CN113957003B - 一种抗真菌的吸水链霉菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种吸水链霉菌，命名为吸水链霉菌PA‑4，于2021年5月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.61679。该菌株具有稳定广谱抑菌活性，对尖孢镰刀菌属、炭疽菌属、隐从赤壳属、棒孢属、链格孢属、镰孢属等的多种常见作物病原真菌有较强的抑菌作用，其发酵粗提物能够影响Foc4菌丝体、孢子等的正常生长发育，对Foc4病菌具有毒杀或者抑制的作用，此外，本发明的吸水链霉菌还能抑制病原菌侵染植物根系，促进植物生长的作用，为枯萎病等多种植物病害的防治、促进植物生长等方面拓展新领域，具有良好的开发应用前景。

Description

一种抗真菌的吸水链霉菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，特别涉及一种抗真菌的吸水链霉菌及其应用。
背景技术
香蕉是芭蕉科芭蕉属植物，主要分布在热带和亚热带，是世界上产量和贸易最重要的水果之一。全球香蕉年产量约1.48亿吨，其主产区为亚洲和中南美洲，是世界上产量仅次于柑橘的第二大水果作物，为全球约4亿人口提供了主食。中国是世界上香蕉第四大主产国，2017年产量为1116.98万吨。香蕉在国内市场占有重要地位，不仅是我国非常受欢迎的水果，在出口产品中也占有重要位置。在香蕉产业不断发展，逐渐取得一定成效时，香蕉枯萎病在各香蕉种植区蔓延开来，导致传统香蕉种植面积急剧缩减，甚至出现丢荒改种等现象，给香蕉产业带来重大经济损失。
香蕉枯萎病(Fusarium wilt of banana)是由尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusariumoxysporum f.sp.cubense，Foc)侵染所引起的一种土传病害。由于其高发病率、破坏性大和传播迅速，已严重威胁着世界香蕉行业的的健康发展。目前，香蕉枯萎病主要发生在热带和亚热带地区的香蕉主产区，在中国、印度尼西亚、马来西亚、菲律宾、澳洲、印度、巴基斯坦、以色列和黎巴嫩等国均有出现，给蕉农带来严重的经济损失，而且还有不断扩大的趋势。香蕉枯萎病不但传播迅速，而且传播途径广，可直接通过已发病的蕉园土壤和带病种苗进行扩散，还可通过不规范的农事操作进行传播和转移病菌(如使用未消毒的工具、在对蕉园进行灌溉时不实行分流等)，线虫和人员走动等近距离传播也会加快病原菌的扩散。
尖孢镰刀菌通过感染香蕉的根部，可向上扩散蔓延至香蕉假茎及叶部。在侵染的过程中会产生毒素和胶状类物质，使维管束的细胞出现褐化、坏死、病变等，导致维管束组织阻塞，造成水分与营养物质的传输被阻断；另外毒素还会影响植物相关防御酶的正常生理代谢作用，最终导致香蕉出现黄叶和全株干枯死亡。香蕉枯萎病菌主要有4个生理小种，而4号生理小种对香蕉的危害最大，可以感染所有的香蕉品种。香蕉枯萎病难以防控的原因如下：(1)这是一种土壤传播的真菌，在土壤中可长时间存活(30年)；(2)它是一种维管病原体，一旦侵入植物，非系统杀菌剂、非内生生物防治等就难于防控；(3)可通过香蕉营养繁殖材料、工人和机械引导的土壤、灌溉用水等进行传播。香蕉镰刀菌侵染香蕉后会出现以下症状：老叶先黄化，香蕉根部的假茎出现破裂，新叶难于抽出且抽出后也会慢慢黄化，直至整株香蕉枯死。
香蕉枯萎病由于其高发病率、破坏性大和传播迅速，给蕉农带来严重的经济损失，而且还有不断扩大的趋势，已严重威胁着世界香蕉行业的的健康发展。在化学防治难以奏效和没有较好的抗病品种培育出来之前，生物防治被认为是目前最为有效的方法之一。而绝大多数的生防菌是从植物或者土壤中分离筛选得到的，因此寻找新型无公害的生防菌防治香蕉枯萎病已成为当务之急。内生放线菌广泛存在于药用植物组织中，具有丰富的物种多样性，是植物微生态系统的重要组成部分。目前五指山自然保护区药用植物内生放线菌尚未有人研究，这类未知的待开发资源在医药卫生、生物防治和促进植物生长方面具有很大的应用潜力，为香蕉枯萎病害的防控提供新的生防资源。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种分离自五指山自然保护区药用植物的吸水链霉菌，具有稳定广谱拮抗活性，对尖孢镰刀菌等多种常见作物病原真菌有较强的抑菌作用。
本发明的第一个方面是提供一种吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicussubsp.hygroscopicus)，其命名为吸水链霉菌PA-4，于2021年5月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCCNo.61679。
本发明的第二个方面是提供本发明第一个方面所述的吸水链霉菌PA-4在拮抗香蕉枯萎病菌4号生理小种(Fusarium oxysporum f.sp.Cubense Race 4，Foc4)、香蕉枯萎病菌1号生理小种(Fusarium oxysporum f.sp.Cubense race1，Foc1)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp cucumerinum)、番茄枯萎病(Fusarium oxysporumf.sp.Lycopersici)、辣椒炭疽病菌(Colletotrichum acutatum)、草莓炭疽病菌(Colletotrichum fragariae)、荔枝炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)、小麦赤霉病菌(FusaHum graminearum)、芒果链格孢霉叶斑病菌(Alternaria tenuissima)、水稻稻曲病菌(Ustilaginoidea oryzae)、水稻稻瘟病菌(Pyricularia oryae Cav)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、香蕉长形斑病菌(Curvularia fallax)和/或香蕉大灰斑病菌(Curvularia lunata)中的应用。
