CN104651319A - 一种禾谷镰刀菌低毒病毒FgHV2/JS16及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种禾谷镰刀菌低毒病毒FgHV2/JS16，其全基因组序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。本发明禾谷镰刀菌低毒病毒FgHV2/JS16在减弱禾谷镰刀菌致病性方面具有显著效果。

Description

一种禾谷镰刀菌低毒病毒FgHV2/JS16及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，特别是涉及一种禾谷镰刀菌低毒病毒FgHV2/JS16及其应用。

背景技术

禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum Schw.)是镰刀菌中重要的一个种，能引起田间禾本科作物病害。如有小麦赤霉病。侵染麦粒或玉米后，生出白色絮状或绒状菌丝，后呈白色至玫瑰色、白色至粉红色或白色至砖红色。有性态为Gibberella zeae Schw.petch属半知菌亚门真菌。无性态属子囊菌亚门真菌。在培养基中白色气生菌丝茂密，基内菌丝分泌红褐色色素。生活史包括有性世代和无性世代。有性世代产生子囊壳，梨形有口。棒状子囊丛生与子囊壳，每个子囊里有八个子囊孢子，子囊孢子纺锤形，通常有三个隔膜。无性世代产生分生孢子，呈镰刀状，通常有三到五个隔膜。

禾谷镰刀菌的寄主范围广泛，可侵染谷类作物小麦、大麦和玉米(Bluhm et al.2007)，并且可以分泌一些毒素物质——单端孢霉烯族毒素类(Trichothecenes)和霉菌毒素雌激素(Oestrogenic mycotoxin)、玉米微菌毒素(Zearelanone)，含有一定水平毒素的谷物被人畜使用后会引起明显的中毒症状，包括恶心、呕吐甚至流产等。近年来，不同地区和不同品种上引起麦类赤霉病的优势种菌为禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum schw)目前，禾谷镰刀菌引起的麦类赤霉病的防治主要以化学防治为主，多使用广谱性杀菌剂如阿米西达、噻菌灵和多菌灵等。化学药剂对赤霉病的防治效果较差，难以挽回损失。在发病严重的田块，会引起大量的减产。而大剂量频繁使用化学农药又会对自然环境包括土壤、地下水等造成严重的污染。药物残留会随着食物链逐渐聚集到人体内。土壤和地下水的污染会造成自然环境的不断恶化，影响人类的生存条件。第二种防治方法主要为农事管理。如要轮作栽培，防止因连作引起病原菌的积累。进行土壤、栽培基质消毒；栽培时发现病株应及时拔除并销毁，减少病菌的进一步扩散。还有掌握好植株栽培密度，加强通风透气，降低湿度，控制好土壤或基质的含水量，宜选用排水良好的基质。这些措施能够一定程度的防治赤霉病的大爆发及流行。

防治病害比较有效的办法为培育抗病品种。但截至目前，还没有商品化的完全抗病或完全免疫的小麦品种。小麦对赤霉病的抗性分为五类，分别为一型抗侵入、二型抗扩展、三型抗毒素积累、四型籽粒抗侵染及五型耐病型五个类型"(Mesterhazy et al.,1995)。目前，单基因转化小麦培育转基因小麦品种在技术上已经能够实现(Dahleen et al.2001)。将一些已经鉴定的抗赤霉病基因转入优良小麦品种中能够有效的提高对赤霉病的抗性。小麦等寄主抗赤霉病基因鉴定数量有限限制了抗病品种的培育。已鉴定的抗性基因包括葡聚糖酶和几丁质酶等降解酶以及一些甜蛋白和阻碍脱氧雪腐镰刀菌烯醇聚集的蛋白(Anand et al.2003)。

