CN107365710B - 一株对榛实象甲具有强致病力的绿僵菌菌株及其应用 - Google Patents

一株对榛实象甲具有强致病力的绿僵菌菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一株对榛实象甲具有强致病力的绿僵菌菌株及其应用。本发明所提供的绿僵菌菌株为金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae CoCn01)，已于2016年4月12日通过专利保藏方式保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.12167。该菌株生长速度快、产孢能力强，本发明是初次从榛实象甲(Curculio nucum)自然死亡的成虫尸体上分离获得，其培养方法比较简单，繁殖速度快，对榛实象甲成虫和幼虫均具有强致病力，对人畜无害、对环境无污染、害虫不易产生抗药性，可以广泛地用于榛实象甲的防治，是一株在榛实象甲防治上具有超高应用价值的生物防治菌株。

Description

一株对榛实象甲具有强致病力的绿僵菌菌株及其应用
技术领域
本发明属于生物防治领域，涉及一种绿僵菌菌株及其应用，具体地说涉及一株对榛实象甲具有强致病力的绿僵菌菌株及其应用。
背景技术
榛属于榛科(Corylacea)榛属(Corylus L.)植物，是世界四大干果(扁桃、核桃、榛子、腰果)之一，综合利用价值很高，栽培榛子良种或利用其野生资源，对于发展山区经济、增加农民收入具有重要意义。我国榛林面积约100万公顷，居世界第一，但产量水平与国外有巨大差距。意大利榛子平均产量为1550kg/hm2，约为我国平均单产的2.5～9.0倍。东北是榛子的传统主产区，因低产导致的低收益问题相当普遍，且日益突出，严重阻碍了东北榛子产业的可持续发展。
我国首发林业危险性有害生物名单中，昆虫及螨类共156种，就包括引起榛子产量损失的主要害虫榛实象甲(象鼻虫)。包括土耳其、意大利、西班牙、美国、中国在内的绝大多数榛子产国，榛实象甲(C.nucum)是危害榛子果实、导致严重产量损失的首要榛子害虫。榛实象甲成虫以榛叶为食，其中，雌虫主要以花和早期幼果为食。榛实象甲对叶片的危害并不严重，但对花与果实的危害很大，在早春可导致花与幼果的脱落。幼虫蛀入果实后，将蛀食部分或全部榛仁，并将粪便排在果内，引起榛子产量的巨大损失。在我国，绝大多数榛园都受榛实象甲的危害，轻则引起榛园减产，重则可导致果园绝收。由此可见，研发有效控制榛实象甲的防治技术措施，是目前我国榛子产业发展过程中亟需解决的问题。
榛子采收前，榛实象甲幼虫从蛀食的虫果中脱离，进入土壤化蛹，2～3年后才羽化形成成虫进行新一轮危害。我国目前榛实象甲的防治方式主要是化防，但是，果实中的榛实象甲幼虫受榛子坚硬果壳的保护，防治效果差，而针对榛子果簇进行反复化防，不仅大量增加榛子栽培生产的成本，新的“药果”问题还严重打击传统消费人群的信心，引起榛子消费市场的萎缩。绿僵菌是目前应用最为广泛的杀虫真菌之一，具有寄主范围广、致病力强，杀虫效果明显，环保无污染、不易产生抗药性等特点，在农林害虫的防治上应用十分广泛。然而，绿僵菌寄主范围虽广，但其靶向性较强，对不同害虫的致病力差异十分显著。目前，国内外均缺乏榛实象甲的强致病力菌株。可见，筛选获得榛实象甲的强致病力菌株是对其进行有效生物防治的关键。
发明内容
本发明的目的是要提供一株对榛实象甲具有强致病力的绿僵菌菌株(Metarhizium anisopliae CoCn01)及其应用，并在榛园中进行了应用，旨在为榛实象甲的生物防治提供关键菌株，避免多年来常规化学防治带来的食品和环境安全问题。
本发明是这样实现的，一株对榛实象甲具有强致病力的金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae CoCn01)，已于2016年4月12日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.12167，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的主要目的是要提供上述绿僵菌菌株CoCn01在防治榛实象甲上的应用。本发明于2015年五月中下旬，在吉林省四平市进行榛园虫情调查时发现绿僵菌在榛实象甲中流行，导致大量榛实象甲成虫死亡。因此，该菌株是目前国内首次发现的可寄生榛实象甲且流行性很强的虫生真菌，在防治榛实象甲方面具有广阔的开发应用前景。