本发明的第三个方面是提供本发明第一个方面所述的吸水链霉菌PA-4、第一个方面所述的吸水链霉菌PA-4的发酵液和/或发酵粗提物在制备防治香蕉枯萎病菌4号生理小种、香蕉枯萎病菌1号生理小种、黄瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌、辣椒炭疽病菌、草莓炭疽病菌、荔枝炭疽病菌、板栗疫病菌、小麦赤霉病菌、芒果链格孢霉叶斑病菌、水稻稻曲病菌、水稻稻瘟病菌、灰葡萄孢菌、香蕉长形斑病菌和/或香蕉大灰斑病菌所致病害的生防制剂中的应用。
进一步的，所述发酵液为将吸水链霉菌PA-4接种于发酵培养基进行发酵培养所得。
进一步的，所述发酵培养基包括可溶性淀粉21.512g/L，NaCl4.734g/L，pH为7.0。
进一步的，所述发酵培养基还包括黄豆粉15g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨2g/L，CaCO34g/L。
进一步的，所述发酵培养的接种量为3.217％，发酵时间为7d，摇床转速为200rpm。
进一步的，所述发酵粗提物为吸水链霉菌PA-4的发酵液经乙醇萃取、除菌丝、除去乙醇后的粗取物。
进一步的，所述发酵粗提物为用无水乙醇萃取吸水链霉菌PA-4的发酵液，萃取结束后，过滤去除菌丝，将滤液旋转蒸发至无无水乙醇所得发酵粗提物，其中无水乙醇的加入量本发明不作特别限制，本领域技术人员根据经验添加，只要能萃取出发酵液中的活性成分即可，在本发明一个优选的实施方式中，无水乙醇的加入量与发酵液的体积比为1:1。
本发明的第四个方面是提供本发明第一个方面所述的吸水链霉菌PA-4、第三个方面所述的吸水链霉菌PA-4的发酵液和发酵粗提物在制备促进植物生长的生防制剂中的应用。
进一步的，所述生防制剂包括吸水链霉菌PA-4、吸水链霉菌PA-4的发酵液和/或发酵粗提物。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明的吸水链霉菌PA-4具有稳定广谱抑菌活性，对香蕉枯萎病菌4号生理小种、香蕉枯萎病菌1号生理小种、黄瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌、辣椒炭疽病菌、草莓炭疽病菌、荔枝炭疽病菌、板栗疫病菌、小麦赤霉病菌、芒果链格孢霉叶斑病菌、水稻稻曲病菌、水稻稻瘟病菌、灰葡萄孢菌、香蕉长形斑病菌、香蕉大灰斑病菌等多种常见作物病原真菌有较强的抑菌作用，其发酵粗提物能够影响Foc4菌丝体、孢子等的正常生长发育，对Foc4病菌具有毒杀或者抑制的作用。
更进一步的，本发明的吸水链霉菌还能抑制病原菌侵染植物根系，促进植物生长的作用，为枯萎病等多种植物病害的防治、促进植物生长等方面拓展新领域，具有良好的开发应用前景。
附图说明
图1为本发明吸水链霉菌PA-4的扫描电镜图；
图2为本发明吸水链霉菌PA-4的16S rDNA的PCR扩增及其系统发育进化树；(a)为菌株PA-4基因组DNA扩增的16S rDNA电泳检测图；(b)为菌株PA-4系统发育树；
图3为本发明吸水链霉菌PA-4的发酵粗提物对香蕉枯萎病菌孢子萌发的影响；
图4为600μg/mL浓度的吸水链霉菌PA-4发酵粗提物对香蕉枯萎病菌孢子萌发的影响；(a)为未处理的孢子；(b-d)为经过发酵粗提物处理3d后的孢子；
图5为本发明吸水链霉菌PA-4发酵粗提物对香蕉枯萎病菌菌丝生长的抑制作用；
图6为本发明吸水链霉菌PA-4发酵粗提物对Foc4病菌平皿菌丝的溶解作用；
图7为本发明吸水链霉菌PA-4发酵粗提物处理后香蕉枯萎病菌菌丝形态的扫描电镜观察；(a)为未处理的Foc4菌丝；(b-d)为经过菌株PA-4粗提物处理的Foc4菌丝；
图8为本发明吸水链霉菌PA-4对香蕉枯萎病温室防治效果。
图9为不同处理GFP-Foc4的定殖状况；
图10为不同时间不同处理的香蕉盆栽苗生长特性的变化；
图11为香蕉苗移栽105d后不同处理的叶面积；
图12为本发明PA-4菌株与其它链霉菌发酵提取物对Foc4病菌菌丝生长的抑制作用比对图；
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，结合附图，对本发明做进一步的说明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
本发明提供了一种抗真菌的吸水链霉菌，其命名为吸水链霉菌PA-4(下文简称“链霉菌PA-4”、“放线菌PA-4”、“菌株PA-4”、“PA-4”等)，于2021年5月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No.61679。本发明的吸水链霉菌从海南省五指山自然保护区采集的药用植物中分离、筛选得到。
实施例1菌株的分离鉴定及抗菌活性筛选
1.1供试材料
1.1.1药用植物样品采集
药用植物标本采集自2016年8月海南省五指山自然保护区(表1-1)。采集了35种健康植物样本，包括根、茎和叶等。样品保存在无菌塑料袋中，4℃保存。
表1-1药用植物样品及采样地理位置
Figure GDA0003953276420000061
Figure GDA0003953276420000071
1.1.2供试培养基
供试培养基主要有分离培养基(表1-2)、形态学观察培养基(表1-3)和生理生化特性培养基(表1-4)等。
表1-2放线菌的分离培养基及其配方
Figure GDA0003953276420000072
表1-3培养特征观察培养基及其配方
Figure GDA0003953276420000081
表1-4生理生化特性观察所需的培养基
Figure GDA0003953276420000082
1.1.3供试病原菌
香蕉枯萎病菌4号生理小种(Fusarium oxysporum f.sp.cubense race 4，Foc4)，用于抗镰刀菌活性放线菌的筛选及抑菌活性测定，为中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供的菌种。
1.1.4实验试剂与仪器设备
表1-5主要生化试剂及来源
试剂名称 生产厂家
细菌基因组DNA快速提取试剂盒 北京百泰克生物技术有限公司
2xTaqPCR MasterMix 博迈德生物公司
DNA marker 北京康为世纪生物科技有限公司
琼脂糖 Promega Co.Ltd.