真菌病毒存在于所有的主要类群真菌中。自1962年第一例真菌病毒被报道以后，大量的真菌病毒被发现并研究。但是真菌病毒的研究还没有得到足够的重视，并且表现出一定的滞后性。主要原因包括，第一，真菌病毒侵染不表现出明显的症状，因此不容易被人所发掘和重视，而且大部分的真菌学家在接触到菌落异常的菌株时不会想到可能是由于真菌病毒侵染导致的。第二，研究真菌病毒的病毒学家比较少。当前的研究热点主要集中在能减弱寄主致病性的真菌病毒，探索这些病毒的复制机制、蛋白功能以及在农业真菌病害生物防治上的应用。至今为止的真菌病毒系统中，仅栗疫菌低毒病毒CHV1/EP713被成功用于生物防治，它在意大利发现及应用,拯救了因栗疫病危害而濒临绝灭的欧洲栗树林。现阶段植物真菌病害的防治是一个难题，随着化学农药的大量施用，在病害防治的同时给环境造成巨大的污染，包括土壤污染、食品污染、大气污染和水污染。真菌病毒作为一项生物防治资源，将会为真菌病害的防治提供一个新的途径。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种在减弱禾谷镰刀菌致病性方面具有显著效果的禾谷镰刀菌低毒病毒FgHV2/JS16。

一种禾谷镰刀菌低毒病毒FgHV2/JS16，其全基因组序列如序列表中SEQ ID NO:1所示。

本发明所述的禾谷镰刀菌低毒病毒FgHV2/JS16在减弱禾谷镰刀菌致病性的应用。

一种菌株，其含有本发明所述的禾谷镰刀菌低毒病毒FgHV2/JS16。

本发明所述的菌株，保藏号CGMCC NO.10323，保藏日期：2015年1月20日。

本发明禾谷镰刀菌低毒病毒FgHV2/JS16与现有技术不同之处在于：本发明所述的禾谷镰刀菌JS16菌株是本实验室从江苏省发生赤霉病的小麦穗上分离的，已经于2015年1月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行了保藏，登记入册编号保藏号CGMCC NO.10323。本实验室已成功从JS16菌株鉴定到低毒病毒科病毒FgHV2/JS16，其可以减弱禾谷镰刀菌致病性的功能研究，具有在生物防治中的应用潜能，并具有广阔的应用前景。

下面结合附图对本发明的禾谷镰刀菌低毒病毒FgHV2/JS16作进一步说明。

附图说明

图1为本发明中禾谷镰刀菌菌株JS16中所提取的双链RNA；泳道M，DNA marker；泳道1，菌株JS16分离到的dsRNA；泳道2，菌株HN10提取dsRNA作为阳性对照；泳道2，菌株JS16-F提取dsRNA作为阴性对照；

图2为本发明中菌株JS16提取病毒FgHV2/JS16的基因组结构图，gRNA为病毒基因组结构图，D-RNA为病毒所含有缺陷型RNA的结构图；

图3为本发明中菌株JS16-F用Northern杂交证实脱毒情况；gRNA为病毒基因组RNA，D-RNA为病毒的缺陷型RNA，Prob1是地高辛标记的病毒基因组RNA 5’端cDNA探针，Prob2是地高辛标记的病毒基因组RNA 3’端cDNA探针，JS16是带毒菌株，JS16-F是脱毒菌株；

图4为本发明中菌株JS16和JS16-F在PDA培养基上的菌落形态；JS16是带毒菌株，JS16-F是脱毒菌株；

图5为本发明中菌株JS16和JS16-F在PDA培养基上的菌落直径(A)、生长速度(B)和在PDB培养基上生物量(C)；JS16是带毒菌株，JS16-F是脱毒菌株；

图6为本发明中菌株JS16和JS16-F的分生孢子产量比较。JS16是带毒菌株，JS16-F是脱毒菌株；

图7为本发明中菌株JS16和JS16-F的DON毒素产量比较；JS16是带毒菌株，JS16-F是脱毒菌株；

图8为本发明中菌株JS16和JS16-F的致病性比较，A是每麦穗发病小穗数统计，B是麦穗发病情况，C是发病小穗的籽粒品质情况；JS16是带毒菌株，JS16-F是脱毒菌株。

