CN105255746A - 一株对柑橘木虱具强致病力的宛氏拟青霉菌株及其应用 - Google Patents
一株对柑橘木虱具强致病力的宛氏拟青霉菌株及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开一株对柑橘木虱具强致病力的宛氏拟青霉菌株及其应用，属于生物防治技术领域。所述菌株为宛氏拟青霉(Paecilomyces？variotii)GZMS-11，于2015年10月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC？NO：M？2015651。本发明所述的宛氏拟青霉GZMS-11对柑橘木虱具有强的致病力，可以被开发为生物农药用于柑橘木虱的生物防治，较目前防治柑橘木虱的化学药剂相比，具有高效、绿色、环保、持效性强和不易产生抗药性的优点，对环境无污染、无残留。菌株GZMS-11生长速度快，产孢量大，孢子萌发率高，易于制备，具有良好的市场应用前景。
Description
技术领域
本发明属于生物防治技术领域，特别涉及一株对柑橘木虱具强致病力的宛氏拟青霉菌株及其应用。
背景技术
柑橘黄龙病是柑橘产业上最具毁灭性的病害，能侵染各种柑橘类植物，尚无有效的治疗性药剂，也没有抗(耐)病品种可供应用，当前柑橘黄龙病正在全球柑橘种植区逐步蔓延，是世界柑橘产业的重大威胁。柑橘木虱(Diaphorinacitrikuwayamae)属同翅目木虱科，主要危害九里香和柑橘等芸香科植物，成虫及若虫群集在新梢吸食汁液，被危害的嫩梢、嫩芽萎缩枯干，新叶畸形易脱落，严重影响植物生长，是柑橘上的重要害虫之一。柑橘木虱是黄龙病的唯一传播虫媒，柑橘木虱的频繁发生是柑橘黄龙病流行的重要因素。截至目前，防控柑橘黄龙病尚缺乏抗性品种和特效药剂，彻底地控制柑橘木虱是预防柑橘黄龙病的前提和基础，大面积范围内严格控制柑橘木虱是黄龙病综合防治的最重要保障。
目前对于柑橘木虱的防治多采用化学防治措施，然而化学农药的频繁使用造成了农药残留、环境污染、天敌昆虫大量死亡、生物多样性被破坏以及昆虫产生抗药性等诸多问题，而生物防治以其绿色、环保、持效、无污染、不易产生抗药性等优点被人们认为是最有效和最具应用前景的防治手段。
据文献报道，在昆虫病原微生物中，真菌种类最多，约占昆虫病原微生物种类的60％以上，并且昆虫病原真菌有着显著的流行潜力和生产的便利性，利用昆虫病原真菌防治柑橘木虱有着巨大的发展空间。国外已有利用球孢白僵菌Beauveriabassiana(Balsamo)Vuillemin、玫烟色棒束孢Isariafumosorosea(Wize)BrownetSmith、桔形被毛孢HirsutellacitriformisSpeare、蜡蚧轮枝菌Lecanicilliumlecanii(Zimmermann)Viégas和绿僵菌Metarhiziumanisopliae(Metchnikoff)Sorokin防治柑橘木虱的报道，但国内迄今为止，只有张燕璇等开展了利用胡瓜钝绥螨搭载白僵菌控制柑橘木虱的试验研究。因此，进一步分离筛选对柑橘木虱具有强致病力的虫生真菌，深入研究其生防潜能，对于促进未来柑橘木虱的生物防治具有重要的意义。
发明内容
为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一株对柑橘木虱具强致病力的宛氏拟青霉菌株。该菌株对柑橘木虱具有强致病力，具有被开发为生物农药的潜能，在柑橘木虱的生物防治方面拥有良好的市场应用前景。
本发明的另一目的在于提供所述的宛氏拟青霉菌株的应用。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
一株对柑橘木虱具强致病力的宛氏拟青霉(Paecilomycesvariotii)，菌种命名为GZMS-11，从广东省广州市天河区的九里香(Murrayapaniculata)上采集的柑橘木虱虫体上分离获得的。
所述的宛氏拟青霉(Paecilomycesvariotii)GZMS-11的保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期：2015年10月29日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCCNO:M2015651。