表1-6仪器与设备
仪器 型号 产商
生化培养箱 SHP-450 上海精宏仪器制造有限公司
超净工作台 SW-CF-1F 苏州苏洁淨化设洛有限公司
电恒温鼓风干燥箱 DHG-9140A 上海一恒科学仪器有限公司
电子分析天平 AL204 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司
pH计 Delta 320 Mettler-Toledo Instruments
冷藏冷冻冰箱 BCD-539WT 海尔有限公司
恒温摇床 ZWYR-D2403 上海智城公司
高压蒸汽灭菌锅 HVE-2510 HIRAYAMA，Japan
恒温水浴锅 9112 PolyScience，USA
台式冷冻离心机 Centrifuge 5417R Eppendorf，Germany
PCR扩增仪 T1Thermocycle Biometra，Germany
水平电泳仪 DYY-8C 北京市六一仪器厂
凝胶成像分析系统 UVP EC3 UVP，USA
漩涡振荡器 HMQL-VORTEX-5 江苏海门市其林贝尔仪器制造商有限公司
1.2实验方法与结果
1.2.1药用植物样品采集及保存
在采集药用植株时尽量不损伤植株。在样品采集后，轻轻把附着在植物根表的土壤去除，放入无菌塑料袋中，并记录每个样品的采集信息。样品采集后置于4℃保存，应尽快进行内生放线菌的分离。
1.2.2药用植物内生放线菌的分离与纯化
用自来水轻轻冲洗样品，将表面杂质冲洗干净，然后再用无菌水清洗一遍，利用滤纸吸干其表面水分。称取1g药用植物，依次用70％乙醇浸泡5min；0.9％NaClO浸泡10min；10％ NaHCO3漂洗10min；最后用无菌水冲洗5次，滤纸上干燥。取200μL最后一次清洗的无菌水，均匀涂布于分离培养基上，作为表面消毒效果的对照，于28℃培养30d，观察有无菌落长出。采用植物匀浆涂布法，把表面消毒过的样品进行研磨，加入2mL预培养液涡旋振荡，30℃下250rpm振荡过夜，静置，取匀浆200μL均匀的涂布于分离培养基上，于28℃培养1-3周，试验设3次重复。根据放线菌菌落的颜色和形态不同以及生长时间的差异，采用培养基划线分离法挑取明显分开的单菌落，在YE培养基上进行放线菌的纯化。记录纯化好的放线菌菌落形态后，进行菌种保藏。
通过对采集自五指山的35种药用植物进行放线菌的分离纯化。采用传统形态分类法分析比较去重复，主要根据菌落在平板上的形状、颜色、是否放射状、表面是否褶皱等特征进行判断(闫建芳，2018)，最后共分离到144株内生放线菌。分离所获得的放线菌菌落大部分为白色、灰色、黑色和黄色，表面干燥，多为有褶皱、呈圆形等特征。
1.2.3内生放线菌的抑菌活性筛选
初筛：以香蕉枯萎病菌为靶标菌，采用平板对峙培养法(孙建波，2010)测定放线菌的拮抗活性。使用直径为5mm的打孔器取长势一致的Foc4病菌的菌饼，接于每个PDA平板的中间，分别在距病原菌菌落2.5cm处接4个纯化好的放线菌，置于28℃的培养箱中倒置培养5-7d，以只接种Foc4的病菌作为对照，观察结果。试验结果表明，对Foc4病菌具有抑菌作用有43株内生放线菌，其中8株内生放线菌的抑菌活性较强。结合菌株的形态表型，发现具有抑菌活性的菌株大多为链霉菌属(Streptomyces)，其中有少数稀有放线菌具有抑菌活性。
复筛：将初筛具有较好拮抗活性的放线菌接种于含有100mL黄豆粉液体培养基(SLM)的三角瓶(250mL)中，于28℃，200r/min恒温摇床上培养7d。以1:1(v:v)加入无水乙醇进行混合、萃取活性粗提物，滤纸过滤菌丝，旋转蒸发，得到发酵粗提物，备用。采用滤纸片法(张佳等，2009)测定放线菌发酵粗提物对Foc4的抑菌活性。将滤纸片完全浸泡在发酵粗提物中，取出风干。在距供试病原菌菌饼的2.5cm处，分别贴上4片含有发酵液的滤纸片，以只接种供试病原菌作为对照，每个处理三个重复，于28℃下倒置培养7d。
结果显示，菌株PA-4(分离于Piper austrosinense的根部)对香蕉枯萎病菌的有良好抑菌效果。
1.2.4拮抗放线菌的鉴定
1.2.4.1培养特征及生理生化鉴定
1.2.4.1.1培养特征
通过参照国际链霉菌规划中关于放线菌的培养特征描述所采用的标准培养基进行培养特征的观察(Cui BS，2008)。将拮抗放线菌接种于ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、ISP6、ISP7培养基上，于28℃培养7-21d后，分别观察并记录菌株在各培养基上的培养特征，包括菌落的形态、气生菌丝的产生、孢子的颜色以及基内菌丝的颜色等方面的特征。
将放线菌PA-4接种至ISP2、ISP3、ISP4、ISP5、ISP6、ISP7上进行培养，结果显示，放线菌PA-4的气生菌丝较丰富，在ISP2培养基上生长最好，形成了丰富的基内菌丝，在ISP4培养基上生长良好，在ISP6、ISP7培养基上生长一般，而在ISP3、ISP5上生长较弱。
1.2.4.1.2生理生化鉴定
参照Shirking(1966)和徐丽华等(2007)的方法对菌株进行生理生化鉴定，主要有以下方面。
(1)酶学特性的测定
①脲酶实验：
将菌株接种于脲酶培养基上，在28℃条件下培养4d后，观察培养基是否变色。测试供试菌株产生尿素酶的能力，培养基变成桃红色为阳性，不白色则为阴性。
②酯酶(吐温20、吐温80)实验：
划线接种至酯酶培养基上，培养1-2周，每天观察。如在其生长的周围有模糊的晕圈则为阳性，没有晕圈则为阴性。
③淀粉水解：
