CN103468579B - 一种对柑橘木虱具致病力的蜡蚧菌属真菌新种 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种对柑橘木虱具致病力的蜡蚧菌属真菌新种。蜡蚧菌（Lecanicilliumsp.）ZJLSP07，已于2013年6月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.7803。本发明的蜡蚧菌ZJLSP07对柑橘木虱具有致病力，与同属的蜡蚧轮枝菌菌株相比，蜡蚧菌ZJLSP07对柑橘木虱具有更强的作用效果，可被开发为生防菌制剂用于对柑橘木虱的生物防治。与目前防治柑橘木虱的化学药剂相比，具有高效、低毒、低残留、无污染、不易产生抗药性等特征，具有良好的市场应用前景。

Description

一种对柑橘木虱具致病力的蜡蚧菌属真菌新种

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种对柑橘木虱具致病力的蜡蚧菌属（Lecanicillium）真菌新种。

背景技术

柑橘黄龙病（Citrus Huanglongbing，HLB）是当前柑橘生产上防治最难、威胁最大的一种毁灭性病害，广泛分布在亚洲、非洲和美洲等多个国家和地区。该病害的猖獗发生和蔓延危害，给人们带来了巨大的经济损失，已成为柑橘产业稳定发展的重大障碍。尽管从发现该病害至今已有百余年的历史，但目前尚缺乏有效的防治药剂和理想的抗病品种，因此主要采取以治虫防病为主的综合防控措施来控制该病害的发生和流行。该病害的病原物为韧皮部杆菌属（Candidatus Liberibacter）细菌，在自然条件下主要通过柑橘木虱（Diaphorina citri）传播扩散。柑橘木虱除作为唯一自然虫媒传播黄龙病外，还是柑橘、柠檬、黄皮、九里香、枸杞等芸香科植物新梢期的主要害虫，可直接取食危害新梢嫩叶及产生分泌物诱发煤烟病等。因此，加强对柑橘木虱的防治，无论对于控制柑橘黄龙病的流行还是降低虫体本身对柑橘的危害都具有重要的意义。

目前对于柑橘木虱的防治多采用化学防治措施，然而化学农药的频繁使用造成了农药残留、环境污染、生物多样性破坏和柑橘木虱产生抗药性等诸多问题，而生物农药以其高效、低毒、低残留、无污染、不易产生抗药性和原料易得等特性被人们认为是未来化学农药的理想替代药剂。因此，利用生物农药防治柑橘木虱也逐渐引起人们的重视。已有报道对柑橘木虱具有致病效果的真菌有檬形被毛孢（Hirsutella citriformis）、宛氏拟青霉（paecilomyces varioti）、玫烟色拟青霉（Paecilomyces fumosoroseus）、球孢白僵菌（Beauveria bassiana）、蚜笋顶孢霉（Acrostalagmus aphidium）、黄色镰刀菌（Fusarium culmorum）和蜡蚧轮枝菌（Lecanicillium lecanii）等。

蜡蚧菌属是从先前的Verticillium属的Verticillium section Prostrata分离出来的一个属。最初Gams等根据菌株的培养特征和形态学特征将Verticillium属真菌分为5个部分，分别为section Verticillium、section Nigrescentia、section Prostrata、section Albo-erecta及residual group。其中section Verticillium只包括一个菌种Verticillium tenerum；section Nigrescentia包括模式菌种Verticillium nigrescens及Verticillium albo-atrum、Verticillium dahliae、Verticillium nubilum、Verticillium tricorpus、Verticillium theobromae；section Prostrata包括18个菌种，模式菌种为Cordyceps militaris的无性型，及最常见的菌种Verticillium lecanii和Verticillium psalliotae；section Albo-erecta的模式菌种为Verticilliumfungicola；剩余未划入上述部分中的Verticillium属真菌菌种则归入到residual group。之后Zare等和Gams等又根据菌种的形态学特征和核糖体DNA内转录间隔区（ITS）、核糖体大亚基（LSU）、核糖体小亚基（SSU）、β-tubulin等基因序列及菌种的寄主种类，对Verticillium属真菌重新进行了归类，而尚未重新进行分类的Verticillium属真菌菌种仍然沿用以前的名字。将Verticillium section Verticillium中的Verticillium tenerum（同义Verticillium luteoalbum）归入到Acrostalagmus属中；将Verticillium section Nigrescentia中的Verticillium nigrescens归入到Gibellulopsis属中；将Verticillium section Nigrescentia中的Verticillium theobromae归入到新属Musicillium中；而Verticillium section Nigrescentia中作为植物病原菌的Verticillium dahliae、Verticillium longisporum、Verticillium albo-atrum、Verticillium nubilum和Verticillium tricorpus仍保留在Verticillium属中，形成狭义上的Verticillium属Verticillium s. str.；将Verticillium section Prostrata划分成5个属，分别为Lecanicillium、Simplicillium、Pochonia、Haptocillium和Rotiferophthora，其中Verticillium section Prostrata一大部分菌种划入到Lecanicillium属中，Lecanicillium属真菌多为侵染昆虫和真菌的菌种，Simplicillium属真菌多为腐生菌和真菌的重寄生菌，Pochonia属真菌多寄生孢囊线虫和黏菌，Haptocillium属真菌的寄主多为自由生活型线虫，Rotiferophthora属真菌多侵染轮虫。之后，随着人们研究的进展，不断有新发现和命名的菌种归入到上述各属中，如Patrik Inderbitzin等将新发现的5种植物病原菌Verticillium isaacii、 Verticillium klebahnii、Verticillium zaregamsianum、Verticillium alfalfae和Verticillium nonalfalfae归入到Verticillium属中；Kenichi Nonaka等将新发现的5种菌Simplicilliumcylindrosporum、 Simplicillium minatense、Simplicillium subtropicum、Simplicillium aogashimaense和Simplicillium sympodiophorum归入到Simplicillium属中；Nampiah Sukarno等将新发现的菌种Lecanicillium araneicola、Lecanicillium kalimantanense，Satoru Kaifuchi等将新发现的菌种Lecanicillium primulinum，及Kope等将新发现的菌种Lecanicillium pissodis，全都归入到Lecanicillium属中。目前Lecanicillium属共包含22已命名的菌种，分别为Lecanicilliumacerosum、Lecanicillium antillanum、Lecanicilliumaphanocladii、Lecanicilliumaranearum、Lecanicilliumaraneicola、Lecanicilliumattenuatum、Lecanicilliumdimorphum、Lecanicilliumflavidum、Lecanicilliumfungicola var. fungicola、Lecanicilliumfungicola var. aleophilum、Lecanicilliumfusisporum、Lecanicilliumkalimantanense、Lecanicilliumlecanii、Lecanicilliumlongisporum、Lecanicilliummuscarium、Lecanicilliumnodulosum、Lecanicilliumpissodis、Lecanicilliumprimulinum、Lecanicilliumpsalliotae、Lecanicilliumsaksenae、Lecanicilliumtenuipes、Lecanicilliumwallacei，及4个未具体命名的菌种，分别为Lecanicillium sp.1、Lecanicillium sp.2、Lecanicillium sp.3、Lecanicillium sp.4。 