具体实施方式

实施例1禾谷镰刀菌JS16菌株病毒dsRNA提取

先将甘油管中冻存的镰刀菌菌株进行活化。挑取已活化菌株的菌饼，放置于覆盖有一层玻璃纸的PDA培养基上平板的中央位置，25℃培养96h。病毒基因组提取方法参照植物病毒dsRNA提取的方法。RNA提取的过程中尽量使用一次性塑料器皿，若用器皿如研磨棒、玻璃器皿等应在使用前按下列方法进行处理看，用0.1％DEPC(焦碳酸二乙酯)水溶液在37℃下处理12小时，然后在120℃下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。实验操作的主要步骤如下：①将菌丝已长满整个PDA平板的玻璃纸揭下，轻轻卷曲后放入2ml离心管内，用研磨棒液氮研磨均匀，加入2倍体积(w/v)的1×STE缓冲液、2倍体积的(v/v)Tris饱和苯酚和2％的10％SDS，室温搅拌1h；②10,000rpm离心20min后取上清，加入等体积的氯仿，室温搅拌10min；③12,000rpm离心10min后取上清，加入乙醇至终浓度为16％(v/v)，再加入4％的CF-11纤维素(w/v)。室温搅拌30min；④12,000,rpm离心3min倒掉上清留沉淀，加入含16％乙醇的1×STE缓冲液，剧烈震荡1min，沉淀用含16％乙醇的1×STE缓冲液重复洗涤三次；⑤12,000,rpm离心3min留沉淀，加入1×STE缓冲液，剧烈震荡1min，12,000,rpm离心3min，将上清转移到另一离心管内，沉淀用1×STE缓冲液重复溶解一次。合并两次所得的洗脱液；⑥加入1/10体积的NaAc(3mol/L，pH 5.2)，再加入2.5倍体积的无水乙醇，混匀后，置于-80℃冰箱1h；⑦4℃，12,000rpm离心15min，弃上清留沉淀，用70冷乙醇洗涤两次，吹干后溶于30ul的DEPC处理的ddH2O；⑧DNA酶消化。加入1ul RNase-Free的DNase I和3.44ul的10×DNase I buffer后，37℃消化30min；⑨1％琼脂糖凝胶电泳。

结果：带毒菌株JS16及其所携带的dsRNA病毒经DNase消化后的1％琼脂糖凝胶电泳如图1所示，病毒含有2条dsRNA，一条大于10kb，一条大小5kb左右。

本发明带毒菌株JS16已经于2015年1月20日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行了保藏，登记入册编号保藏号CGMCC NO.10323。

实施例2禾谷镰刀菌低毒病毒FgHV2/JS16基因组的cDNA克隆及序列分析

(1)菌株JS16病毒基因组随机引物cDNA克隆

随机引物反转录:模板为提取菌株JS16的dsRNA，反转录酶为promega的M-MLV，所用引物为Random Primer(26-mer)(5’-GACGTCCAGATCGCGAATTCNNNNNN-3’)。

PCR扩增：取上一步合成的cDNA产物为模板，利用单引物进行扩增，扩增引物为RandomPrimer(20-mer)(5’-GACGTCCAGATCGCGAATTC-3’)。扩增所用的酶为全式金公司的2×TransScriptTM HiFi PCR SuperMixⅡ。

PCR产物与T载体的连接，转化及测序验证：利用OMEGA公司的DNA凝胶回收试剂盒，按照说明书对上述PCR产物进行纯化回收。回收后将目的片段连接到T克隆载体pMD19-T(TaKaRa)。

(2)菌株JS16病毒基因组特异引物cDNA克隆

特异引物设计:根据已获得随机片段克隆序列，设计引物。引物设计软件为primerpremier5，设计方法参照软件说明书，参数使用默认参数。引物设计的模板是两个相分隔的随机片段，在两个随机片段上分别设计上游和下游引物。设计引物时首先判断随机片段是否为正义链，第二个方面判断序列的方向性，第三个方面判断随机片段相互间的上下游关系，即相距病毒5’端或3’端的距离。通过初步的判断设计随机片段之间的引物，不能进行判断的随机序列，通过设计各种可能序列(包括正向、反向互补)引物进行扩增。

PCR扩增及PCR产物与T载体的连接，转化及验证测序:PCR扩增时退火温度根据引物的Tm值确定，一般退火温度等于Tm值减5。延伸时间根据片段长度确定，因为两个随机片段中间的序列长度未知，所以一般设置较长的延伸时间，3min。

(3)菌株JS16病毒基因组RACE

病毒5’末端序列扩增:5’端RACE的方法为经典的5’RACE克隆方法，利用末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)在反转录产物cDNA的3’端加上polyC尾巴，然后利用接头引物及序列特异引物进行巢式PCR扩增。PCR产物与T载体的连接，转化及验证测序。