以营养琼脂为基本培养基，添加1.0％的可溶性淀粉。将供试菌株接种于平板上，采用点接法(接种直径不要超过5mm)，待菌株生长达到良好时，在菌落周围滴加碘液进行检测。若菌株周围产生透明圈，则说明有淀粉酶的产生，圈的大小表示淀粉酶活性的强弱；如不产淀粉酶，则呈蓝色。
④明胶液化：
将菌株接种于明胶培养基的表面，无需刺穿培养基，再28℃下培养，并分别在第5d、10d、20d和30d观察培养基的液化程度。观察前需将试管进行冷却20-30min或用自来水进行冲洗30min，才可以观察培养基的液化程度。
⑤纤维素分解：
将滤纸条的一端浸没在液体培养基当中，经灭菌后，将待测菌株接种在液面以上的滤纸片上，一个月后观察滤纸条是否被分解。
⑥硝酸盐还原：
待测菌株接种于硝酸盐还原培养基中，置28℃下培养7、14d，以不接菌的培养基为对照。在试管中分别加入少许培养了7d、14d的培养液，滴加一滴A液和B液，对照同样滴加。当溶液变成粉红、玫瑰红、橙色或棕色等，为硝酸盐还原阳性；若无红色出现时，滴加1或2滴二苯胺试剂，若呈蓝色，则还原作用为阴性；若不为蓝色，则仍按阳性对待。
(2)单一碳源利用实验
在放线菌鉴定当中，其重要的考察指标之一就是对碳源的利用情况，不同放线菌对糖、醇、有机酸、脂肪酸等的碳源利用能力各有不同。试验所选用的碳源：D-果糖、木糖、鼠李糖、阿拉伯糖、棉子糖、松三糖、无水乳糖、D-半乳糖、α-乳糖、D-海藻糖、D-甘露糖、D-核糖、肌醇、山梨醇、甘露醇、水杨苷、可溶性淀粉，按1％碳源浓度加入到普戈二氏的基础培养基中。并接入待测菌株，28℃下恒温培养7-14d，以不添加任何碳源的基础培养基接种的菌株作为空白对照，观察菌株的生长情况。若能生长，则表明该菌种能利用这种碳源；若不能生长，则表明该菌种不能利用此碳源。
(3)单一氮源利用实验
试验所选用的氮源：组氨酸、蛋氨酸、丝氨酸、草氨酸、甘氨酸、羟脯氨酸、苯基丙氨酸、谷氨酸、半胱氨酸、精氨酸、缬氨酸、四水合钼酸铵、乙酸铵、硝酸铵、硫酸铵，按0.5％的浓度加入基础培养基中。接入菌种，28℃下恒温培养7-14d，以不添加任何氮源的基础培养基接种的菌株作为空白对照，观察菌株的生长情况。若能生长，则表明该菌种能利用这种氮源；若不能生长，则表明该菌种不能利用此氮源。
(4)其他的一些生理生化指标的测定
①温度耐受实验：
将待测菌株接种于相同的培养基后，在其他培养条件均一致的情况下，分别在20℃、24℃、28℃、32℃、36℃下培养7-14d，观察并记录菌落的生长情况，从而确定菌株生长的最适温度。
②pH耐受实验：
在pH值为4、5、6、7、8、9、10的液体培养基内分别接种待测菌株，保证其他的培养条件一致，在28℃下培养，每隔一周都进行一次观察，一直观察到四周为止。每次观察并记录菌株生长情况，以确定菌株生长的最适pH。
③盐耐受性实验：
将待测菌株分别接种在不同浓度的NaCl(1％、3％、5％、7％、9％、11％、13％、15％)培养基上，培养基的其它营养成分均相同，在28℃条件下培养，7天为一个观察周期，观察4周，记录其是否能生长，以确定该菌株能耐受NaCl的上、下限浓度。
④硫化氢的产生实验：
将待测菌株接种于含有一定比例铵离子的硫化氢培养基上，在28℃条件下培养2周，如培养基呈现黑色，则有硫化氢的产生；无黑色，则无硫化氢的产生
鉴定结果显示，放线菌PA-4菌株能在pH为5.0-8.0之间生长，最佳的生长pH值为7.0，最适的生长盐浓度小于或等于9％。放线菌PA-4能使明胶液化，具有蛋白酶活性，对硝酸盐的还原和脲酶试验皆为阳性等生理生化特性。放线菌PA-4能通过利用蔗糖、葡萄糖、可溶性淀粉、天门冬酰胺、半胱氨酸、缬氨酸和羟基脯氨酸等碳氮源生长良好。
1.2.4.2菌株的扫描电镜观察
将盖玻片用0.05g/L浓度的重铬酸钾浸泡，使用酒精浸泡洗脱，再用超纯水进行冲洗，吹干，121℃灭菌20分钟。将放线菌PA-4接种到高氏一号培养基上，再将灭菌的盖玻片以45°插在高氏一号培养基上，28℃培养7-10天。送至检测中心进行扫描电镜的观察，将长有菌的盖玻片样品置于真空镀膜机内进行喷金镀膜，利用扫描电镜观察菌株的菌丝和孢子表面的细微结构，如图1所示。
结果显示，菌株PA-4的基内菌丝较发达，气生菌丝微弯，孢子链呈紧密螺旋状，表面皆有皱褶，综合其菌株形态特征，菌株PA-4呈现出典型的链霉菌形态特征。
1.2.4.3拮抗菌株分子生物学鉴定
①基因组DNA的提取：采用Bioteke的细菌基因组DNA快速提取试剂盒(DP1301，北京百泰克生物技术有限公司，中国)对菌株PA-4进行总DNA的提取。
②PCR扩增体系及程序：以放线菌基因组DNA为模板，采用通用引物27F和1492R进行PCR的扩增。引物序列如下：上游引物27F(5’AGAG TTTG ATCC TGGC TCAG 3’)、下游引物1492R(5’TACG GCTA CCTT GTTA CGAC TT 3’)。具体反应体系见表1-7，反应程序(周俊萍，2014；郝菲菲，2015；Na Yua，2014)见表1-8。
表1-7 PCR反应体系
Figure GDA0003953276420000141
Figure GDA0003953276420000151
表1-8 PCR反应程序
Figure GDA0003953276420000152
③PCR反应结束后，取5μL的PCR扩增产物在1％的琼脂糖凝胶上对菌株PCR产物进行电泳检测，根据目的片段的长度大小确定是否连接成功。