目前已有研究报道的对柑橘木虱具有致病力的蜡蚧菌属真菌有蜡蚧轮枝菌（Lecanicillium lecanii）和刀孢轮枝菌（Lecanicillium psalliotae）。对于柑橘木虱生防菌的研究多处于实验室阶段，在农业生产中利用生防菌制剂成功防治柑橘木虱的实例尚未有见报道。因此，对柑橘木虱虫生真菌进行进一步分离筛选和生防潜能深入研究，对于促进将来柑橘木虱生物防治的顺利开展具有重要的意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种对柑橘木虱具致病力的蜡蚧菌属真菌新种，该菌种具有被开发为生物农药的潜能，具有良好的市场应用前景。

一种对柑橘木虱具致病力的蜡蚧菌属真菌新种，其特征在于该真菌菌株为蜡蚧菌（Lecanicillium sp.）ZJLSP07，已于2013年6月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.7803。

蜡蚧菌ZJLSP07是从浙江省台州市黄岩区的橘园中采集的柑橘木虱虫体上分离获得的，该菌株的形态特征、培养特性、ITS1-5.8S rDNA-ITS2（核糖体DNA内转录间隔区1-5.8S rDNA-核糖体DNA内转录间隔区2）序列和菌种分类结果如下：

1、菌株ZJLSP07的形态特征：如图1所示，菌株ZJLSP07在马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基上生长良好，25℃下暗培养7 d其菌落直径可达2.6-2.7 cm，菌落呈圆形，菌落正面为白色丝绒状，背面呈浅黄色，具放射状皱褶，无渗出液和色素产生。如图2所示，在光学显微镜下观察其菌丝透明，有分隔，宽为1.2-2.2 μm；瓶梗着生于匍匐状气生菌丝上，单生或对生，少数为轮生，瓶梗从基部向顶端逐渐变细，直立，大小为12.5-28×0.5-1.9 μm；分生孢子单生于瓶梗顶端，壁光滑，大小不一，呈椭圆形、纺锤形或镰刀形，其中大分生孢子大小为5.5-8.5×1.5-2.5 μm，小分生孢子大小为3.0-4.5×1.0-2.0 μm；未见厚垣孢子。

2、菌株ZJLSP07的生物学特性：菌株ZJLSP07在马铃薯葡萄糖琼脂培养基、马铃薯蔗糖琼脂（PSA）培养基、沙氏葡萄糖酵母浸膏琼脂（SDAY）培养基、察氏（CDA）培养基、麦芽浸膏琼脂（MEA）培养基、LCA培养基和沙氏葡萄糖琼脂（SDA）培养基上均生长良好，其中在LCA和PDA等培养基上生长较快，而在PSA培养基上生长相对较慢。在LCA培养基上菌丝相对稀疏，菌落背面无皱褶，而在其他培养基上菌丝较为致密，菌落背面具不同程度的放射状皱褶。菌株ZJLSP07在10℃~35℃的温度条件下均可生长，其中25℃~30℃为其适宜生长温度，10℃条件下生长极为缓慢，5℃和40℃条件下不生长。光照时间长短对菌株ZJLSP07的生长影响不显著。沙氏葡萄糖酵母浸膏（SDY）液体培养基和沙氏葡萄糖（SD）液体培养基为菌株ZJLSP07最佳产孢培养基。菌株ZJLSP07的分生孢子在10℃~35℃的温度条件下均能萌发，其中25℃~30℃为其孢子萌发的适宜温度。

3、菌株ZJLSP07的基因序列特征：测序所得菌株ZJLSP07的18S rDNA部分序列如SEQ ID NO:1所示，ITS1-5.8S rDNA-ITS2完整序列如SEQ ID NO:2所示，β-tubulin基因部分序列如SEQ ID NO:3所示。利用NCBI Blast进行比对分析发现，菌株ZJLSP07的18S rDNA部分序列与GenBank中多个不同菌种对应序列的相似性达99%~100%；在GenBank中与其ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列相似性较高的真菌为含蜡蚧菌属在内的肉座菌目（Hypocreales）真菌，但在序列覆盖率100%的条件下，菌株ZJLSP07与GenBank中已确定种名的真菌的序列相似性最高仅为94%；而其β-tubulin基因的部分DNA序列与GenBank中菌种对应序列的相似性最高仅为87%，该基因的编码区序列（CDS）与GenBank中菌种的相应序列的相似性最高为95%。利用EMBOSS Needle在线工具对菌株ZJLSP07的基因序列与蜡蚧菌属各菌种的对应序列进行比对，结果显示菌株ZJLSP07与蜡蚧菌属真菌具有较高的同源性，其18S rDNA部分序列的相似性在97.8%和98.7%之间；而其ITS1-5.8S rDNA-ITS2完整序列与蜡蚧菌属真菌的对应序列相似性最高仅为93.9%。系统发育分析显示（如图3），菌株ZJLSP07与所有的蜡蚧菌属真菌聚成一个大的分支，且其与Lecanicilliumkalimantanense和Lecanicilliumwallacei具有最近的亲缘关系，但在置信度95%下，菌株ZJLSP07与这两种菌又归属于两个不同的小的分支中。菌株ZJLSP07与蜡蚧菌属真菌已知的β-tubulin基因的DNA序列相似性最高为84.0%，编码区序列相似性最高为93.8%。