所述的宛氏拟青霉(Paecilomycesvariotii)GZMS-11在防控柑橘黄龙病虫媒中的应用，以及在制备用于防治柑橘木虱的生物农药中的应用，菌株GZMS-11的分生孢子悬浮液对柑橘木虱具有强致病力。
所述的宛氏拟青霉(Paecilomycesvariotii)GZMS-11，其形态特征、培养特性、ITS1-5.8SrDNA-ITS2序列和菌种分类结果如下：
1、菌株GZMS-11的形态特征：菌株GZMS-11在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基生长良好，27℃下培养10d其菌落直径可达5.86cm。在PDA平板上菌落圆形、蓬松状，起初菌落白色，后期呈黄褐色，边缘白色。培养10d的菌落正面为黄褐色棉絮状，菌落背面呈暗褐色。菌株培养3～4d即产生黄褐色色素，色素扩散至培养基琼脂内。菌丝细长、分隔，分生孢子梗上生出单个瓶梗或多个瓶梗，形成帚状枝。瓶梗大小2.5～3.5×15～20μm，细长渐尖，稍弯曲，瓶梗着生卵圆形孢子，分生孢子大小5.5～7.5×2.5～3.5μm。
2、菌株GZMS-11的ITS1-5.8SrDNA-ITS2序列：测序所得菌株GZMS-11的ITS1-5.8SrDNA-ITS2序列如SEQIDNO：1所示，利用NCBIBlast进行比对分析发现，所测序列与GenBank中宛氏拟青霉(Paecilomycesvariotii)的多个菌株(AY904061.1、FJ895878.1、JN798498.1、AY753335.1等)的序列相似性高达97～99％。
3、菌株GZMS-11的菌种分类结果：根据以上关于菌株GZMS-11的形态特征及ITS1-5.8SrDNA-ITS2序列特征，可将菌株GZMS-11鉴定为子囊菌门(Ascomycota)盘菌亚门(Pezizomycotina)散囊菌纲(Eurotiomycetes)散囊菌亚纲(Eurotiomycetidae)散囊菌目(Eurotiales)嗜热子囊菌科(Thermoascaceae)丝衣霉属(Byssochlamys)的宛氏拟青霉(Paecilomycesvariotii)。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：
(1)目前国内外尚未见宛氏拟青霉作为生物农药进行应用的报道，本发明提供的宛氏拟青霉(Paecilomycesvariotii)菌株GZMS-11是从广东省广州市天河区的九里香上采集的柑橘木虱虫体上分离获得的，经测定菌株GZMS-11对柑橘木虱具有强的致病力。
(2)本发明所述的宛氏拟青霉菌株GZMS-11是一种昆虫病原真菌，其分生孢子悬浮液可直接作用于柑橘木虱，较目前防治柑橘木虱的化学药剂相比，具有高效、绿色、环保、持效性强和不易产生抗药性的优点，对环境无污染、无残留；
(3)菌株GZMS-11生长速度快，产孢量大，孢子萌发率高，易于制备。菌株GZMS-11在被开发为生防菌制剂用于柑橘木虱的生物防治上，具有良好的市场应用前景。
附图说明
图1是菌株GZMS-11在PDA培养基上培养10d后的菌落特征。
图2是菌株GZMS-11的孢子形态。
图3是菌株GZMS-11的分生孢子梗形态。
图4是试验处理3d后菌株GZMS-11对柑橘木虱的侵染情况。
图5是试验处理7d后菌株GZMS-11对柑橘木虱的侵染情况。
具体实施方式
下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
所述的宛氏拟青霉(Paecilomycesvariotii)GZMS-11的保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏日期：2015年10月29日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号：CCTCCNO:M2015651。
实施例1柑橘木虱病原菌的分离和筛选
(1)病原菌的分离纯化