④测序及构建系统发育树：将菌株的PCR产物送至华大基因公司进行序列的测定。将测得的基因序列使用BLAST软件进行序列的对比，并与GenBank和EzBioCloud数据库中已知的16S rDNA进行同源性的比较。找出同源性较高的序列进行多重匹配排列分析，采用MEGA5.1软件以邻接法(Neighbor-Joining)进行聚类的分析和系统发育树的构建(Na Yua，2014；Jianghua，2015)
基因组DNA扩增的16S rDNA电泳检测的结果如图2a所示，经双向测通获得PA-4菌株序列(1524bp)。将菌株的序列分别在GeneBank和EzBioCloud数据库中进行同源性的比对，应用MEGA 5.1软件构建系统发育进化树。由图2b结果显示，菌株PA-4与Streptomyceshygroscopicus subsp.hygroscopicus NBRC 13472菌株的亲缘关系最近，16S rDNA序列相似度为99％，结合其培养特征和生理生化特性等方面与模式菌进行对比后，将PA-4菌株归属于吸水链霉菌吸水亚种(Streptomyces hygroscopicus subsp.hygroscopicus)，命名为吸水链霉菌PA-4。
实施例2菌株PA-4的抗菌活性测定
2.1供试材料
供试病原菌：香蕉枯萎病菌4号生理小种(Fusarium oxysporum f.sp.CubenseRace 4，Foc4)，辣椒炭疽病菌(Colletotrichum acutatum)、草莓炭疽病菌(Colletotrichum fragariae)、荔枝炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、板栗疫病菌(Cryphonectria parasitica)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.spcucumerinum)、番茄枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.Lycopersici)、香蕉枯萎病菌1号生理小种(Fusarium oxysporum f.sp.Cubense race1，Foc1)、小麦赤霉病菌(FusaHumgraminearum)、芒果链格孢霉叶斑病菌(Alternaria tenuissima)、水稻稻曲病菌(Ustilaginoidea oryzae)、水稻稻瘟病菌(Pyricularia oryae Cav)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、香蕉长形斑病菌(Curvularia fallax)、香蕉大灰斑病菌(Curvularia lunata)用于抗菌谱的测定。以上供试病原菌均为中国热带农业科学院环境与植物保护研究所保存的菌种。
培养基：Foc4菌体制备采用PDA培养基；链霉菌活化用YE培养基；发酵培养基为优化后的黄豆粉培养基(SLM)，黄豆粉培养基：可溶性淀粉21.512g/L，黄豆粉15g/L，酵母粉5g/L，蛋白胨2g/L，CaCO34g/L，NaCl4.734g/L，ddH2O余量，pH：7.0。
2.2实验方法与结果
2.2.1皿内抗菌谱的测定
采用平板对峙培养法(孙建波，2010；夏龙荪，2013)对链霉菌PA-4进行抗菌广谱性测定。与“1.2.3内生放线菌的抑菌活性筛选”的初筛方法相同。
采用对峙培养法测定链霉菌PA-4对15种病原真菌的抗菌谱，试验结果见表2-1。链霉菌PA-4对尖孢镰刀菌属(香蕉枯萎病菌1号生理小种、香蕉枯萎病菌4号生理小种、黄瓜枯萎病、番茄枯萎病)、炭疽菌属(荔枝炭疽病菌、辣椒炭疽病菌、草莓炭疽病菌)、绿核菌属(水稻稻曲病菌)、梨形孢属(水稻稻曲病菌)、隐从赤壳属(板栗疫病菌)、孢盘菌属(灰葡萄孢菌)、弯孢霉属(香蕉长形斑病、香蕉大灰斑病)、链格孢属(芒果链格孢霉叶斑病)、镰孢属(小麦赤霉病)9个属的15种病原真菌都表现出较好的拮抗活性。试验结果表明，链霉菌PA-4对供试病原真菌的抑菌率均在61.47％以上，均有一定的抑菌活性。其中链霉菌PA-4对板栗疫病菌的抑菌活性最好，抑菌率达到95.88％，且对Foc4病菌抑菌活性也较好，抑菌率达到83.18％。
表2-1平板对峙培养中链霉菌PA-4对15种病原菌菌丝生长的抑制作用
Figure GDA0003953276420000161
Figure GDA0003953276420000171
2.2.2链霉菌PA-4发酵粗提物对香蕉枯萎病菌生长的影响
将链霉菌PA-4接种于发酵培养基(优化后的黄豆粉培养基)中，于28℃，200r/min恒温摇床上培养7d。以1:1(v:v)加入无水乙醇进行混合、萃取活性粗提物，滤纸过滤菌丝，旋转蒸发，得到发酵粗提物，备用。
2.2.2.1粗提物对病原菌孢子萌发的影响
取一定量的发酵粗提物用PDB进行稀释，使发酵粗提液在培养基中稀释终浓度分别为6.25、12.5、25、50、100、200、400和600μg/mL(陈明，2018)。分别吸取100μL香蕉枯萎病的孢子悬浮液(107个/mL)加入到1mL稀释粗提物中，充分混匀。取50μL滴加在凹玻片上置于培养皿中，每个处理3个重复，28℃静置保湿培养6-8h，当空白对照孢子萌发率大于90％以上时，在显微镜下观察孢子萌发，以孢子芽管长度大于孢子的短半径视为萌发(韩丹丹，2018)。对于每个处理，计数200个孢子，按如下公式计算孢子萌发的抑制率(贾凤安等，2010)：
Figure GDA0003953276420000172
Figure GDA0003953276420000173