参考相关文献中关于蜡蚧菌属及属内各菌种的详细描述，结合以上对于菌株ZJLSP07的形态特征、生物学特性及寄主种类的研究结果，明确菌株ZJLSP07具备蜡蚧菌属真菌的典型特征，因此将其鉴定为肉座菌目虫草菌科（Cordycipitaceae）蜡蚧菌属的真菌，但其与该属中已知种的特征又存在差异。对菌株ZJLSP07的ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列分析结果亦表明，菌株ZJLSP07与蜡蚧菌属真菌具有较高的同源性，在系统发育树中与该属的所有菌种聚为一个分支，进一步表明菌株ZJLSP07为蜡蚧菌属真菌。但菌株ZJLSP07与蜡蚧菌属中菌种的ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列相似性最高仅为93.9%，远低于97%这一真菌种间序列相似性的阈值。在系统发育树上，菌株ZJLSP07与其亲缘关系最近的Lecanicilliumkalimantanense和Lecanicilliumwallacei也分处于两个不同的小的分支中。且其β-tubulin基因的DNA序列与GenBank中已知菌种具有较低的相似性。综合以上研究和分析结果，我们确定菌株ZJLSP07为肉座菌目虫草菌科蜡蚧菌属真菌的一个新种，将其命名为蜡蚧菌ZJLSP07。

进一步的，所述的蜡蚧菌属真菌新种，其特征在于制备用于防治柑橘木虱的生物药剂。

蜡蚧菌ZJLSP07在制备用于防治柑橘木虱的生物农药中的应用，蜡蚧菌ZJLSP07的分生孢子悬浮液对柑橘木虱具有致病力，接种后第3 d，蜡蚧菌ZJLSP07对柑橘木虱的LC₅₀为5.25×10⁹ spores/mL，蜡蚧菌ZJLSP07浓度为1.0×10⁸ spores/mL孢子悬浮液对柑橘木虱的LT₅₀为3.25 d。温室条件下以浓度为1.0×10⁸ spores/mL的蜡蚧菌ZJLSP07的分生孢子悬浮液处理柑橘木虱，在第9 d其校正死亡率可达100%。

与现有技术相比，本发明的优点和有益效果为：

（1）本发明所提供的蜡蚧菌ZJLSP07为蜡蚧菌属真菌的一个新种，国内外无相关的研究报道；

（2）本发明提供的蜡蚧菌ZJLSP07是从浙江省台州市黄岩区柑橘园中被侵染的柑橘木虱虫体上分离获得的，经测定其对柑橘木虱具有致病力；

（3）同等条件下，本发明所提供的蜡蚧菌ZJLSP07较与之同属的蜡蚧轮枝菌菌株对柑橘木虱具有更强的作用效果，同时间内对柑橘木虱的致死率更高；

（4）本发明所提供的蜡蚧菌ZJLSP07是一种昆虫病原真菌，其分生孢子悬浮液可直接作用于柑橘木虱，较目前防治柑橘木虱的化学药剂相比，具有高效、低毒、低残留、无污染和不易产生抗药性的特征；

（5）蜡蚧菌ZJLSP07培养快，产孢量大，孢子萌发率高，易于制备。

因此蜡蚧菌ZJLSP07在被开发为生防菌制剂用于对柑橘木虱的生物防治上，具有良好的市场应用前景。

附图说明

图1为蜡蚧菌ZJLSP07在PDA培养基上培养7 d后的菌落特征。

图2为光学显微镜下观察的蜡蚧菌ZJLSP07的菌丝、分生孢子梗和分生孢子的形态特征。

图3为基于ITS1-5.8S rDNA-ITS2基因序列构建的蜡蚧菌ZJLSP07的系统发育树，图中“L.”为蜡蚧菌属名“Lecanicillium”的缩写，“V.”为属名“Verticillium”的缩写，“S.”为属名“Simplicillium”的缩写，“H.”为属名“Haptocillium”的缩写，“R.”为属名“Rotiferophthora”的缩写，“P.”为属名“Pochonia”的缩写，“M.”为属名“Musicillium”的缩写，“A.”为属名“Acrostalagmus”的缩写，“G.”为属名“Gibellulopsis”的缩写，括号中的号码为对应菌种在GenBank中的登录号。

图4为体视显微镜下观察的蜡蚧菌ZJLSP07对柑橘木虱的侵染情况。

图5为扫描电子显微镜下观察的蜡蚧菌ZJLSP07的菌丝体在柑橘木虱体表的覆盖情况及新形成的分生孢子。

图6为光学显微镜下观察的蜡蚧菌ZJLSP07的菌丝在柑橘木虱体腔内的分布。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。

一种对柑橘木虱具致病力的蜡蚧菌属真菌新种，菌种命名为ZJLSP07，分类命名：蜡蚧菌（Lecanicilliumsp.），其保藏编号：CGMCC No.7803，保藏日期：2013年6月24日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。

