CN105670938B - 一种毒杀华北大黑鳃金龟的球孢白僵菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种毒杀华北大黑鳃金龟的球孢白僵菌JCF，保藏号为CGMCC No.11338。毒力测试表明，该菌株对华北大黑鳃金龟成虫及幼虫均具有极高的毒力，可以将球孢白僵菌（Beauveria bassiana）JCF制成杀虫剂，用于地下害虫华北大黑鳃金龟的防治，从而降低高毒农药的使用量，提高华北大黑鳃金龟的防治效果，减少环境污染。该菌株应用前景广泛，在农业上可以产生重要的经济效益、生态效益和社会效益。

Description

一种毒杀华北大黑鳃金龟的球孢白僵菌及其应用

技术领域

本发明涉及一种微生物菌株，具体地说是一种球孢白僵菌菌株及其在防治华北大黑鳃金龟中的应用。

背景技术

金龟子是地下害虫中最大的类群，也是危害最重、造成损失最大的种类，是粮田作物、油料作物、果林苗圃、蔬菜及特种作物的重要经济害虫之一。金龟子在我国种类繁多，为害农作物的金龟子种类已记载的有 100 余种，其中华北大黑鳃金龟在我国发生的广泛性和严重性居首位，主要分布在东北、华北、西北等省区，主要为害马铃薯、甘薯、大豆、花生、玉米，草坪、苗圃以及杨、柳、桑、核桃、苹果等林木。

华北大黑鳃金龟成虫咬食植物叶片，使叶片成网状孔洞和缺刻，严重时仅剩主脉，群集为害时更为严重。成虫昼伏夜出，一般在傍晚 6 点至 7 点左右出土，在地面爬行或做短距飞翔，在此过程中交尾取食，晚上 8 点至 9 点达到取食交尾高峰。成虫将卵产在地下，虫卵孵化后进入幼虫阶段，幼虫俗称蛴螬，共分为3龄。幼虫食性很杂且食量大，取食多种植物的种子、果实、根茎等，常造成幼苗枯死，轻则缺苗断垄，重则毁种绝收。但由于幼虫在地下为害，具有隐蔽性和滞后性，防治起来相当困难。

长期以来，对于华北大黑鳃金龟的防治主要依赖于化学农药，比较有代表性的高效中低毒化学农药有毒死蜱、吡虫啉、辛硫磷和丁硫克百威等药剂。这些药剂对金龟子的防治效果较为显著，但长期使用化学农药对金龟子进行防治造成环境污染日趋严重，害虫抗药性提高及产品农药残留等问题也日益加剧，因此采用生物防治等方法治理金龟子是十分必要的。

在我国针对金龟科害虫的生物防治中，研究与应用最多的主要有白僵菌和绿僵菌等昆虫病原真菌，并且对多种金龟害虫的防治也取得了明显成效，但防治对象多局限于金龟幼虫蛴螬，对成虫有效的白僵菌未见报道。另一方面，白僵菌菌株寄生专化性很强，同一菌株对不同科金龟害虫致病力差异明显，对同一种金龟害虫不同虫态的致病力差异也较大。目前，对华北大黑鳃金龟成虫和幼虫同时有效的生防菌株的研究未见报道。

华北大黑鳃金龟成虫在五、六月份交尾，此时在我国北部地区平均温度为15~30℃，适合白僵菌生长发育。每只华北大黑鳃金龟雌虫共可产卵 32-193粒，平均102粒，一旦白僵菌感病致死一只金龟成虫，理论上相当于感染更多的金龟幼虫，同时白僵菌在虫尸上的繁殖在一定程度上可继续侵染下一代害虫。因此，在金龟害虫的综合防控中，对金龟成虫和幼虫同时具有高致病力的菌株可以最大限度的发挥白僵菌的致病作用，对更好地发挥生物农药的作用、减少化学农药用量及降低蛴螬抗药性等均具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种球孢白僵菌菌株，该菌株针对华北大黑鳃金龟幼虫和成虫均具有高毒杀能力，能够应用于华北大黑鳃金龟的生物防治。

本发明所提供新菌株为球孢白僵菌（Beauveria bassiana）JCF，该菌株已于2015年9月8日 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所），保藏编号为CGMCC No. 11338。

2014年河北省农林科学院植物保护研究所在室内饲养华北大黑鳃金龟的过程中，在自然感病成虫上分离纯化得到一株白僵菌菌株，编号为JCF。将JCF菌株接种在SDAY（蛋白胨10 g，酵母10 g，葡萄糖40 g，琼脂15 g，蒸馏水1L，自然pH）平板培养基上，观察菌株生物学特征。结果显示，在SDAY培养基上，菌落初期白色绒状，后变为黄色或浅黄色絮状，背面无色，培养15d左右开始产生分生孢子，产孢细胞单生，产孢时浅黄色，分生孢子呈亚圆形，直径2.0 -3.5 × l.5 - 3.0 µm。从以上特征看，菌株JCF为球孢白僵菌。JCF菌株孢子及菌丝照片如图1所示。