病毒基因组3’末端序列扩增：3’末端序列扩增所用技术为oligo RNA末端连接RACE(RLM-RACE)。在T4RNA连接酶的作用下，将一断具有特殊修饰的寡核苷酸链(5’端磷酸化修饰，3’端氨基修饰)连接到RNA链的3’羟基末端。根据寡核苷酸链序列设计特异引物，与3’端序列特异引物一同将3’末端序列扩增出来。PCR产物与T载体的连接，转化及验证测序。

(4)菌株HN10病毒基因组全序列拼接

使用DNAMAN软件的序列拼接功能将随机引物cDNA克隆序列、特异引物cDNA克隆序列、RACE克隆序列拼接起来，构成完整的病毒基因组序列。

结果：菌株JS16所携带病毒的基因组全长为12800nt(参见SEQUENCE LISTING)。DANMAN软件预测其可以编码一个ORF，该ORF起始于第458处碱基，终止于第12290处碱基，共编码3944个氨基酸的多聚蛋白，包含病毒的蛋白酶结构域，解旋酶结构域，RNA依赖的RNA聚合酶结构域(RDRP)和一个新的SMC结构域(图2)。根据基因组结构和进化树分析，将病毒FgHV2/JS16的分类地位确定为低毒病毒科的一种新病毒。该病毒含有一条4553个核苷酸的缺陷性RNA(D-RNA)(图2)。

实施例3脱毒株制备

(1)参照NoemíHerrero等的药物处理过程，用打孔器打取5mm带毒株菌饼接种于含有浓度为100μmol/L的利巴韦林PDA平板上处理带毒株，25℃避光培养；待菌丝即将长满全板前挑取菌丝尖端约0.5mm，接种于同样在含有100μmol/L利巴韦林的PDA平板上25℃避光继代培养；待长出菌丝后，在菌丝边缘打取直径0.5mm的菌饼接种于含有浓度为100μmol/L利巴韦林的100mL CMC培养基中，200rpm/min 25℃避光产孢；4-5d后镜检产孢情况，用单层灭菌Mirocloth纱布过滤孢子液，浓缩滤液至浓度为1×108个/mL，将3×108个孢子接种于100mL含有浓度为100μmol/L利巴韦林的YEPD培养基中，25℃，200rpm/min摇床培养12-14h(这里时间要控制好，时间太短，孢子萌发不充分，过滤时会与原生质体混在一起，影响原生质体质量，时间太长，菌丝太老，细胞壁不易酶解，影响原生质体产量)；用单层Mirocloth纱布过滤菌丝，可用灭菌ddH2O洗涤菌丝，以免未萌发孢子影响后续试验，将菌丝置于灭菌滤纸上吸去多余水分，放入20mL酶解液中，28℃，90r/min轻摇2h左右，期间每隔30min进行镜检，观察菌丝酶解程度；观察产生大量原生质体后即可停止酶解反应，用2层Mirocloth纱布过滤酶解液，收集原生质体，将原生质体2600g/min 4℃离心1min，弃去上清，用冰上预冷的STC缓冲液按上述离心条件洗涤原生质体3次；将原生质体稀释浓度为400个/mL，取50μL涂布于再生培养基上，25℃避光培养过夜，在体视显微镜下挑取单菌落，接种于含浓度为100μmol/L利巴韦林的PDA平板上，待长出菌丝后，打取0.5mm菌饼，接种于铺有灭菌玻璃纸含有浓度为100μmol/L利巴韦林的PDA平板上，待菌丝长满全板后即可收集菌丝。

(2)提取候选脱毒菌株的RNA，用地高辛标记的FgHV2/JS16基因组RNA 5‘端和3‘端cDNA探针分别和候选脱毒菌株的RNA做Northern杂交，验证脱毒的真实性。

结果：经过菌株的RT-PCR和斑点杂交证实，获得一株脱毒菌株，命名为JS16-F(图3)。

实施例4禾谷镰刀菌低毒病毒FgHV2/JS16的生物学功能

(1)带毒菌株和不带毒菌株菌落形态及生长速度测定

用5mm打孔器打取带毒菌株JS16和不带毒菌株JS16-F的菌饼置于PDA培养基平板的中央，活化菌株；用5mm打孔器打取活化菌株的菌落边缘菌饼，将菌饼转移到PDA和CM培养基上平板的中央，分别三个重复；25℃黑暗培养36h后观察菌落形态和测量菌落直径并统计分析。每个处理重复三次。