结果见图3和图4。由图3可知，随着发酵粗提物浓度的增加，分生孢子的萌发量显著降低，抑制率均达到了50％以上，且在600μg/mL和400μg/mL时，对香蕉枯萎病菌抑制率达到100％。病菌孢子在粗提物600μg/mL的浓度作用3d后，出现明显的肿胀、畸形和分歧的现象(图4)。
由此说明，链霉菌PA-4发酵粗提物对香蕉枯萎病菌分生孢子的萌发具有显著的抑制作用。
2.2.2.2发酵粗提物对香蕉枯萎病菌菌落生长的影响
采用菌丝生长速率法(廖敏，2016)测定链霉菌PA-4发酵粗提物的毒力回归方程。将发酵粗提物用少量无菌水溶解，使用无菌滤膜(直径为0.22μm)过滤除菌，与冷却至50℃左右的PDA培养基充分混匀，使培养基中发酵粗提物终浓度分别为500、250、100、50、25、12.5、5、2.5μg/mL，倒入培养基中，每皿25mL，待培养基晾干后备用。用打孔器(d＝0.5cm)取Foc4病菌菌饼，将菌饼接至含药平板中央，28℃恒温培养7d，同一处理重复3次(韩丹丹，2018)。采用十字交叉法测量菌落直径，计算EC50值、EC95值及毒力回归方程。
结果如图5所示，不同稀释倍数的发酵粗提物对Foc4菌落生长均有抑制活性，发酵粗提物的浓度与菌丝生长抑制呈正相关，浓度越大，抑制作用越强。由图5可以明显看出处理组气生菌丝生长明显受到抑制菌丝边缘色素增多，颜色加深。链霉菌PA-4发酵粗提物对抑制香蕉枯萎病菌菌丝生长的半致死浓度(EC50)为62.79μg/mL、95％致死浓度(EC95)为869.94μg/mL，其毒力回归方程为Y＝2.4094+1.4409X。
2.2.2.3链霉菌PA-4发酵粗提物对病原菌气生菌丝的溶解作用
将Foc4病菌接于PDA平板上，28℃下培养7d，待平皿培养基表面均匀长满气生菌丝后，分别吸取50μL浓度为EC50和EC95的链霉菌PA-4发酵粗提物，轻轻将其滴加在长满Foc4病菌气生菌丝的表面，以无菌水为对照，每个处理重复3次，28℃培养3d，观察皿内Foc4病菌气生菌丝是否发生变化(薛磊，2012)。
结果见图6，从图6可以看出，链霉菌PA-4发酵粗提物对Foc4病菌菌体有明显的作用，表现为菌丝体下陷，出现溶解的现象，而无菌水对照未出现菌丝溶解现象，仅表现出水滴作用的压痕。
2.2.2.4链霉菌PA-4发酵粗提物对Foc4菌丝形态的影响
用打孔器在Foc4菌落边缘取0.5cm菌饼接入含药(1/2EC95)平板的正中心，28℃培养5d后，切取含有菌落边缘的正方体小块，未处理的平板作为对照(韩丹丹，2018)。使用扫描电镜(SEM，model S-4800，Hitachi Limited，Japan)观察Foc4病菌菌丝的变化。
链霉菌PA-4发酵粗提物在1/2EC95浓度下对香蕉枯萎病菌菌丝表面的影响如图7所示。通过扫描电镜观察到对照组Foc4未处理菌丝形态正常，结构线形，细胞壁光滑(图7a)。经过发酵粗提物处理后Foc4病菌的菌丝出现肿大、皱缩、干瘪、断裂等现象(图7b-d)。
实施例3链霉菌PA-4对香蕉枯萎病的防治效果
3.1供试材料
供试作物：巴西蕉(Musa sp.AAA Cavendish subgroup cv.Brazil)为感病品种，选取3-4叶期、大小一致的营养杯组培苗开展试验。
病原菌孢子悬液制备：供试病原菌为含有绿色突光蛋白标记的香蕉枯萎病菌4号生理小种(Fusarium oxysporum f.sp.Cubense Race 4，GFP-Foc4)，由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供。挑取新鲜培养的GFP-Foc4菌丝接种于PDA固体培养基上，28℃培养7d。使用无菌蒸馏水刮洗孢子，并用灭菌过滤纸进行过滤，收集病原菌孢子悬浮液，血球计数板计数，用无菌水调至浓度为6.0×105cfu/mL，备用。
拮抗放线菌：将链霉菌PA-4菌株接种于优化后的SLM培养基中，28℃培养7d后。用灭菌过滤纸进行过滤，制备放线菌孢子悬浮液。血球计数板计数，调至浓度为3.0×104cfu/mL，备用。
供试土壤：取自海南省儋州市香蕉园健康土壤。
实验仪器设备：激光共聚焦扫描显微镜(日本，Olympus，FV1000)。
3.2实验方法与结果
试验数据利用SPSS Statistics软件进行统计分析，采用Duncan氏新复极差法进行差异显著性水平检验。
3.2.1链霉菌PA-4对香蕉盆栽苗香蕉枯萎病防效的测定
试验采用盆栽的方式，于2019年8月到2019年12月在热带生物技术研究所顶楼大棚进行。实验设6个处理，每个处理选取生长情况、健康状况一致的3-4片叶子的香蕉幼苗各30株。处理如表3-1所示
表3-1盆栽试验设计
Figure GDA0003953276420000201
采用伤根法测定放线菌的防病效果(戴亚静，2018)，将病原菌孢子悬浮液、链霉菌PA-4孢子悬浮液、SLM培养液和恶霉灵(安达禾欣，有效成分含量：99％，稀释1000倍)按照表3-1的处理进行施加，每盆100mL。观察香蕉生长和枯萎病发生情况，接种病原菌后观察地上部茎、叶黄化和枯萎情况，切开根部记录褐变程度，测量植株长势状况(赵兰凤等，2013)。
香蕉枯萎病的病情指数分级标准为
0级：健康植株；
1级：下部叶片黄化；
3级：有20％-40％的黄化病叶；
4级：有40％-60％的黄化病叶；
5级：有60％-80％的黄化病叶；
6级：植株全部都是黄化病叶，植株死亡(陈志杰，2018)。
香蕉枯萎病的病情指数及防控效果的计算公式如下所示(Chen et al.，2018)
Figure GDA0003953276420000202
Figure GDA0003953276420000203