本发明从感病的榛实象甲成虫尸体上分离获得绿僵菌菌株，将野生菌株回接于健康的榛实象甲成虫和幼虫的虫体表面，致榛实象甲感病死亡，尸体表面布满白色菌丝层和绿色粉状的孢子后，从榛实象甲中再次分离、纯化绿僵菌。绿僵菌经复壮后，筛选获得具有强致病力的菌株CoCn01。其培养初期菌落绒毛状，白色，菌落中间逐渐向外生出丛状的黄绿色分生孢子堆，周围为分散型的白色菌丝。在光学显微镜下观察，菌丝具分隔、分枝且透明；分生孢子梗单生，分生孢子梗顶端具4～6个紧密排列的柱形产孢细胞，大小幅度为5.4～9.2μm×1.5～2.8μm。每个产孢细胞顶端均着生着50～80个分生孢子组成的分生孢子链，单个分生孢子无色，柱形两端钝圆，大小为4.5～6.8μm×1.8～2.9μm。
相对于现有的缺点和不足，本发明具有以下有益效果：本发明是初次从感病的榛实象甲成虫尸体上分离得到的菌株，该菌株特异性强，培养比较简单，生长速度快，产孢量大，孢子萌发率高。其分生孢子对榛实象甲幼虫和成虫的 致病力均较强，环境友好、不易产生抗药性，可以广泛地应用于榛实象甲的生物防治。
具体实施方式：
为了使本发明的目的更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。通过从虫生真菌侵染后致死的榛实象甲僵虫体内分离纯化致病菌，并对其进行形态观察，结合分子鉴定，确定致病菌的种类。
实施例1：病原菌的分离、鉴定
1.1材料
在吉林省四平市，6月上旬于榛实象甲感病园区收集被虫生真菌侵染后致死的榛实象甲成虫尸体用于致病菌的初期分离与纯化。
1.2榛实象甲致病微生物的分离与纯化
选取虫体表面布满白色菌丝层和绿色粉状孢子的榛实象甲僵虫，在超净工作台上用无菌水冲洗2次，然后用无菌吸水纸吸干表面水份。75％体积浓度的乙醇浸泡榛实象甲尸体30s，无菌水冲洗3遍，切取虫体腹部中间部位的组织块接种于PDA培养基中，组织块直径约2mm。PDA培养基配方如下：去皮马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15～20g、蒸馏水1000mL，自然pH。
每个含有PDA培养基的培养皿中接种1个榛实象甲组织块，接种的培养皿放置于恒温箱中黑暗静置培养，培养温度28℃。定期观察菌落生长情况。
1.3菌株的纯化与保存
观察比较培养皿中菌落的生长情况及菌落外观形态特征，将形态特征明显不同或者颜色有差异的菌落挑选分离出来，将其接入新的PDA培养基中，进行重新培养，并初步以阿拉伯数字进行简单编号以作区别，重复以上步骤3～4次，直到同一个培养皿中不再重复出现2种不同的菌株，2个培养皿不再出现相同菌株为止。将所获得的所有菌株回接到健康的榛实象甲幼虫上，结果发现有1个菌株可以引起健康榛实象甲幼虫的快速死亡，幼虫感染绿僵菌初期，体表上出现黑色的斑点，且大多数黑斑出现于虫体的毛孔处。从感染该菌株的榛实象甲尸体中重新分离纯化致病菌，所获得的纯培养菌株培养5～7天后，产 生大量分生孢子，收集分生孢子，用无菌水稀释至终浓度108孢子/mL，用小型喷雾器均匀榛实象甲成虫体表(以虫体表面湿润为度)，培养于相对湿度80％的培养箱中。重复以上分离纯化、侵染过程2～3次，得到复壮的、致病力强的菌株CoCn01。所获得的高毒力菌株转接到新鲜PDA斜面培养基上，然后在4℃条件下进行保存。
1.4菌株的鉴定
根据所分离菌株纯培养的菌落特征、菌丝和分生孢子的形态特征进行鉴定。实验结果表明：从被虫生真菌自然侵染的榛实象甲成虫虫体上分离所获得的菌株，在PDA培养基上获得纯培养，按照科赫法则，对该菌种进行复壮和分离纯化，得到菌株的纯培养，即绿僵菌(Metarhizium anisopliae CoCn01)。其菌落特征为：其培养初期菌落绒毛状，白色，菌落中间逐渐向外生出丛状的黄绿色分生孢子堆，周围为分散型的白色菌丝。在光学显微镜下观察，菌丝具分隔、分枝且透明；分生孢子梗单生，分生孢子梗顶端具4～6个紧密排列的柱形产孢细胞，大小为5.4～9.2μm×1.5～2.8μm。每个产孢细胞顶端均着生着50～80个分生孢子组成的分生孢子链，单个分生孢子无色，柱形两端钝圆，大小为4.5～6.8μm×1.8～2.9μm。根据榛实象甲的感染症状，菌落和菌体特征，分析该菌株为金龟子绿僵菌的变种。
实施例2：菌株的分子鉴定
2.1真菌基因组DNA提取
用北京艾德莱生物科技有限公司生产的基因组DNA快速提取试剂盒提取绿僵菌(Metarhizium anisopliae CoCn01)基因组DNA，利用SimpliNano微量分光光度计检测DNA的浓度、纯度与完整性。
2.2 PCR反应体系
核糖体DNA的ITS区域的核苷酸通用引物由大连宝生物生物技术有限公司合成，引物系列为：ITS1 5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′，ITS4 5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。20μLPCR反应体系：10μM的引物ITS1和ITS4各1.0μL，10×PCR Buffer 2.0μL，Mg2+(2.5mmol/L)1.0μL，dNTP(10mmol/L)1.0μL，5UμL-1的Taq DNA聚合酶0.25μL，ddH2O补 齐到20μL。PCR扩增条件为：94℃预变性4min，1个循环；94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸2min，共30个循环；72℃延伸10min，1个循环；4℃降温10min，1个循环。PCR反应完成后，将反应产物放置于4℃条件下保存。用0.8％的琼脂糖凝胶电泳检测反应产物浓度及PCR扩增片段大小。用大连宝生物的DNA产物回收试剂盒进行PCR产物的回收。
