CN104560740A - 一株防治油茶象幼虫的金龟子绿僵菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一株防治油茶象幼虫的金龟子绿僵菌及其应用。发明所提供的金龟子绿僵菌菌株命名为金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）FJMa201101，已于2014年10月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9780。该菌株生长速度快、产孢能力强，同时对油茶象幼虫的致病力高，以107孢子/mL的孢子悬浮液接种后对油茶象幼虫的LT50（致死中时）为1.65天。利用该菌株生产的真菌制剂，对油茶象的防治效果好，能有效控制油茶象种群密度，是一株在油茶象的防治上具有潜在价值的生防菌株，对促进油茶优质丰产具有积极意义。
Description
技术领域
本发明属于生物防治领域，涉及一株绿僵菌菌株及其应用，具体地说是涉及一株对油茶象幼虫具有高致病力的金龟子绿僵菌及其应用。
背景技术
油茶（Oil-tea Camellia）是我国特有的木本食用油料树种，主要分布在长江流域及其以南的14个省(市、区)。油茶象Curculio chinensis Chevrolat又名茶籽象甲、油茶中华实象，隶属于象虫科象甲属，是危害油茶果实最为严重的一种害虫，也是全国林业危险性有害生物（国家林业局，2013）。该虫幼虫在果内蛀食果仁，使茶籽严重减产，并且影响茶油品质。据调查，油茶象危害后落果率可达到69.2%。油茶作为食用油料树种，探寻害虫生物防治，尽量少用或避免使用化学农药已成为生产上的迫切需要。
绿僵菌属虫生真菌，目前已知能寄生8个目42个科的200多种昆虫，以及螨类和线虫等。绿僵菌具有适应性强、在土壤中和林间能长期宿存、致病周期短、对人畜无毒害以及对环境友好等特点。金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）是应用最为广泛的绿僵菌种类，据不完全统计，近年来世界各地用金龟子绿僵菌对近百种森林、农作物及卫生害虫进行了防治试验；特别是作为一种防治地下害虫较为有效的真菌杀虫剂，其在防治中已有应用实践，取得了良好的效果。油茶象虽然是蛀果害虫，但其老熟幼虫出果后在土壤中滞育时间长达一年以上直至化蛹羽化为成虫出土。据检索，目前利用虫生真菌防治油茶象幼虫的研究尚未见报道，为此，筛选出对其幼虫致病力强的金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）菌株，为生产上提供优良菌株和菌剂具有重要的现实意义。
发明内容
本发明的目的是提供一株对油茶象幼虫具有高致病力的金龟子绿僵菌菌株及其应用。
一株金龟子绿僵菌，命名为金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）FJMa201101菌株，已于2014年10月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(China General
Microbiological Culture Collection Center, CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏编号：CGMCC No.9780。
该金龟子绿僵菌菌株（Metarhizium anisopliae）FJMa201101具有以下特征：
在PPDA培养基上25±1℃下生长5天，菌落直径18 mm，15天达58mm。菌落初期为白色，质地绒毛状或棉絮状，逐渐扩大；其上产生暗绿色分生孢子并成环状分布，粉末状。菌丝分枝，有格，无色光滑，宽2.3μm~3.2μm，分生孢子梗单生或分枝，分枝顶端具2~5个柱状的产孢细胞，其上产生向基式的分生孢子链。分生孢子单细胞，长椭圆形，表面光滑，大小为4.5~6.8μm×1.8-2.9μm。最佳生长温度范围为23~28℃。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供用于防治油茶象幼虫的菌株和菌剂。
本发明所提供的菌剂具体可分为分生孢子悬浮液或孢子粉剂。其中孢子悬浮液的浓度为107孢子/ml。分生孢子粉剂含量为60~80亿孢子/克菌剂。
本发明所提供菌剂的有效成分是上述金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）FJMa201101的分生孢子。
本发明所提供的或所述菌剂可用于防治油茶象幼虫。
本发明提供的金龟子绿僵菌菌株（Metarhizium anisopliae）FJMa201101具有如下有益效果：
生产性状好，产孢能力强，同时对油茶象幼虫的致病力强，采用浓度为107孢子/ml的孢子悬浮液浸渍法接种其LT50为1.65 d，感染率为86.6%；采用孢子拌土法（接种量为105孢子/g土）LT50为2.11d，感染率为94.5%。利用该菌株生产的菌剂，能显著降低油茶象幼虫林间种群数量。同时该菌株能在土壤中长期宿存，具有较强的二次侵染能力，适合在亚热带地区的油茶象发生林分中应用。
本发明的优点在于：为油茶象幼虫防治提供了高致病力菌株和菌剂；同时绿僵菌具有在土壤中和林间能长期宿存、对人畜无毒害以及对环境友好等特点，本发明的高效金龟子绿僵菌菌株和菌剂可解决以往油茶象采用化学防治带来的环境污染、农药残留等问题。本发明具有良好的应用前景。
附图说明
图1 为金龟子绿僵菌FJMa201101菌株在PPDA培养基上25±1℃下培养15天的菌落形态图。
图2为油茶象幼虫被金龟子绿僵菌FJMa201101感染症状。
具体实施方式
以下结合具体实施例，对本发明的具体实施方式进行详细描述，这些实施例用于理解而不是限制本发明的范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试剂、材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