进一步的分析结果表明，与JCF菌株ITS序列最为接近的为球孢白僵菌，其ITS序列同源性为97%，结合JCF菌株的形态学特点，将该菌株鉴定为球孢白僵菌。

在室内采用浸渍法测定JCF菌株对华北大黑鳃金龟幼虫的毒力（表1、2、3）。结果显示：（1）JCF菌株对低龄幼虫的致病力高于高龄幼虫；（2）对于同一龄期的幼虫，随着感染浓度的增高，JCF菌株对幼虫的杀虫活性随之增强；（3）在较高接种浓度下，幼虫5 d后即出现死虫，15 d~20 d达到侵染高峰期。（4）浓度1×10⁸孢子/mL的JCF孢悬液对华北大黑鳃金龟1龄、2龄、3龄幼虫20天的累计死亡率分别为93.3 %, 56.7%，52.4%；5×10⁸孢子/mL的孢悬液对华北大黑鳃金龟2龄、3龄幼虫20天的累计死亡率分别为85.5%，77.9%。

在金龟幼虫的田间防治中主要采用浇灌或沟施的方法，在室内模拟田间浇灌方式测定白僵菌JCF对华北大黑鳃金龟幼虫的毒力（表4），由于土壤的稀释作用，同时虫体粘附菌体需要一定的时间，施菌后第10天，JCF菌株对2龄、3龄幼虫的致死率仅为52.3%、22.5%，15 d后2龄、3龄幼虫的累计死亡率分别为71.5%、40.0%，25d后对2龄、3龄幼虫的致死率分别为92.5%、89.5%。从长期效果来看，JCF菌株对华北大黑鳃金龟幼虫的致病效果明显。

应用JCF菌株对华北大黑鳃金龟成虫进行毒力测试。结果（表6）显示，在室内恒温条件下，JCF菌株对华北大黑鳃金龟成虫的杀虫活性高于幼虫，且侵染时间短。1×10⁸孢子/mL浓度下，施菌第8 d后，金龟成虫的累计死亡率即达到86.7%。室内自然变温条件下（室内罩笼试验）（表7）第10 d成虫的累计死亡率在90%以上。田间罩笼10 d后（表8），成虫的累计死亡率为70.6%。表明JCF菌株对华北大黑鳃金龟成虫有较强的致病力，说明该菌株可作为生产性菌株应用于防治华北大黑鳃金龟。图2 为JCF菌株感染的华北大黑鳃金龟幼虫及成虫。

上述毒力测试表明，JCF菌株对鞘翅目金龟科害虫华北大黑鳃金龟成虫和幼虫均具有较高的杀虫活性，因而，可以将本发明球孢白僵菌JCF制成杀虫剂，用于华北大黑鳃金龟的防治，从而降低化学农药的使用量，减少环境污染，具有重要的经济价值和应用前景。

附图说明

图1 为JCF菌株分生孢子；

图2 为JCF菌株菌丝；

图3为JCF菌株菌落；

图4为JCF侵染的2龄金龟幼虫；

图5为JCF侵染的3龄金龟幼虫；

图6为JCF侵染的金龟成虫。

具体实施方式

实施例1：JCF菌株获取的工作流程

自然感病僵虫→直接分离纯化菌株→接种华北大黑鳃金龟测定杀虫毒力→获得高毒力菌株JCF→菌株形态、孢子形态、鉴定→提取菌株DNA，以真菌ITS序列通用引物扩增菌株DNA，将获得的扩增序列测序并在GenBank中对比→确定菌株JCF为球孢白僵菌。

实施例2：JCF菌株的筛选分离过程

2014年河北省农林科学院植物保护研究所在饲养华北大黑鳃金龟过程中，发现自然感病死亡、体表具白色菌丝的金龟成虫，保湿处理后，感病成虫体表产生淡黄色孢子，经分离纯化得到一株白僵菌，编号为JCF。后将孢子接种在SDAY（蛋白胨10 g，酵母10 g，葡萄糖40 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，自然pH）平板培养基上培养至产生分生孢子，收集分生孢子，冷冻干燥后4℃备用。