结果见图8和表3-2所示，处理Foc4在105d后的发病率为74.07％，发病严重，球茎出现明显黑化等现象；而处理S.PA-4+Foc4的发病率为21.21％，对香蕉枯萎病的防治效果达到71.36％，说明链霉菌PA-4菌株对香蕉枯萎病具有较好的防治效果，可以抑制香蕉枯萎病菌的侵染。与处理S.PA-4+Foc4相比较，处理Hymexazol+Foc4的防效仅为26.87％，球茎出现明显黑化等现象，表明恶霉灵对香蕉枯萎病的防治效果较差；而处理SLM+Foc4的防效为30.13％，球茎也出现明显黑化，防治效果较差，说明黄豆发酵培养基对香蕉枯萎病没有防治效果。
表3-2链霉菌PA-4对温室香蕉枯萎病的防治效果
处理 Foc4 Hymexazol+Foc4 SLM+Foc4 S.PA-4+Foc4
发病率 74.07％ 54.17％ 51.75％ 21.21％
防效 - 26.87％ 30.13％ 71.36％
3.2.2病原菌定殖情况检测
分别采集各处理组105d时的香蕉根系，用水轻轻冲洗干净，利用刀片进行切片，选取完整较薄的切片置于玻璃载玻片上，进行激光共聚焦扫描显微镜(日本Olympus，FV1000)的观察(马凤娟，2019)。激光共聚焦扫描显微镜具有绿荧光GFP(543nm)和根的自发荧光(510-560nm)的激光器，其荧光检测器范围370-760nm。
结果见图9，处理S.PA-4和处理H2O不接病原菌，在香蕉根系均没有观察到绿色荧光的病原菌。Foc4、SLM+Foc4和Hymexazol+Foc4处理可以看到病原菌在根表大量附着，S.PA-4+Foc4处理发现香蕉根系表面仅有少量GFP-Foc4菌丝体和分生孢子附着，表明菌株PA-4对GFP-Foc4侵染香蕉根系具有一定的抑制作用。
3.2.3链霉菌PA-4菌液对盆栽香蕉苗苗期生长特性的影响
根据陈志杰(2018)的香蕉苗生长特性测量方法，每隔30d对香蕉苗的株高、茎粗、叶面积、叶片数、叶绿素含量以及香蕉苗的鲜重和干重等指标进行一次测量。
链霉菌PA-4菌液施用105d后，盆栽香蕉苗株高增长量为S.PA-4处理>S.PA-4+Foc4处理>SLM+Foc4处理>Foc4处理>H2O处理>Hymexazol+Foc4处理。由图10a可以看出，S.PA-4处理和S.PA-4+Foc4处理的香蕉苗株高分别为21.91cm和19.98cm，明显高于H2O处理和SLM+Foc4处理的株高，尤其是随时间变化株高优势更明显，说明链霉菌PA-4对香蕉苗的生长具有较好的促生作用。
链霉菌PA-4菌液施用105d后，盆栽香蕉苗茎粗增长为S.PA-4处理>S.PA-4+Foc4处理>SLM+Foc4处理>H2O处理>Hymexazol+Foc4处理>Foc4处理(图10b)。S.PA-4处理和S.PA-4+Foc4处理的茎粗与Foc4处理存在差异显著，说明链霉菌PA-4对香蕉苗茎粗具有一定的促生作用。
链霉菌PA-4菌液施用105d后，S.PA-4处理和S.PA-4+Foc4处理的盆栽香蕉苗叶片数与Foc4处理和H2O处理存在差异显著(图10c)，说明链霉菌PA-4可以促进香蕉苗叶片数的生长；Foc4处理的茎粗在105d时出现明显降低的现象，说明枯萎病菌侵染香蕉苗引起了香蕉黄叶凋亡的现象，导致叶片数的下降。
不同处理对香蕉苗生物量的影响结果如图10d所示，SLM+Foc4处理、Hymexazol+Foc4处理和Foc4处理受病原菌的影响，干重和鲜重与H2O处理相比都有明显的下降趋势，说明了病原菌对植株的生长具有抑制作用，使得植株的生物量降低。而S.PA-4处理和S.PA-4+Foc4处理的干重和鲜重都显著高于H2O处理和Foc4处理，说明链霉菌PA-4对香蕉苗生物量具有促生作用。
不同处理对香蕉苗叶面积的影响如图10e和图11所示，由图可以知，S.PA-4处理的香蕉苗叶片面积都明显高于其它处理，这说明链霉菌PA-4能够有效增加植株的叶面积，提高植株的光合作用效率；Foc4处理的叶面积比H2O处理的叶面积低，表明了Foc4可通过影响香蕉叶面积导致香蕉苗的光合作用的减弱，从而降低植株的生物量。
不同处理对香蕉苗叶片中叶绿素含量的影响如图10f所示。Foc4处理在盆栽后期(105d)时叶片中的叶绿素含量出现下降的现象，是因为Foc4侵染香蕉苗后，叶片出现黄叶等现象，导致叶绿素受到破坏而出现下降的现象。SLM+Foc4处理、Hymexazol+Foc4处理和S.PA-4+Foc4处理的叶绿素在45d时都有下降的情况，这可能是由病原菌的侵染造成的，但是在75d时叶绿素含量有所回升，可能是植株降低了香蕉枯萎病菌对叶片叶绿素的伤害。而S.PA-4处理和S.PA-4+Foc4处理的叶绿素含量在105d时都显著高于Foc4处理和H2O处理，可能是因为链霉菌PA-4产生某些具有促生作用的代谢物质，促进香蕉苗的生长，从而提高叶片叶绿素含量，增强植株的光合作用效率等。
实施例4PA-4菌株与其它链霉菌发酵提取物抑菌活性比对
4.1供试菌种：吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicussubsp.hygroscopicus)PA-4菌株；银色链霉菌(Streptomyces argenteolus)；壮观链霉菌(Streptomyces spectabilis)；白黄黑链霉菌(Streptomyces albiflaviniger)；淀粉酶产色链霉菌(Streptomyces diastatochromogenes)；唐德链霉菌(Streptomyces tendae)；白黄黑链霉菌(Streptomyces albiflaviniger)；Kitasatospora cheerisanensis；