2.3分子测序与菌种鉴定
回收后的PCR产物送上海生工生物技术有限公司进行测序。所得的核苷酸序列与GenBank已注册的基因序列进行同源性比较，以相似性99％及以上为标准，进行菌种的分子鉴定。
2.4研究结果
以菌株CoCn01基因组DNA为模板，用特异性引物ITS1和ITS4进行PCR扩增，获得了片段长度为532bp的扩增产物。该序列测序结果表明其与GenBank中的绿僵菌菌株Metarhizium anisopliae var.lepidiotum菌株(EF484924.1和DQ177432.1)的同源性为99％，推断该菌株为绿僵菌的变种。
实施例3:菌株的毒力测试
3.1真菌孢子悬浮液制备
供试的菌株共有三种：上述的绿僵菌菌株CoCn01，中国微生物菌种保存中心保存的金龟子绿僵菌菌株3.7986、中国微生物菌种保存中心保存的杀蝗绿僵菌菌株3.4607。分别接种于PDA培养基中，28℃恒温培养10天，刮取其分生孢子，无菌水稀释成1.0×108孢子/mL的孢子悬液。
3.2室内毒力测定
采用浸泡法进行毒力测定试验。于2014年8月20号，榛实象甲幼虫入土前，收集榛实象甲幼虫约1200余头，每个菌株为1个处理，以蒸馏水为对照，共计4个处理；每个处理约100头，重复3次。取上述菌株的孢子悬液或蒸馏水，将榛实象甲幼虫浸泡其中10s后，转置于培养皿中保温培养。培养温度为25℃，相对湿度60％，光照周期为12小时黑暗，12小时照光。每天观察并记录榛实象甲幼虫死亡情况。
3.3结果
菌株CoCn01处理后榛实象甲幼虫累积死亡率变化如表1所示。菌株CoCn01浸泡处理后，榛实象甲幼虫于处理后3天开始出现死亡，处理后的第7天死亡率约为49％，第11天达到94.6％，同时大量菌丝和分生孢子从虫体关节部位长出，第15天全部死亡。对照处理的榛实象甲幼虫在处理后的第15天死亡率仅为3.6％。中国微生物菌种保存中心保存的金龟子绿僵菌菌株3.7986、中国微生物菌种保存中心保存的杀蝗绿僵菌菌株3.4607在11d时的致死率分别为46.2％和38.6％，这两种菌株在第15d的对榛实象甲虫的致死率分别为52.7％和42.8％。可见，绿僵菌(Metarhizium anisopliae CoCn01)对榛实象甲幼虫的毒杀效果显著高于其它绿僵菌菌株，在榛实象甲的生物防治中可能起到重要作用。
表1不同绿僵菌菌株处理后榛实象甲幼虫累积死亡率的变化
Figure DEST_PATH_GDA0001081296980000061
注：同列数据中的不同小写字母表示在P<0.05水平上差异显著。
实施例4：菌株的应用
榛实象甲发生面广,生活史长而复杂,世代重叠交替发生。在吉林一般两年发生一代，以老熟幼虫在土中越冬。每年5月中下旬成虫出土，取食嫩枝、嫩叶，5月-6月为榛实像甲成虫交尾产卵高峰期。6-7月孵化幼虫，8月下旬榛实象甲幼虫离开榛果入土过冬。因此绿僵菌菌株在防治榛实象甲幼虫、成虫的应用有两个关键时期，一个是8月下旬，榛实象甲幼虫入土前，直接将绿僵菌CoCn01孢子粉喷洒于地面用于榛实象甲幼虫的防治；另一个是5月中下旬，榛实象甲成虫取食交尾高峰期进行全树喷施含绿僵菌菌株的杀虫剂用于榛实象甲成虫的防治。

Claims (5)

1.一株对榛实象甲具有强致病力的绿僵菌菌株，其特征在于：所述菌株为金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)CoCn01，该菌株已于2016年4月12日通过专利保藏方式保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.12167。
2.一种真菌杀虫剂，其特征在于：所述的真菌杀虫剂含有权利要求1所述的绿僵菌CoCn01菌株。
3.如权利要求1所述的绿僵菌菌株在防治榛实象甲幼虫、成虫的应用。
4.如权利要求3所述的绿僵菌菌株在防治榛实象甲幼虫、成虫的应用，其特征在于：于8月下旬，榛实象甲幼虫入土前，直接将绿僵菌CoCn01孢子粉喷洒于地面。
5.如权利要求3所述的绿僵菌菌株在防治榛实象甲幼虫、成虫的应用，其特征在于：于5月中下旬，榛实象甲成虫取食交尾高峰期进行全树喷施含绿僵菌菌株的杀虫剂。
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