<212> DNA
<213> 人工序列
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tggtccgaga cgctaacga 19
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<213> 人工序列
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<211> 21
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<210> 18
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
ttcctccctt tatttcagat tcaa 24
<210> 19
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
gttgtgcggc ctgggatg 18
Claims (10)
1.与致病力相关的禾谷镰刀菌FgARL1基因，其特征在于，所述FgARL1基因为如下a)-d)中任一项所述的DNA片段：
a)SEQ ID NO.1所示的DNA片段；或
b)SEQ ID NO.2所示的DNA片段；或
c)除a)或b)以外的编码SEQ ID NO.3所示氨基酸序列的DNA片段
d)DNA片段，与a)或b)或c)限定的DNA片段具有90％或90％以上同一性，且编码的蛋白在功能上与SEQ ID NO.3所示的蛋白等价。
2.由权利要求1所述的禾谷镰刀菌FgARL1基因编码的蛋白，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.权利要求1所述的禾谷镰刀菌FgARL1基因或权利要求2所述的蛋白作为靶标在如下(1)-(4)至少一项中的应用：
(1)减弱禾谷镰刀菌的致病性；
(2)减慢禾谷镰刀菌的菌落生长发育速率；
(3)防治禾谷镰刀菌引起的植物病害；
(4)构建抗小麦赤霉病转基因植物。
4.权利要求1所述的禾谷镰刀菌FgARL1基因或权利要求2所述的蛋白在制备抗真菌药剂中的用途。
5.根据权利要求4所述的用途，其特征在于，所述抗真菌药剂为抗小麦赤霉病药剂。
6.含有权利要求1所述的禾谷镰刀菌FgARL1基因的表达载体、细胞系或者宿主菌在防治小麦赤霉病中的用途。
7.一种降低禾谷镰刀菌致病性的方法，其特征在于，包括：使权利要求1所述的禾谷镰刀菌FgARL1基因表达降低或不表达的步骤。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，使所述禾谷镰刀菌FgARL1基因表达降低或不表达的方法包括：突变或敲除所述FgARL1基因的全部或部分序列；或者构建干涉载体干扰所述FgARL1基因的表达；或者使用基因沉默系统使所述FgARL1基因的表达沉默。
9.一种防治小麦赤霉病的方法，其特征在于，包括以下步骤：
在小麦生长过程中，外源喷施能够抑制权利要求1所述的禾谷镰刀菌FgARL1基因表达的物质或者外源喷施能够降低禾谷镰刀菌FgARL1基因编码蛋白活性的物质；
或：
将靶向禾谷镰刀菌FgARL1基因且使禾谷镰刀菌FgARL1基因表达下降或不表达的沉默靶基因片段转化至小麦中，获得抗小麦赤霉病的转基因植物。
10.一种防治小麦赤霉病的药剂，其特征在于，所述药剂中含有抑制权利要求1所述的禾谷镰刀菌FgARL1基因表达的物质；或者含有抑制禾谷镰刀菌FgARL1基因编码的蛋白的活性的物质。
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- 2020-05-22 CN CN202010440545.XA patent/CN111534525A/zh active Pending
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