从广东省广州市天河区的九里香上采集罹病的柑橘木虱，在实验室超净工作台中进行操作。先将柑橘木虱放于70％乙醇中浸泡30s，再经过0.1％升汞浸泡1min，最后用无菌水冲洗3次。用无菌滤纸吸干虫体上的水分，然后将其放于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基(配制方法为：称取200g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000mL煮沸20～30min，两层纱布过滤，再加20g葡萄糖和15g琼脂，充分溶解后补水至1000mL，分装至锥形瓶中，121℃，高压灭菌20min)中。
将培养皿置于微生物培养箱中27℃恒温培养，至虫体周围长出菌丝后，挑取菌丝转至新的PDA平板上培养，持续培养10d左右，待菌落上产生分生孢子，用无菌水洗脱分生孢子制备成分生孢子悬浮液，然后参照《植病研究方法》中所述的稀释纯化法(方中达.植病研究方法(第三版)[M].北京:中国农业出版社,1998:122-140)对病原菌进行单孢分离。最后将分离纯化获得的菌株保存于PDA斜面培养基中，培养7d左右，置于4℃冰箱保存。
(2)致病菌的筛选
将上述分离纯化保存的菌株接种到PDA平板上，于27℃恒温培养10d左右后，以无菌水洗脱菌落上产生的分生孢子，制备获得分生孢子悬浮液，向其中加入适量的吐温-80至终浓度为0.1％(v/v)。取养虫笼内饲养的25头健康柑橘木虱成虫浸没于含0.1％(v/v)吐温-80的分生孢子悬浮液中10～15s，挑取处理后仍能自由活动的柑橘木虱置于培养皿中的九里香叶片上，培养皿底部铺有两层用无菌水浸湿的滤纸，其上放置一个带10个左右叶片的九里香嫩枝，枝条底端以无菌水浸湿的脱脂棉包裹，然后放于27±0.5℃光照培养箱中(L：D＝14:10，RH>90％)培养，同时设立含0.1％(v/v)吐温-80的无菌水处理柑橘木虱为对照，培养3d、7d、10d后分别观察病菌对柑橘木虱的侵染和致死情况。
(3)病原菌回接试验
制备上述筛选到的对柑橘木虱具致病力的菌株GZMS-11的分生孢子悬浮液，接种到健康柑橘木虱虫体上，然后再从发病的柑橘木虱虫体上分离纯化病菌，最后获得分离纯化的菌株GZMS-11，具体操作方法同步骤(1)。比较再分离的病菌与初始接种的病菌的形态特征和培养特征。通过以上操作，筛选出符合科赫氏法则的对柑橘木虱具致病力的菌株，排除从柑橘木虱虫体上分离到的腐生菌等非致病菌。通过筛选，获得1株对柑橘木虱具有致病力的菌株，将其命名GZMS-11。
实施例2菌株GZMS-11的鉴定
1、菌株GZMS-11的形态特征：菌株GZMS-11在马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基生长良好，27℃下恒温培养，每天观察菌落生长情况并记录菌落颜色和形态。将菌株GZMS-11接种到另一PDA培养基平板中央，同时将灭菌后的盖玻片(1cm×1cm)斜插入距接种点约1cm左右处的培养基内，置于27℃恒温培养5d左右待菌丝爬到盖玻片上后，取出盖玻片置于光学显微镜下观察菌株GZMS-11的菌丝和孢子形态。
图1是菌株GZMS-11在PDA培养基上培养10d后的菌落特征。可见菌株GZMS-11菌落圆形、蓬松状，起初菌落白色，后期呈黄褐色，边缘白色。培养10d的菌落正面为黄褐色棉絮状，菌落背面呈暗褐色。菌株培养3～4d即产生黄褐色色素，色素扩散至培养基琼脂内。
图2是菌株GZMS-11的孢子形态。图3是菌株GZMS-11的分生孢子梗形态。从图2和图3中可知，在光学显微镜下观察到菌株GZMS-11菌丝细长、分隔，分生孢子梗上生出单个瓶梗或多个瓶梗，形成帚状枝。瓶梗大小2.5～3.5×15～20μm，细长渐尖，稍弯曲，瓶梗着生卵圆形孢子，分生孢子大小5.5～7.5×2.5～3.5μm。