下述实施例中的PPDA培养基是指蛋白胨马铃薯葡萄糖琼脂培养基的英文缩写，其具体配方为每1000ml水中含有马铃薯200g（切块煮熟后过滤，取滤液），葡萄糖20g，蛋白胨10g，琼脂20g。
实施例1
金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）FJMa201101的鉴定
形态学鉴定
将分离纯化的金龟子绿僵菌菌株在直径为90mm的平板PPDA培养基上于25±1℃条件下培养，4-5天后挑取白色菌丝制片在显微镜下观察菌株的菌丝和分生孢子梗形态；10-12天后挑取成熟分生孢子制片观察分生孢子的形态与大小。15天左右观察记录菌落形态特征。该菌株菌落质地棉絮状，菌落初期为白色，逐渐扩大，其上产生暗绿色分生孢子并成环状分布。菌丝分枝，有格，无色光滑，宽2.3μm~3.2μm，分生孢子梗单生或分枝，分枝顶端具2~5个柱状的产孢细胞，其上产生向基式的分生孢子链。分生孢子单细胞，长椭圆形，表面光滑，大小为4.5~6.8μm×1.8-2.9μm。
菌株的ITS序列扩增、序列测定及分子鉴定
利用金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）FJMa201101菌株的菌丝体提取总DNA，然后以所提取的DNA为模板，以真菌ITS区通用引物ITS-4和ITS-5（由上海生工生物工程股份有限公司合成）进行PCR扩增，2×Taq PCR MasterMix（含染料） 12.5µL；引物ITS4/ITS5 (10 µmol/L)各1µL；ddH2O 9.5µL；模板DNA
1µL。PCR反应程序：95℃预变性4min，94℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸40s，进行35个循环，最后72℃延伸7min，用无菌水代替模板作阴性对照。PCR产物经过电泳条带检测后确认样品DNA -ITS区域PCR扩增产物符合测序要求后，将PCR扩增产物进行连接、转化之后，送至铂尚生物技术（上海）有限公司进行序列测定。将测序结果与美国国立生物技术信息中心（NCBI）基因数据库的绿僵菌菌株序列进行比对。
扩增引物序列：
ITS4: 5'-TCCT CCGC TTAT TGAT ATGC-3' 。
ITS5：5'-GGAA GTAA AAGT CGTA ACAAGG-3' 。
本发明金龟子绿僵菌菌株的ITS的序列如SEQ ID NO.3所示，通过NCBI/blast比对后发现与金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）（FJ545320.1）同源性最高，达99.83%，可以确认该菌株为金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）。
金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）FJMa201101已于2014年10月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC），登记入册编号为CGMCC No.9780。
实施例2
金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）FJMa201101
的生物学特性
用点滴法将金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）FJMa201101接种于PPDA平板培养基中央，置于25±1℃培养箱中培养，用十字交叉法每天测量1次菌落直径，每处理设3个平板（重复），共观察15d。同时记录开始产孢时间，第15d（产孢基本结束）用直径为1.5cm的打孔器，于菌落中心至边缘1/2处打取小菌碟，取出菌碟置于含30 mL的0.3‰吐温-80无菌水的锥形瓶内，振荡使孢子充分分散并适当稀释，血球计数板测定孢子浓度并换算成单位面积的产孢量。每个平板重复测定3次，取其平均值作为1个重复的孢子数。
表1 金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）FJMa201101
生物学特性
由表1可见，金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）FJMa201101菌落生长较快，5天菌落直径为18mm，15天菌落直径达58mm，生长3天后菌落上开始出现绿色孢子，产孢量为1.13×108孢子/cm2。
实施例3
采用浸渍法接种时金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）FJMa201101
对油茶象幼虫的致病力测定
从PPDA平板上刮取一定量金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）FJMa201101
孢子置于灭菌的0.3‰ 吐温-80溶液中，配制成107孢子/mL的孢子悬浮液（该悬浮液即为金龟子绿僵菌FJMa201101菌剂）；将健康的油茶象幼虫在孢悬液中浸渍10s，然后重新放入养虫盒内已灭过菌的土壤中，接种30头油茶象幼虫，重复3次；以浸渍0.3‰吐温-80无菌水溶液处理作为对照。处理后将养虫盒放置于黑暗的25±1℃恒温培养箱中，每天观察记载油茶象幼虫死亡情况，死虫保湿培养观察菌丝生长及产孢情况（虫尸上长出肉眼可见的菌丝及孢子），并挑片在显微镜下观察是否为绿僵菌感染致死，统计死亡率及感染率（僵虫率）。
采用107孢子/mL的孢子悬浮液接种油茶象幼虫5天后，油茶象幼虫死亡率达100%，死亡高峰在1~3天。对照组12天后死亡率为6.7%。死亡的幼虫经保湿培养后发现，感染率为86.6%。对照组未出现感染。 孢子悬浮液浸渍法接种后，金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）FJMa201101对油茶象幼虫的致死中时为1.65天。