实施例3：菌株培养及孢悬液配制

将JCF菌株接种于SDAY平板培养基上，26±1℃恒温光照（12L∶12D）培养，孢子成熟后，收集孢子并置于装有玻璃珠的0.02% (v/v) 吐温-80水溶液中，振荡搅拌约30 min，待孢子完全均匀打散后经4层纱布过滤，获得纯孢子悬浮液，血球计数板计数并配制成梯度浓度的孢悬液，用于致病力测定。

实施例4：JCF菌株对华北大黑鳃金龟幼虫的杀虫活性

将试虫置于不同浓度的菌悬液中5s，用滤纸吸干多于水分。所有处理接入健康、大小一致的华北大黑鳃金龟幼虫，单头置于指形管中，指形管中放过筛细土，湿度为18~20%，土豆块或土豆丝为饲料，27℃饲养，每处理20头幼虫，3次重复，以0.02％（V/V）吐温-80水悬液处理作为对照，定期检查死虫数，计算死亡率。

从表1、2、3中可以看出，JCF菌株对华北大黑鳃金龟幼虫有较高毒力，表现为（1）对低龄幼虫的致病力高于高龄幼虫；（2）随着感染浓度的增高，JCF菌株对幼虫的杀虫活性随之增强；（3）在较高浓度下，接种JCF菌株5 d后即出现死虫，15 d左右达到侵染高峰期。浓度1×10⁸孢子/mL的孢悬液对华北大黑鳃金龟1龄、2龄、3龄幼虫20天的累计死亡率分别为93.3 %、56.7%，52.4%；5×10⁸孢子/mL的孢悬液对华北大黑鳃金龟2龄、3龄幼虫20天的累计死亡率分别为85.5%、77.9%。

模拟田间浇灌方式采用盆土法（表4），在花盆（直径19cm×高15cm）内接入幼虫，每盆接入10头幼虫，放入干土，每处理3次重复，以土豆块为饲料，将JCF菌悬液均匀倒在土表，保持土壤湿度，置于室温下，测定JCF菌株对大黑鳃金龟幼虫的杀虫活性。结果表明，施菌10d后JCF菌株对2龄、3龄幼虫累计死亡率分别为52.3%、22.5%。15d 后2龄、3龄幼虫的累计死亡率分为71.5%、40.0%，25d后2龄、3龄幼虫累计死亡率分别为92.5%、89.5%。

表1 JCF菌株对1龄华北大黑鳃金龟幼虫的杀虫活性

表2 JCF菌株对2龄华北大黑鳃金龟幼虫的杀虫活性

表3 JCF菌株对3龄华北大黑鳃金龟幼虫的杀虫活性

表4 盆土法测定JCF菌株对华北大黑鳃金龟幼虫的杀虫活性

实施例5：JCF菌株对华北大黑鳃金龟成虫的杀虫活性

室内恒温条件下：将塑料盒（10cm×15cm）用次氯酸钠100倍液浸泡1 h，晾干后放湿润土，土层厚5-6cm，将新鲜榆叶插在土中作为成虫的饲料。挑取大小一致、健康活泼的大黑鳃金龟成虫，将不同浓度的JCF孢悬液喷洒试虫体表，并用滤纸吸去多于水分，以 0.02％（V/V）吐温-80水悬液处理作为对照，置于26±1℃、光周期12 L：12 D条件下饲养。每处理10头试虫，设5次重复，施药后定期调查死亡虫数，每天更换补充新鲜榆叶。结果（表6）显示，在恒温条件下，JCF菌株对华北大黑鳃金龟成虫的杀虫活性高于幼虫，侵染时间短，1×10⁸孢子/mL浓度下，侵染第8 d，成虫的累计死亡率即达到86.7%。

表6 JCF菌株对华北大黑鳃金龟成虫的杀虫活性

室内变温条件下活性测定（室内罩笼）：养虫笼为60cm×40 cm×10 cm的铁皮盒，内装6cm过筛湿土（土壤含水量18-20%），上罩高30 cm的尼龙网纱，将经JCF孢悬液浸渍处理的成虫40头放入笼内，以新鲜榆叶或玉米苗为饲料，每天更换补充饲料。施药后第10 d调查死亡虫数，统计死亡率。室内自然变温条件下（室内罩笼试验）（表7）第10 d成虫的累计死亡率在90%以上。

表7 室内罩笼测定JCF菌株对华北大黑鳃金龟成虫的杀虫活性

田间条件下活性测定（田间罩笼）：在田间种植花生，株高20cm以上时进行田间罩笼试验。在接种金龟成虫前将花生田浇水，保证土壤湿度。选健壮的2穴花生苗，按照尼龙网的长度和宽度，在周围挖5cm深土槽，用高30 cm的尼龙网笼罩住花生苗，周围用土填平土槽，在傍晚8点左右接种经JCF孢悬液浸渍处理的金龟成虫40头，花生苗取食完后及时补充新鲜榆叶。施药10 d后调查各处理死虫数。田间罩笼10 d后（表8），成虫的累计死亡率为70.6%。表明JCF菌株对华北大黑鳃金龟成虫有强的致病力，说明该菌株可作为生产性菌株应用于防治华北大黑鳃金龟。