2、菌株GZMS-11的ITS1-5.8SrDNA-ITS2序列：采用试剂盒法(AxyPrepMultisourceGenomicDNAMiniprepKit、爱思进生物技术(杭州)有限公司)提取菌株GZMS-11的总DNA，利用真菌通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和ITS4(5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')，PCR扩增其ITS1-5.8SrDNA-ITS2区域片段。测序所得菌株GZMS-11的ITS1-5.8SrDNA-ITS2序列大小为608bp，如SEQIDNO：1所示。利用NCBIBlast进行比对分析发现，所测序列与GenBank中宛氏拟青霉(Paecilomycesvariotii)的多个菌株(AY904061.1、FJ895878.1、JN798498.1、AY753335.1等)的序列相似性高达97～99％。
所述的宛氏拟青霉(Paecilomycesvariotii)GZMS-11的ITS1-5.8SrDNA-ITS2的序列如下：(608bp)
TCCGTAGGTGAACCTGCGGAAGGATCATTACCGAGTGAGGGTCCCTCGAGGCCCAACCTCCCATCCGTGTTGTTAAACACCTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCGTGGTTCACGCCGTGGCCGCCGGGGGGCATCTCGCCCCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGACCCCTCGAACGCTGCCTTGAAGGTTGCCGTCTGAGTATGAAATTCAATCGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTAACCCTCCAGCCCGGCTGGTGTGTTGGGTCGACGTCCCCCCCGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCGCCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACGCGCTCTGGTAGGGTCGGCCGGCTGGCCAGCCAGCGACCTCACGGTCACCTATTATTTTTCTCTTAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA。
3、菌株GZMS-11的菌种分类结果：根据以上关于菌株GZMS-11的形态特征及ITS1-5.8SrDNA-ITS2序列特征，可将菌株GZMS-11鉴定为子囊菌门(Ascomycota)盘菌亚门(Pezizomycotina)散囊菌纲(Eurotiomycetes)散囊菌亚纲(Eurotiomycetidae)散囊菌目(Eurotiales)嗜热子囊菌科(Thermoascaceae)丝衣霉属(Byssochlamys)的宛氏拟青霉(Paecilomycesvariotii)。
实施例3菌株GZMS-11对柑橘木虱的致病力测定
(1)菌株GZMS-11对柑橘木虱的致死中浓度和致死中时间
将菌株GZMS-11接种至PDA固体培养基上10d后，培养的菌落经由无菌水冲洗，无菌纱布过滤收集分生孢子悬浮液，以无菌水进行系列稀释，获得浓度分别为1.0×108个孢子/mL、1.0×107个孢子/mL、1.0×106个孢子/mL、1.0×105个孢子/mL、1.0×104个孢子/mL的分生孢子悬浮液，并向其中加入适量的吐温-80至终浓度为0.1％(v/v)。按实施例1所述将健康柑橘木虱放于上述各浓度的含0.1％(v/v)吐温-80的分生孢子悬浮液中浸润处理，之后放于27±0.5℃光照培养箱中(L：D＝14:10，RH>90％)培养，同时设立以含0.1％(v/v)吐温-80的无菌水处理柑橘木虱为对照。以上每个处理设4个重复，每个重复处理25头柑橘木虱。从培养第3d开始每天观察病菌对柑橘木虱的侵染和致死情况，记录柑橘木虱死亡数量，按如下公式计算死亡率和校正死亡率，所得数据通过DPS软件进行回归分析，得到回归方程和相关系数r，计算致死中浓度(LD50)和致死中时间(LT50)。