实施例1：昆虫病原菌的分离和筛选

1、病菌的分离纯化：从浙江省台州市黄岩区柑橘园内采集柑橘木虱虫尸，于实验室超净工作台中进行如下操作：先将虫体放于70%乙醇中浸泡30 s，再经过0.1%升汞浸泡3 min，最后用无菌水冲洗3次。用无菌滤纸吸干虫体上的水分，然后将其放于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基（配制方法为：称取200 g马铃薯，洗净去皮切碎，加水1000 mL煮沸半个小时，纱布过滤，再加20 g葡萄糖和20 g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤，分装至锥形瓶或玻璃试管中，121℃，高压灭菌20 min）中。将培养皿置于微生物培养箱中25℃恒温培养，至虫体周围长出菌丝后，挑取菌丝转至新的PDA平板上培养（重复此操作2~3次），持续培养10 d左右，待菌落上产生分生孢子，用无菌水洗脱分生孢子制备成分生孢子悬浮液，然后参照《植病研究方法》中所述的稀释纯化法（方中达. 植病研究方法（第三版）[M]. 北京: 中国农业出版社,1998: 122-140）对病菌进行单孢分离。最后将分离纯化获得的菌株保存于PDA斜面培养基中，培养5 d左右，置于4℃冰箱保存。

2、致病菌的筛选：将上述分离纯化保存的菌株接种到PDA平板上，于25℃恒温培养10 d左右后，以无菌水洗脱菌落上产生的分生孢子，制备获得分生孢子悬浮液，向其中加入适量的吐温-80至终浓度为0.1%。取于温室饲养的30头健康柑橘木虱成虫（本说明书实施例均以柑橘木虱成虫为测试对象）浸没于含0.1%吐温-80的分生孢子悬浮液中10~15 s，挑取处理后仍能自由活动的柑橘木虱置于培养皿中的九里香叶片上（培养皿底部铺有2层用无菌水湿润过的滤纸，其上放置一个带10个左右叶片的九里香嫩枝，枝条底端以无菌水湿润的脱脂棉包裹），然后放于25℃光照培养箱中（每天14 h光照/10 h黑暗，湿度95%以上）培养，同时设立含0.1%吐温-80的无菌水处理柑橘木虱为对照，培养7 d后观察病菌对柑橘木虱的侵染和致死情况。之后再按步骤1中的方法从处理后的柑橘木虱虫体中分离病菌，比较再分离的病菌与初始接种的病菌的形态特征和培养特征。

通过以上操作，筛选出符合科赫氏法则的对柑橘木虱具致病性的菌株，排除从柑橘木虱虫体上分离到的腐生菌等非致病菌。通过筛选，获得1株对柑橘木虱具有致病力的菌株，将其命名ZJLSP07。

3、菌株的复壮：制备上述筛选到的对柑橘木虱具致病力的菌株ZJLSP07的分生孢子悬浮液，接种到健康柑橘木虱虫体上，然后再从发病的柑橘木虱虫体上分离纯化病菌，具体操作方法同上。最后获得分离纯化的菌株ZJLSP07。

实施例2：菌株ZJLSP07的鉴定

1、菌株ZJLSP07的形态特征：将上述分离纯化的菌株ZJLSP07接种到PDA培养基平板中央，置于25℃恒温培养，每天观察菌落生长情况并记录菌落颜色和形态。将菌株ZJLSP07接种到另一PDA培养基平板中央，同时将灭菌后的盖玻片（1 cm×1 cm）斜插入距接种点约1 cm左右处的培养基内，置于25 ℃恒温培养7 d左右待菌丝爬到盖玻片上后，取出盖玻片置于光学显微镜下观察菌株ZJLSP07的菌丝和孢子形态。

图1是菌株ZJLSP07在 PDA培养基上25 ℃恒温培养7 d后的形态特征，可见菌株ZJLSP07菌落呈圆形，菌落正面为白色丝绒状，菌落背面呈浅黄色，具放射状皱褶，无渗出液和色素产生。在光学显微镜下观察菌株ZJLSP07的形态特征如图2所示，可见其菌丝透明，有分隔，宽为1.2-2.2 μm；瓶梗着生于匍匐状气生菌丝上，单生或对生，少数为轮生，瓶梗从基部向顶端逐渐变细，直立，大小为12.5-28×0.5-1.9 μm；分生孢子单生于瓶梗顶端，壁光滑，大小不一，呈椭圆形、纺锤形或镰刀形，其中大分生孢子大小为5.5-8.5×1.5-2.5 μm，小分生孢子大小为3.0-4.5×1.0-2.0 μm；未见厚垣孢子。参考相关文献（Zare R, et al. A revision of Verticillium sect. Prostrata. III. Generic classification. Nova Hedwigia. 2001, 72:329-337; Zare R, et al. A revision of Verticillium section Prostrata. IV. The genera Lecanicillium and Simplicillium gen nov. Nova Hedwigia, 2001, 73:1–50; Kope H H, et al. A new species of Lecanicillium isolated from the white pine weevil, Pissodesstrobi. Mycotaxon, 2005,  94:331–340; Zare R, et al. A revision of the Verticillium fungicola species complex and its affinity with the genus Lecanicillium. Mycological Research, 2008, 112:811-824; Sukarno N, et al. Lecanicillium and Verticillium species from Indonesia and Japan including three new species. Mycoscience, 2009, 50:369-379; Kaifuchi S, et al. Lecanicillium primulinum, a new hyphomycete (Cordycipitaceae) from soils in the Okinawa's main island and the Bonin Islands, Japan. Mycoscience, 2013, 54:291-296.）关于蜡蚧菌属及属内各种的描述，结合菌株ZJLSP07的形态学特征和侵染柑橘木虱的特性，明确菌株ZJLSP07具备蜡蚧菌属真菌的典型特征，因此将其鉴定为肉座菌目虫草菌科蜡蚧菌属的真菌，但其与该属已知菌种的形态特征又存在差别。