4.2实验方法与结果
4.2.1PA-4菌株与其它链霉菌发酵提取物抑菌活性比对
放线菌发酵液的制备：将初筛具有较好拮抗活性的放线菌接种于含有100mL SLM液体培养基的三角瓶(250mL)中，于28℃，200r/min恒温摇床上培养7d。以1:1(v:v)加入无水乙醇进行混合、萃取活性粗提物，滤纸过滤菌丝，旋转蒸发，得到粗提物，备用。
采用滤纸片法测定放线菌发酵粗提物对Foc4的抑菌活性。将滤纸片完全浸泡在发酵粗提物中，取出风干。在距供试病原菌菌饼的2.5cm处，分别贴上4片含有发酵液的滤纸片，以只接种供试病原菌作为对照，每个处理三个重复，于28℃下倒置培养7d。采用十字交叉法测量病原真菌菌落的直径，并按照下列公式计算菌丝生长的抑制率。
菌落直径(mm)＝测量菌落直径平均值－5.0
Figure GDA0003953276420000231
结果见图12和表4-1所示，由图12可以看出含有PA-4菌株发酵提取物的培养基中的菌落直径最小，表明PA-4菌株对Foc4的抑菌活性较其他链霉菌强。
表4-1
菌株 抑菌率(％)
PA-4菌株 82.54
Streptomyces argenteolus 73.18
Streptomyces spectabilis 70.73
Streptomyces albiflaviniger 71.19
Streptomyces diastatochromogenes 74.39
Streptomyces tendae 68.29
Streptomyces albiflaviniger 78.05
Kitasatospora cheerisanensis 64.62
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种抗真菌的吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus subsp. hygroscopicus，其特征在于，所述吸水链霉菌Streptomyces hygroscopicus subsp. hygroscopicus命名为吸水链霉菌PA-4，于2021年5月24日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No. 61679。
2.一种抗真菌的吸水链霉菌的应用，其特征在于，如权利要求1所述的吸水链霉菌PA-4在拮抗香蕉枯萎病菌4号生理小种Fusarium oxysporum f. sp. Cubense Race 4、香蕉枯萎病菌1号生理小种Fusarium oxysporum f. sp. Cubense race1、黄瓜枯萎病菌Fusariumoxysporum f. sp cucumerinum、番茄枯萎病Fusarium oxysporum f.sp. Lycopersici、辣椒炭疽病菌Colletotrichum acutatum、草莓炭疽病菌Colletotrichum fragariae、荔枝炭疽病菌Colletotrichum gloeosporioides、板栗疫病菌Cryphonectria parasitica、小麦赤霉病菌FusaHum graminearum、芒果链格孢霉叶斑病菌Alternaria tenuissima、水稻稻曲病菌Ustilaginoidea oryzae、水稻稻瘟病菌Pyricularia oryae Cav、灰葡萄孢菌Botrytis cinerea、香蕉长形斑病菌Curvularia fallax和/或香蕉大灰斑病菌Curvularialunata中的应用。
3.如权利要求2所述的抗真菌的吸水链霉菌的应用，其特征在于，吸水链霉菌PA-4、吸水链霉菌PA-4的发酵液和/或发酵粗提物在制备防治香蕉枯萎病菌4号生理小种、香蕉枯萎病菌1号生理小种、黄瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌、辣椒炭疽病菌、草莓炭疽病菌、荔枝炭疽病菌、板栗疫病菌、小麦赤霉病菌、芒果链格孢霉叶斑病菌、水稻稻曲病菌、水稻稻瘟病菌、灰葡萄孢菌、香蕉长形斑病菌和/或香蕉大灰斑病菌所致病害的生防制剂中的应用。
4.如权利要求3所述的抗真菌的吸水链霉菌的应用，其特征在于，所述发酵液为将吸水链霉菌PA-4接种于发酵培养基进行发酵培养所得。
5.如权利要求4所述的抗真菌的吸水链霉菌的应用，其特征在于，所述发酵培养基的组分为可溶性淀粉 21.512 g/L，黄豆粉 15 g/L，酵母粉5 g/L，蛋白胨 2 g/L，CaCO3 4 g/L，NaCl 4.734 g/L，其余组分为ddH2O；培养基pH：7.0。
6.如权利要求4所述的抗真菌的吸水链霉菌的应用，其特征在于，所述发酵培养的接种量为3.217%，发酵时间为7d，摇床转速为200rpm。
7.如权利要求3所述的抗真菌的吸水链霉菌的应用，其特征在于，所述发酵粗提物为吸水链霉菌PA-4的发酵液经乙醇萃取、除菌丝、除去乙醇后的发酵粗提物。
8.一种抗真菌的吸水链霉菌的应用，其特征在于，如权利要求1所述的吸水链霉菌PA-4、吸水链霉菌PA-4的发酵液和/或发酵粗提物在制备促进植物生长的生防制剂中的应用。
9.如权利要求3-8任一项所述的抗真菌的吸水链霉菌的应用，其特征在于，所述生防制剂包括吸水链霉菌PA-4、吸水链霉菌PA-4的发酵液和/或发酵粗提物。
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