表8 田间罩笼测定JCF菌株对华北大黑鳃金龟成虫的杀虫活性

处理	死亡率/%	僵虫率/%
			JCF(1×10<sup>8</sup>孢子/mL)	70.6	97.4
CK	22.2	0

实施例6：JCF菌株的ITS序列扩增与序列测定

在铺有灭菌玻璃纸的SDAY培养基上刮取JCF菌丝体放入研钵中，加液氮后研磨成粉末，转移到10 mL的离心管中，加入1 mL的DNA抽提液[0.1g/2mL，抽提液配方：Tris-HCl（pH 7.5）0.2 mol/L，NaCl 0.5mol/L，SDS 1%，漩涡振荡混匀，加入200 μL Tris饱和酚，65℃水浴30min，每隔5-10 min混匀一次；变凉之后，加入1 mL的酚:氯仿:异戊醇（体积比25:24:1），轻摇混匀，12000r/min，4℃离心5 min；重复一次上面步骤；将上清液转移到一新离心管，向该离心管中加入2.5倍体积的无水乙醇，-20℃放30 min，12000 r/min离心10 min收集沉淀，75 %酒精冲洗，超净台吹风干燥，加入适量的TE溶解沉淀即得到DNA。加入3 μL的RNA酶，37℃水浴1 h；加500 mLddH₂O，加入400 μL氯仿/异戊醇（24:1），12000 r/min离心10min，取上清，重复两次。重复上面的步骤，沉淀DNA，溶于30 μl TE中，-20℃保存，备用。

所用引物为真菌ITS区通用引物（正向引物ITS-4：

5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′，反向引物 ITS-5：

5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′），由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR 扩增的 50 μL 反应体系包括：40 μL无菌水，1 μL DNA模板，5 μL 10×PCR Buffer，0.5 μL Taq DNA聚合酶（5 U/L），1 μL10mmol/mL dNTP，1.5 μL10 mmol/mL ITS-4，1.5 μL10 mmol/L ITS-5。PCR 反应条件：95 ℃4 min，94 ℃1 min，54℃1 min，72℃2 min，35个循环，72℃延伸2 min。PCR产物3 μL，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。北京华大基因完成测序。测序后，将 与 Genebank 数据库中的相关菌株进行同源性BLAST比对。

ITS序列如SEQ ID NO：1所示。

对所测得的ITS序列与GenBank中已知序列对比，结果表明，与该菌株ITS序列最为接近的为球孢白僵菌，其ITS序列同源性为97%，结合JCF菌株的形态学特点，将该菌株鉴定为球孢白僵菌。

序列表

<110> 河北省农林科学院植物保护研究所

<120>一种毒杀华北大黑鳃金龟的球孢白僵菌及其应用

<160> 1

<210> 1

<211> 595

<212> DNA

<213> 球孢白僵菌（Beauveria bassiana）

<400> 1

ggaagtaaaa gtcgtaacaa ggtctccgtt ggtgaaccag cggagggatc attaccgagt 60

tttcaactcc caaaccctta tgtggaccta cctactgttg cttcggcgga ctcgccccag 120

ccggacgcgg acctggacca ggcggccgcc ggagacccat aaactcttgt attatcagca 180

tcttctgaat ccgccgcaag gcaaaacaaa caaatcaaaa ctttcaacaa cggatctctt 240

ggctctggca tcgatgaaga acgcagcgaa atgcgataag taatgtgaat tgcagaatcc 300

agtgaatcat cgaatctttg aacgcacatt gcgcccgcca gcattctggc gggcatgcct 360

gttcgagcgt catttcaacc ctcgacttcc ctttggggag gtcggcgttg gggaccggca 420

gcacaccgcc ggccctgaaa tggagtggcg gcccgtccgc ggcgacctct gcgtagtaat 480

ccaactcgca ccggaacccc gacgtggcca cgccgtaaaa cacccaactt ctgaacgttg 540

acctcgaatc aggtaggact acccgctgaa cttaagcata tcaataagcg gagga 595

Claims (3)

1.球孢白僵菌（Beauveria bassiana）JCF，保藏号为 CGMCC No. 11338。

2.含有权利要求1所述菌株的微生物杀虫剂。

3.权利要求1所述菌株或权利要求2所述微生物杀虫剂在农业害虫防治中的应用，所述害虫为华北大黑鳃金龟。