(2)带毒菌株和不带毒菌株分生孢子形态观察及产量测定

用5mm打孔器打取带毒菌株JS16和不带毒菌株JS16-F的菌饼置于PDA培养基平板的中央，活化菌株；用5mm打孔器打取活化菌株的菌落边缘菌饼，将一块菌饼转移到装有50mlCMC培养基的三角瓶中，25℃，200rpm/min摇床培养5d；用三层擦镜纸过滤孢子悬浮液后取过滤液在显微镜下观察孢子形态并用血球计数板计量孢子浓度，每个处理三次重复。

(3)带毒菌株和不带毒菌株致病力测定

种植小麦小堰22号，待小麦生长至扬花盛期时用于小麦穗接种。此时籽粒还没有长出，利于禾谷镰刀菌的侵染；按上述方法制备带毒菌株JS16和不带毒菌株U3的分生孢子，并用血球计数板计量孢子浓度后将孢子浓度调节为3×10⁵待用；选取长势基本一致的小麦穗，自下而上查到第五个小穗时，用手指将小穗的内颖和外颖分开，注意不要弄伤小穗。用移液枪吸取10ul制备好的孢子液注入内颖和外颖之间的根部，轻轻闭合保持其自然状态。记号笔标记接种小穗并在小麦杆上挂上标签，记录接种菌株、接种日期、接种人等信息。每个菌株至少接种15个小麦穗；用喷壶向保鲜袋内部喷入水，套到接种的小麦穗上，底下轻轻扎住，25℃光照黑暗交替(16h/18h)保湿培养48h；取下保鲜袋并继续培养14d后，观察小麦穗发病情况，剪下小麦穗拍照并统计每穗发病小穗数。

(4)发病籽粒DON毒素含量测定

冷冻干燥样品过夜，称取0.5g发病籽粒样品，用液氮充分研磨以后完全转移至5ml离心管充分挥发完所有的液氮；加入4ml的乙腈/水(84/16)，于摇床上摇动萃取24h(转速和温度合适就行，没有太大的要求)；取3ml萃取液过柱(3ml塑料小柱，填充500mg C18/中性氧化铝＝1/3)，收集滤液于1.5ml离心管中；转移1ml于1.5ml离心管，50℃干燥过夜；冷冻干燥充分(少量的水都会严重影响后续的硅烷化效果)；加入100μl的TMS(TMSI/TMCS＝100/1)硅烷化试剂，充分涡旋离心管使TMS和管壁的所有样品都接触充分；将离心管放于振荡器上振荡10min，加入800μl的色谱级异辛烷，涡旋离心管使充分混匀，加入超纯水800μl，剧烈涡旋使样品变澄清并分层；静置10min(或者离心12000，2min)，将上清全部转移到GC上样瓶中进行浓度测定。

结果：从菌落性状，菌丝生长、分生孢子产生量、致病性和DON毒素产量六个方面比较带毒菌株JS16与脱毒菌株U3的差异，实验证明病毒FgHV2/JS16影响寄主菌株的菌落性状(见图3)；明显抑制菌丝生长，菌丝生长速度降低16％，菌落直径减少33.1％，生物量降低47.1％(见图4)；对分生孢子的产量降低70.7％(见图5)；对DON毒素产量降低77.4％(见图6)；明显减弱寄主禾谷镰刀菌的致病性，每小麦穗的平均发病小穗减少44.6％(见图7)。

以上所述的实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (4)

1.一种禾谷镰刀菌低毒病毒FgHV2/JS16，其特征在于：其全基因组序列如序列表中SEQID NO:1所示。

2.权利要求1所述的禾谷镰刀菌低毒病毒FgHV2/JS16在减弱禾谷镰刀菌致病性的应用。

3.一种菌株，其含有权利要求1所述的禾谷镰刀菌低毒病毒FgHV2/JS16。

4.根据权利要求3所述的菌株，保藏号CGMCC NO.10323，保藏日期：2015年1月20日。