试验结果显示，菌株GZMS-11的分生孢子悬浮液浓度越高，对柑橘木虱的致死效果越好。在同一浓度条件下，接种后孵育时间越长，柑橘木虱的死亡率越高。接种后第3d，菌株GZMS-11对柑橘木虱的LD50为1.60×108个孢子/mL，第7d仅为2.58×105个孢子/mL，第10d则仅为1.35×104个孢子/mL。分生孢子悬浮液浓度越高，菌株GZMS-11对柑橘木虱的LT50也越短，浓度为1.0×104个孢子/mL的分生孢子悬浮液对柑橘木虱的LT50为8.81d，而浓度为1.0×108的孢子悬浮液的LT50仅为3.13d。
浓度为1.0×108个孢子/mL的孢子悬浮液试验处理3d后，菌株GZMS-11对柑橘木虱的侵染情况，如图4所示；浓度为1.0×108个孢子/mL的孢子悬浮液试验处理7d后，菌株GZMS-11对柑橘木虱的侵染情况，如图5所示。
(2)菌株GZMS-11对柑橘木虱的生物防治应用
取健康柑橘木虱放于养虫笼内的盆栽九里香幼苗上(1个养虫笼内放置1株九里香幼苗，1株九里香幼苗上放柑橘木虱30头，设4个重复)，按上述操作制备含0.1％吐温-80的浓度为1.0×108个孢子/mL的菌株GZMS-11的分生孢子悬浮液，通过小型喷雾器对九里香上的柑橘木虱均匀喷雾，至柑橘木虱体表完全湿润。以含0.1％吐温-80的无菌水处理柑橘木虱作为对照。上述各处理完成后，将养虫笼放入玻璃温室内，控制温室内温度为25～30℃(L：D＝14:10，RH>90％)。于处理后第3d、第7d和第10d观察并记录上述各处理的柑橘木虱的总虫数和死亡虫数，计算死亡率和校正死亡率。以浓度为1.0×108个孢子/mL的菌株GZMS-11的分生孢子悬浮液处理的柑橘木虱，在第3d、第7d和第10d的校正死亡率分别35.83％、66.71％和97.16％。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (4)
1.一株对柑橘木虱具强致病力的宛氏拟青霉，其特征在于：名称为宛氏拟青霉(Paecilomycesvariotii)GZMS-11，于2015年10月29日保藏于中国武汉市武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2015651。
2.根据权利要求1所述的对柑橘木虱具强致病力的宛氏拟青霉，其特征在于：所述的宛氏拟青霉(Paecilomycesvariotii)GZMS-11是从广东省广州市天河区的九里香上采集的柑橘木虱虫体上分离获得的。
3.权利要求1或2所述的对柑橘木虱具强致病力的宛氏拟青霉的应用，其特征在于：所述的宛氏拟青霉(Paecilomycesvariotii)GZMS-11在防控柑橘黄龙病虫媒中的应用。
4.权利要求1或2所述的对柑橘木虱具强致病力的宛氏拟青霉的应用，其特征在于：所述的宛氏拟青霉(Paecilomycesvariotii)GZMS-11在制备用于防治柑橘木虱的生物农药中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |
Application publication date: 20160120 Assignee: Pingyuan County Hongji Ecological Park Co.,Ltd. Assignor: PLANT PROTECTION Research Institute GUANGDONG ACADEMY OF AGRICULTURAL SCIENCES Contract record no.: X2022440000146 Denomination of invention: A strain of Paecilomyces variotii with strong pathogenicity to citrus psyllids and its application Granted publication date: 20180831 License type: Common License Record date: 20220915 |
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| EE01 | Entry into force of recordation of patent licensing contract |