2、菌株ZJLSP07的序列分析：将菌株ZJLSP07接种至PDA培养基平板，置于25℃恒温培养10 d左右，以无菌药匙刮取PDA平板上生长的真菌菌丝于无菌研钵中，加入液氮研磨至粉末状，采用改良的CTAB法提取菌株ZJLSP07的总DNA。以纯化的DNA为模板，用真菌通用引物NS1（5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′）和NS2（5′-GGCTGCTGGCACCAGACTTGC-3′）扩增菌株ZJLSP07的18S rDNA，利用真菌通用引物ITS5（5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′） 和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）扩增菌株ZJLSP07的ITS1-5.8S rDNA-ITS2，利用真菌通用引物Bt2a（5′-GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC-3′）和Bt2b（5′-ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC-3′）扩增菌株ZJLSP07的β-tubulin基因。PCR反应体系为：10×Buffer 2.5 μL，dNTPs 2 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1.5 μL，Taq DNA聚合酶0.2 μL，DNA模板1 μL，无菌水补足至总体积25 μL。反应条件为：94℃ 5 min；94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，35个循环；最后72℃延伸10 min。（CTAB法提取DNA等具体操作方法参考：鹿连明等. 柑橘黄龙病菌核糖体蛋白基因的多态性及系统发育分析. 浙江大学学报, 2011, 37(2):125-132）。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳，利用凝胶回收试剂盒回收目的条带后送交公司测序。将所测得序列整理后，利用NCBI Blast在线工具进行比对，分析其与与GenBank中菌种的对应序列的相似性；选取GenBank中登录的蜡蚧菌属各菌种的模式菌株或代表菌株的序列，利用EMBOSS Needle在线工具将其与菌株ZJLSP07的序列进行比对，分析其相似性；选取GenBank中登录的蜡蚧菌属及先前分类为Verticillium属的各菌种的模式菌株或代表菌株的ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列，与菌株ZJLSP07的相应序列，利用Clustal X进行多重比对后，使用MEGA5.05软件，通过Neighbor joining方法构建系统发育树，在构建系统发育树时进行自举检验，重复抽样的次数为1000。

测序所得菌株ZJLSP07的18S rDNA部分序列如SEQ ID NO:1所示，ITS1-5.8S rDNA-ITS2完整序列如SEQ ID NO:2所示，β-tubulin基因部分序列如SEQ ID NO:3所示。利用NCBI Blast进行比对分析发现，菌株ZJLSP07的18S rDNA部分序列与GenBank中多个不同菌种对应序列的相似性达99%~100%；与其ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列相似性较高的真菌为含蜡蚧菌属在内的肉座菌目真菌，其中相似性最高的3个菌株为肉座菌目真菌，但作者只将其归类到目或科，未对其进一步分类到属和种，且相关文献中也未有关于该菌株的形态描述。在覆盖率100%的条件下，菌株ZJLSP07与GenBank中已确定种名的真菌的ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列相似性最高仅为94%；而其β-tubulin基因的部分DNA序列与GenBank中菌种对应序列的相似性最高仅为87%，该基因的编码区序列（CDS）与GenBank中菌种的相应序列的相似性最高为95%。利用EMBOSS Needle在线工具对菌株ZJLSP07的基因序列与蜡蚧菌属各菌种的对应序列进行比对，结果详见表1和表2，可见菌株ZJLSP07与蜡蚧菌属各菌种的18S rDNA序列具有较高的相似性；而其ITS1-5.8S rDNA-ITS2完整序列与蜡蚧菌属真菌的对应序列相似性最高仅为93.9%；其β-tubulin基因的DNA序列（含内含子）与GenBank中已登录的蜡蚧菌属真菌的相似性最高仅为84.0%，其编码区序列的相似性最高仅为93.8%。在基于ITS1-5.8S rDNA-ITS2构建的系统发育树中（如图3），菌株ZJLSP07与该属的所有菌种聚为一个分支，支持菌株ZJLSP07为蜡蚧菌属真菌的结论，在置信度95%下，菌株ZJLSP07与其亲缘关系最近的Lecanicilliumkalimantanense和Lecanicilliumwallacei又分处于两个不同的小的分支中，表明菌株ZJLSP07又有别于蜡蚧菌属已知菌种。

                                                

注：表中“L.”为“Lecanicillium”的缩写，“—”表示GenBank中未登录该菌种的对应序列。

注：表中“L.”为“Lecanicillium”的缩写。

真菌的18S rDNA、ITS1-5.8S rDNA-ITS2和β-tubulin等基因通常被作为真菌分类鉴定和系统演化关系分析的主要依据。但由于18S rDNA变异率较低，而不适合大多数真菌类群的物种鉴定；而β-tubulin基因因其既具有保守的外显子又有许多可变的内含子，因此常被作为标识片段用作真菌的物种鉴定；ITS基因变异率高，被广泛应用于真菌的物种鉴定和低分类等级的系统演化关系分析，是目前真菌物种分辨率最高的单一DNA片段，是用于真菌鉴定首选的DNA条形码，并以相似性97%作为大家普遍接受的种间序列阈值（参考文献：张宇, 郭良栋. 真菌DNA条形码研究进展. 菌物学报, 2012, 31(6):809-820）。本发明所述的菌株ZJLSP07的ITS1-5.8S rDNA-ITS2序列与蜡蚧菌属真菌的对应序列相似性最高仅为93.9%，远低于97%这一真菌种间序列相似性这一阈值；并且其β-tubulin基因的DNA序列与GenBank中已登录菌种的相似性也较低；菌株ZJLSP07具备蜡蚧菌属真菌的典型特征，但其与该属已知菌种的形态特征又存在差别，如与菌株ZJLSP07亲缘关系最近的Lecanicilliumkalimantanense菌种的瓶梗大小为12.5-36×1-2 μm，分生孢子大小为（3.5-）4.5-12×1-2 μm，有别于菌株ZJLSP07。

综合以上研究和分析结果，依据相关文献（Zare R, et al. A revision of Verticillium section Prostrata. I. Phylogenetic studies using ITS sequences. Nova Hedwigia, 2000, 71:465–480; Zare R, et al. A revision of Verticillium section Prostrata. IV. The genera Lecanicillium and Simplicillium gen nov. Nova Hedwigia, 2001, 73:1–50; Zare R, et al. A revision of the Verticillium fungicola species complex and its affinity with the genus Lecanicillium. Mycological Research, 2008, 112:811-824; Sukarno N, et al. Lecanicillium and Verticillium species from Indonesia and Japan including three new species. Mycoscience, 2009, 50:369-379; Kaifuchi S, et al. Lecanicillium primulinum, a new hyphomycete (Cordycipitaceae) from soils in the Okinawa's main island and the Bonin Islands, Japan. Mycoscience, 2013, 54:291-296.）关于蜡蚧菌属真菌分类和鉴定标准，我们确定菌株ZJLSP07为肉座菌目虫草菌科蜡蚧菌属真菌的一个新种，将其命名为蜡蚧菌ZJLSP07。