表2 油茶象幼虫浸渍法接种金龟子绿僵菌FJMa201101后累计死亡率
表3 浸渍法接种后金龟子绿僵菌FJMa201101
对油茶象幼虫致病力
实施例4
采用孢子拌土法接种时金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）FJMa201101
对油茶象幼虫的致病力测定
取金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）FJMa201101
粉剂，含量为80亿孢子/g菌剂，与采集于油茶林灭过菌的土壤混合均匀，配制成浓度为105孢子/g土的带菌土壤置于养虫盒中，将健康的油茶象幼虫小心置于带菌土壤中，然后将养虫盒置于黑暗的25±1℃恒温培养箱中，每天观察记载油茶象幼虫死亡情况，虫尸处理方法同浸渍法。每盒放置30头幼虫，3个养虫盒作为一个处理，每处理做3个重复。
采用105孢子/g土的带菌土壤接种油茶象幼虫6天后，油茶象幼虫死亡率达100%，死亡高峰在1~4天。对照组8天后死亡率为6.7%。死亡的幼虫经保湿培养后发现，感染率为94.5%。对照组未出现感染。孢子拌土法接种后，金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）FJMa201101对油茶象幼虫的致死中时为2.11天。
表4 油茶象幼虫孢子拌土法接种金龟子绿僵菌FJMa201101后累计死亡率
表5 孢子拌土法接种后金龟子绿僵菌FJMa201101
对油茶象幼虫致病力
实施例5
金龟子绿僵菌FJMa201101菌株林间防治油茶象幼虫效果
于11月初油茶果成熟期，油茶象幼虫陆续大量钻出油茶果入土滞育的时期，在有油茶象发生的油茶林树冠下林地选择面积为20cm×20cm的样方，挖深约25cm的坑，铺上细密尼龙纱网，然后用原土回填与地表齐平。将绿僵菌孢子配置成107孢子/mL的孢子悬浮液，按每亩50L的用量进行林间地表喷雾，然后放油茶象幼虫于土表，让幼虫自然钻入土中，每个样方30头虫，3个重复。引入幼虫30天后，将样方内所有土壤取出，仔细检查油茶象幼虫死亡及感染情况，结果见表6。林间地表喷菌后引入试虫30天后，油茶象幼虫的平均校正死亡率为56.3%，感染率为40%。
表6 金龟子绿僵菌FJMa201101菌株林间防治油茶象幼虫效果
实施例3、4、5结果表明，金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）FJMa201101菌株对油茶象幼虫具有较强的致病力，杀虫效果好，绿僵菌可以在土壤中长期宿存，能有效控制林间油茶象种群数量，减轻油茶象带来的危害，促进油茶的优质丰产，是一株在油茶象的防治上具有潜在意义的生防菌株。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，需要说明的是，对于本技术领域的技术人员，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建省林业科学研究院
<120> 一株防治油茶象幼虫的金龟子绿僵菌及其应用
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ggaagtaaaa gtcgtaacaa ggtctccgtt ggtgaaccag cggagggatc attaccgagt 60
tatccaactc ccaacccctg tgaattatac ctttaattgt tgcttcggcg ggacttcgcg 120
cccgccgggg acccaaacct tctgaatttt ttaataagta tcttctgagt ggttaaaaaa 180
aaaatgaatc aaaactttca acaacggatc tcttggttct ggcatcgatg aagaacgcag 240
cgaaatgcga taagtaatgt gaattgcaga attcagtgaa tcatcgaatc tttgaacgca 300
cattgcgccc gtcagtattc tggcgggcat gcctgttcga gcgtcattac gcccctcaag 360
tcccctgcgg acttggtgtt ggggatcggc gaggctggtt ttccagcaca gccgtccctt 420
aaattaattg gcggtctcgc cgtggccctc ctctgcgcag tagtaaagca ctcgcaacag 480
gagcccggcg cggtccactg ccgtaaaacc ccccaacttt ttatagttga cctcgaatca 540
ggtaggacta cccgctgaac ttaagcatat caataagcgg aggaa
585
Claims (4)
1.一种金龟子绿僵菌，其特征在于：所述菌株为金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）FJMa201101，该菌株已于2014年10月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，登记入册编号为CGMCC No.9780。
2. 一种杀虫菌剂，其特征在于所述的杀虫菌剂含有权利要求1所述的金龟子绿僵菌（Metarhizium anisopliae）FJMa201101所产生的分生孢子。
3. 按照权利要求2所述的杀虫菌剂，其特征在于其剂型为分生孢子悬浮液或粉剂。
4. 权利要求1所述的一株金龟子绿僵菌在防治油茶象幼虫中的应用。
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