实施例3：蜡蚧菌ZJLSP07的生物学特性

1、不同温度对蜡蚧菌ZJLSP07生长的影响：以无菌打孔器于在PDA培养基上培养7 d左右的蜡蚧菌ZJLSP07的菌落周围打取5 mm大小的菌饼，然后将菌饼分别置于数个新鲜制备的PDA平板（直径为9 cm）中央，分别于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃和40℃微生物培养箱中倒置培养，每个温度下设3个重复。培养14 d，每24 h观察菌落生长情况并采用十字交叉法记录菌落直径。

结果见表3，可以看出，蜡蚧菌ZJLSP07在PDA培养基上于10℃~35℃的温度下均可生长，其中25℃和30℃时菌丝生长速率明显高于其他温度，10℃蜡蚧菌ZJLSP07生长极为缓慢，5℃低温和40℃高温下菌落不生长，因此确定25℃~30℃为蜡蚧菌ZJLSP07适宜生长温度。

2、不同光照条件对蜡蚧菌ZJLSP07生长的影响：以无菌打孔器于在PDA培养基上培养7 d左右的蜡蚧菌ZJLSP07的菌落周围打取5 mm大小的菌饼，然后将菌饼分别置于数个新鲜制备的PDA平板（直径为9 cm）中央，于25℃培养箱中分别在0 h/d、12 h/d和24 h/d光照条件下培养，连续培养14 d，每24 h观察并记录菌落直径。

结果如表4，可以看出，蜡蚧菌ZJLSP07在不同光照条件下均生长良好，光照时间长短对蜡蚧菌ZJLSP07的生长影响不显著。

3、不同培养基对蜡蚧菌ZJLSP07生长的影响：配制马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基（配制方法同上）、马铃薯蔗糖琼脂（PSA）培养基（配制方法同PDA培养基，只将其中的葡萄糖替换为蔗糖）、沙氏葡萄糖酵母浸膏琼脂（SDAY）培养基（酵母浸膏10 g、葡萄糖40 g、蛋白胨10 g、琼脂20 g、蒸馏水1 L，pH6.0）、察氏（CDA）培养基（硝酸钠3 g、磷酸氢二钾1 g、七水硫酸镁0.5 g、氯化钾0.5 g、硫酸亚铁0.01 g、蔗糖30 g、琼脂15 g、蒸馏水1 L，pH7.3）、麦芽浸膏琼脂（MEA）培养基（麦芽浸粉30 g、大豆蛋白胨3 g、琼脂15 g、蒸馏水1 L，pH5.6）、LCA培养基（葡萄糖 1 g、磷酸二氢钾1 g、七水硫酸镁0.2 g、氯化钾0.2 g、硝酸钠2 g、酵母粉0.2 g、琼脂15 g、蒸馏水1 L，pH6.6-7.0）和沙氏葡萄糖琼脂（SDA）培养基（蛋白胨10 g、葡萄糖40 g、琼脂15 g、蒸馏水1 L，pH5.6）。上述配制的培养基经高压灭菌后于超净工作台下制备培养基平板，以无菌打孔器于培养7 d左右的蜡蚧菌ZJLSP07的菌落周围打取5 mm大小的菌饼，然后将菌饼分别置于上述各培养基平板中央，将培养皿密封后置于培养箱中暗培养，每隔一天观察菌落生长情况并采用十字交叉法记录菌落直径。在第7 d观察并记录蜡蚧菌ZJLSP07在各培养基上的培养特征。

从表5可以看出蜡蚧菌ZJLSP07在上述各培养基上均生长良好，其中LCA培养基上蜡蚧菌ZJLSP07的生长速度最快，而在PSA培养基上生长速度最慢。在PDA培养基上，ZJLSP07菌落呈圆形，菌落正面为白色丝绒状，菌落背面呈浅黄色，具放射状皱褶，无渗出液和色素产生；除LCA培养基外，蜡蚧菌ZJLSP07在其他培养基上菌丝生长致密，背面有放射状皱褶。详见表6。

4、不同培养基对蜡蚧菌ZJLSP07产孢量的影响：配制马铃薯葡萄糖（PD）液体培养基、马铃薯蔗糖（PS）液体培养基、沙氏葡萄糖酵母浸膏（SDY）液体培养基、察氏（CD）液体培养基、麦芽浸膏（ME）液体培养基和沙氏葡萄糖（SD）液体培养基（除不加琼脂外，配方分别同上述PDA、PSA、SDAY、CDA、MEA、SDA培养基）。挑取新鲜培养的蜡蚧菌ZJLSP07的菌块接种至装有PD培养液（120 mL/瓶）的锥形瓶中，置25℃摇床上振荡培养（150 rpm/min）2 d，作为种子培养液。然后分别取1 mL种子培养液加入到装有PD、PS、SDY、CD、ME和SD培养液的锥形瓶中（120 mL/瓶），每个处理设3次重复，置25℃摇床振荡培养（150 rpm/min），每24 h取少量培养液滴在血球计数板上在光学显微镜下观察并记录孢子数量，然后计算各培养基中孢子的浓度。在培养后第7 d，离心收集各培养液中的菌体沉淀，于恒温干燥箱中烘干水分，用分析天平称量菌丝干重。

测定结果如表7，可以看出通常在接种后3~4 d，蜡蚧菌ZJLSP07在各培养基中的孢子浓度达到最高，之后逐渐呈下降趋势。在接种后第2 d和3 d，蜡蚧菌ZJLSP07在SD和SDY培养基中的孢子浓度均高于其他各培养基，且在第2 d至第6 d，蜡蚧菌ZJLSP07在SDY培养基中的孢子浓度一直维持在10⁸数量级。因此，将SDY和SD培养基确定为蜡蚧菌ZJLSP07的最佳产孢培养基。在培养后第7 d，产孢量最小的CD培养基中蜡蚧菌ZJLSP07的菌丝重量最高，为31.9 mg/mL；而产孢量最高的SDY培养基中蜡蚧菌ZJLSP07的菌丝重量最低，为3.8 mg/mL。

5、不同温度和时间对蜡蚧菌ZJLSP07孢子萌发率的影响：以PD液体培养基洗脱于PDA上培养的蜡蚧菌ZJLSP07的分生孢子配制成分生孢子悬浮液，分别取30 μL孢子悬浮液滴加至各无菌载玻片的中央，然后置于5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃和40℃培养箱中暗培养，每个温度条件设3个重复。对于25℃下培养的分生孢子悬浮液，每1 h在显微镜下镜检1次，每次计数400~600个孢子，以芽管长度超过孢子长度1/2为标准视为孢子萌发，统计孢子萌发个数并计算孢子萌发率。对于其他温度下的孢子悬浮液，只在培养8 h后镜检计数1次。

结果见表8和表9，可以看出，蜡蚧菌ZJLSP07的分生孢子在10℃~35℃的温度条件下均能萌发，其中在25℃和30℃下孢子萌发率最高，5℃和40℃下蜡蚧菌ZJLSP07培养8 h也未见有孢子萌发。因此，确定25℃~30℃为蜡蚧菌ZJLSP07孢子萌发的适宜温度。

实施例4：蜡蚧菌ZJLSP07对柑橘木虱的致病性测定

1、蜡蚧菌ZJLSP07对柑橘木虱的致死中浓度和致死中时间：将蜡蚧菌ZJLSP07接种至SD液体培养基（蛋白胨10 g、葡萄糖40 g、蒸馏水1 L，pH5.6）中，于25℃恒温摇床振荡培养（150 rpm/min）3 d后，培养的菌液经由无菌纱布过滤除去菌丝体，收集分生孢子悬浮液，以无菌水进行系列稀释，获得浓度分别为1.0×10⁸ spores/mL、1.0×10⁷ spores/mL、1.0×10⁶ spores/mL、1.0×10⁵spores/mL、1.0×10⁴ spores/mL的分生孢子悬浮液，并向其中加入适量的吐温-80至终浓度为0.1%。按实施例1所述将健康柑橘木虱放于上述各浓度的含0.1%吐温-80的分生孢子悬浮液中浸润处理，之后放于25℃光照培养箱中（每天14 h光照/10 h黑暗，湿度95%以上）培养，同时设立以含0.1%吐温-80的无菌水处理柑橘木虱为对照。以上每个处理设3个重复，每个重复处理30头柑橘木虱。从培养第2 d开始每天观察病菌对柑橘木虱的侵染和致死情况，记录柑橘木虱死亡数目，按如下公式计算死亡率和校正死亡率，所得数据通过SAS软件进行回归分析，得到回归方程和相关系数r，计算致死中浓度（LC₅₀）和致死中时间（LT₅₀）。

测定结果显示，蜡蚧菌ZJLSP07的分生孢子悬浮液浓度越高，对柑橘木虱的致病效果越好。在同一浓度条件下，接种后培养时间越长，柑橘木虱的死亡率越高。接种后第3 d，蜡蚧菌ZJLSP07对柑橘木虱的LC₅₀为5.25×10⁹ spores/mL，第7 d则仅为1.14×10⁴ spores/mL。分生孢子悬浮液浓度越高，蜡蚧菌ZJLSP07对柑橘木虱的LT₅₀也越短，浓度为1.0×10⁴ spores/mL的分生孢子悬浮液对柑橘木虱的LT₅₀为7.18 d，而浓度为1.0×10⁸spores/mL的孢子悬浮液的LT₅₀仅为3.25 d。

2、蜡蚧菌ZJLSP07对柑橘木虱的侵染过程：如上所述制备蜡蚧菌ZJLSP07的分生孢子悬浮液并接种柑橘木虱，于25℃光照培养箱中（每天14 h光照/10 h黑暗，湿度95%以上）培养不同时间后取样。取其中部分柑橘木虱样品置于体视显微镜下直接观察昆虫体表的菌丝生长情况。取其中部分柑橘木虱样品固定于4%的多聚甲醛溶液中，经石蜡切片后，将超薄切片放入苏木精-伊红（HE）染色液或六胺银（GMS）染色液中染色处理后，置于光学显微镜下观察蜡蚧菌ZJLSP07对柑橘木虱的侵染情况及菌丝在木虱体腔内的分布；另外，取部分柑橘木虱样品于2.5%戊二醛溶液中固定，清洗、干燥、喷金等处理后，放于扫描电子显微镜下观察蜡蚧菌ZJLSP07的孢子在木虱体表的附着和萌发情况。以上操作参照方中达（方中达. 植病研究方法（第三版）. 北京:中国农业出版社, 1998）及Leemon和Jonsson（Leemon D M, Jonsson N N. Comparative studies on the invasion of cattle ticks (Rhipicephalus (Boophilus) microplus) and sheep blowflies (Lucilia cuprina) by Metarhizium anisopliae (Sorokin) . Journal of Invertebrate Pathology, 2012, 109: 248-259）的方法进行。

将处理后的柑橘木虱培养2 d后，即可通过体视显微镜观察到昆虫体表有菌丝产生，之后虫体上的菌丝不断生长增殖。图4为培养5 d后在体视显微镜下观察蜡蚧菌ZJLSP07对柑橘木虱的侵染情况，可见柑橘木虱已被侵染致死，白色菌丝已几乎覆盖整个昆虫虫体。通过对柑橘木虱样品的扫描电子显微镜观察，可以看到在接种初期蜡蚧菌ZJLSP07的分生孢子附着柑橘木虱体表，之后分生孢子在虫体上萌发出芽管或产生附着胞侵入木虱体内；至后期，柑橘木虱体表被蜡蚧菌ZJLSP07大量的菌丝覆盖，并产生新的分生孢子梗和分生孢子（如图5所示）。通过对柑橘木虱超薄切片的显微镜观察，可以看到蜡蚧菌ZJLSP07通过芽管或附着胞穿透木虱体表侵入木虱体内后，在体腔内不断增殖，48 h后可见蜡蚧菌ZJLSP07的大量菌丝分布在昆虫体腔内（如图6所示）。

3、蜡蚧菌ZJLSP07对柑橘木虱的防治应用：取健康柑橘木虱放于养虫笼内的盆栽九里香幼苗上（1个养虫笼内放置1株九里香幼苗，1株九里香幼苗上放柑橘木虱30头，设5个重复），按上述操作制备含0.1%吐温-80的浓度为1.0×10⁸ spores/mL的蜡蚧菌ZJLSP07的分生孢子悬浮液，通过小型喷雾器对九里香上的柑橘木虱均匀喷雾，至昆虫体表完全湿润。以分离自柑橘木虱的与蜡蚧菌ZJLSP07同属的蜡蚧轮枝菌（Lecanicillium lecanii）菌株作为对比菌株，制备与蜡蚧菌ZJLSP07同浓度的孢子悬浮液并处理柑橘木虱。此外，以含0.1%吐温-80的无菌水处理柑橘木虱作为对照。上述各处理完成后，将养虫笼放入玻璃温室内，控制温室内温度为25℃~30℃，湿度为90%以上，每天14 h光照/10 h黑暗。于处理后第3 d、第6 d和第9 d观察并记录上述各处理的柑橘木虱的总虫数和死亡虫数，计算死亡率和校正死亡率。

以浓度为1.0×10⁸ spores/mL的蜡蚧菌ZJLSP07的分生孢子悬浮液处理的柑橘木虱，在第3 d、第6 d和第9 d的校正死亡率分别32.65%、69.6%和100%，而以同浓度的蜡蚧轮枝菌的分生孢子悬浮液处理的柑橘木虱的校正死亡率分别为25.33%、56.67%和81.33%。可以看出，本发明提供的蜡蚧菌ZJLSP07较同属的蜡蚧轮枝菌菌株对柑橘木虱具有更强的作用效果。

序列表

<110> 浙江省柑桔研究所 

<120>一种对柑橘木虱具致病力的蜡蚧菌属真菌新种

<160> 3

<170> PatentIn Version 3.3 

<210> 1 

<211> 550

<212> DNA 

<213> 蜡蚧菌（Lecanicillium sp.）

<400> 1

gtagtcatat gcttgtctca aagattaagc catgcatgtc taagtataag caattataca      60

gcgaaactgc gaatggctca ttatataagt tatcgtttat ttgatagtac cttactactt     120

ggataaccgt ggtaattcta gagctaatac atgctaaaaa tcccgacttc ggaagggatg     180

tatttattag attaaaaacc aatgccctct gggctctttg gtgattcatg ataacttctc     240

gaatcgcacg gccttgcgcc ggcgatggtt cattcaaatt tcttccctat caactttcga     300

tgtttgggta ttggccaaac atggttgcaa cgggtaacgg agggttaggg ctcgaccccg     360

gagaaggagc ctgagaaacg gctactacat ccaaggaagg cagcaggcgc gcaaattacc     420

caatcccgac acggggaggt agtgacaata aatactgata cagggctctt ttgggtcttg     480

taattggaat gagtacaatt taaatccctt aacgaggaac aattggaggg caagtctggt     540

gccagcagcc                                                                       550

<210> 2 

<211> 521

<212> DNA 

<213> 蜡蚧菌（Lecanicillium sp.）

<400> 2

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<210> 3

<211> 365

<212> DNA 

<213> 蜡蚧菌（Lecanicillium sp.）

<400> 3

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SEQUENCE LISTING

<110> 浙江省柑桔研究所

<120>一种对柑橘木虱具致病力的蜡蚧菌属真菌新种

<160> 3

<170> PatentIn Version 3.3

<210> 1

<211> 550

<212> DNA

<213> 蜡蚧菌（Lecanicillium sp.）

<400> 1

gtagtcatat gcttgtctca aagattaagc catgcatgtc taagtataag caattataca      60

gcgaaactgc gaatggctca ttatataagt tatcgtttat ttgatagtac cttactactt     120

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taattggaat gagtacaatt taaatccctt aacgaggaac aattggaggg caagtctggt     540

gccagcagcc                                                                       550

 

<210> 2

<211> 521

<212> DNA

<213> 蜡蚧菌（Lecanicillium sp.）

<400> 2

ccgagtttac aactcccaaa cccatgtgaa cataccttac agttgcttcg gcggagccgc      60

cccggcgccc ggaacccagt ttcgcggccc ggaccaaggc gcccgccgga ggccacaaac     120

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acccccaact tccgaatgtt gacctcgaat caggtaggaa t                             521

 

 

<210> 3

<211> 365

<212> DNA

<213> 蜡蚧菌（Lecanicillium sp.）

<400> 3

ggtaaccaaa tcggtgctgc tttctggcag accatttctg gcgagcacgg cctcgacagc      60

aatggtgtct acaatggcac ttctgagctc cagctcgagc gcatgagcgt ctacttcaac     120

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tcgagcccgg taccatggac gccgtccgtg ccggtccttt cggtcagctc ttccgccccg     300

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agggt                                                                             365

 

Claims (2)

1.一种对柑橘木虱具致病力的蜡蚧菌属真菌新种，其特征在于该真菌菌株为蜡蚧菌（Lecanicilllium sp.）ZJLSP07，已于2013年6月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心登记保藏，保藏编号为CGMCC No.7803。

2.如权利要求1所述的蜡蚧菌属真菌新种，其特征在于制备用于防治柑橘木虱的生物药剂。