CN115305221B - 一种复合微生物菌剂及其制备方法和在防治草莓空心病中的应用 - Google Patents

一种复合微生物菌剂及其制备方法和在防治草莓空心病中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物防治草莓病技术领域，为了解决目前草莓空心病还没有有效的解决问题，提供了一种复合微生物菌剂及其制备方法和在防治草莓空心病中的应用。由阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）cc‑2‑jd的发酵液和漳州芽孢杆菌（Bacillus zhangzhouensis）cc‑4‑jz的发酵液按照体积比为1:2、1:3、3:2或2:3混合而成；其中，所述阿氏芽孢杆菌、漳州芽孢杆菌保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号分别为：CGMCC No. 23937和 CGMCC No. 23938。制备方法简单，在草莓促生和防病都有良好的效果。

Description

一种复合微生物菌剂及其制备方法和在防治草莓空心病中的应用
技术领域
本发明属于生物防治草莓病技术领域，具体涉及一种复合微生物菌剂及其制备方法和在防治草莓空心病中的应用。
背景技术
近两年来，草莓种植区出现了一种新症状的病害，国内多地包括北京、辽宁、河北、陕西、山东、浙江、甘肃、云南、河南等大部分草莓种植区均有发现，并随着种苗的运输等因素逐渐在国内蔓延开来，已严重影响我国草莓产业的健康发展。
在草莓种植过程中，炭疽病和根腐病是常常会出现的草莓病害，二者一般在草莓定植后一个月内发病，发现后还可以及时补苗，挽回一定的损失；而新发现的这种病害发病大都是在草莓现蕾之后，此时已经错过最佳补苗阶段，再加上此病害一旦发病，发病面积极大，因而由于死苗造成的损失将无法弥补。
目前，这种新症状病害还没有正式的名称，国内还没有机构严格按照植物病害认定的科赫法则做出确切答案，莓农大多称其为“空心病”或“断头病”。根据田间观察的结果，发现此病害最初表现为叶片背部出现不规则的斑块（图1），点状发生，逐步增多；当病原菌侵染草莓茎基部后，短缩茎发生病变，内部呈现水烫状，即空心的状态（图2），而且用手轻轻一掰短缩茎就会断掉，所以有了上面的空心病或断头病之称。本发明将此种病害称为空心病。
阿氏芽孢杆菌，在工业、食品业、农业、医疗方面国已有许多研究报道，包括大分子化合物降解与合成，促进植物对金属离子、干旱与病害等逆境的耐受性。生物降解与合成功能，植物促生作用，均是阿氏芽孢杆菌分泌的酶或者活性代谢产物所影响的。漳州芽孢杆菌是2016年报道的一个芽孢杆菌的新物种，分离自我国漳州养虾场的水中，有报道称此菌株可以发酵桑叶粉、可以降解氨氮，也可以作为生防菌使用。
前期自患有空心病的草莓植株根部分离纯化到一株病原菌，根据形态学鉴定以及分子生物学鉴定，确定此菌为棒孢新拟盘多毛孢 Neopestalotiopsis clavispora，命名为CMSF-1，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号分别为：CGMCC No.40205，保藏日期为2022年5月26日 。
菌株CMSF-1在PDA培养基上的生长状态：菌落呈白色丝绒状，近圆形，边缘规则，表面呈波浪状，后期菌落正面未见明显的色素产生，菌落背面为淡橘黄色（图3）。生长15d 后菌落上可见黑色圆形油状小点，即为分生孢子盘。分生孢子呈纺锤形或长梭形（图4），共5个细胞，4个隔膜，分隔处缢缩不明显，顶端与基部细胞颜色较淡，多数呈透明状，中间3个细胞颜色较深，多为褐色，顶端有2根不分支的附属丝，无色透明，基部细胞具一小柄。根据形态学特征，初步判断该病原菌属于新拟盘多毛孢属。
同时，我们对菌株的ITS基因序列进行测序分析，测序结果显示菌株CMSF-1为棒孢新拟盘多毛孢 Neopestalotiopsis clavispora（系统发育树见图5）。查询文献，发现并没有棒孢新拟盘多毛孢会引发草莓空心病的相关报道，所以本研究将是棒孢新拟盘多毛孢导致草莓空心病的首次报道。
目前还没有对于该病原菌的防治菌剂。
发明内容
本发明为了解决目前草莓空心病还没有有效的解决问题，提供了一种复合微生物菌剂及其制备方法和在防治草莓空心病中的应用。
本发明由如下技术方案实现的：一种复合微生物菌剂，由阿氏芽孢杆菌（ Bacillus  aryabhattai）cc-2-jd的发酵液和漳州芽孢杆菌（ Bacillus zhangzhouensis）cc-4-jz的发酵液按照体积比为1:2、1:3、3:2或2:3混合而成；其中，所述阿氏芽孢杆菌（ Bacillus  aryabhattai）cc-2-jd和漳州芽孢杆菌（ Bacillus zhangzhouensis）cc-4-jz保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号分别为：CGMCC No. 23937和 CGMCC No. 23938，保藏日期为2021年11月19日。
所述复合微生物菌剂由阿氏芽孢杆菌（ Bacillus aryabhattai）cc-2-jd的发酵液和漳州芽孢杆菌（ Bacillus zhangzhouensis）cc-4-jz的发酵液按照体积比为1:3混合而成。
制备所述的复合微生物菌剂的方法，具体步骤为：
（1）菌株发酵液的制备：阿氏芽孢杆菌（ Bacillus aryabhattai）cc-2-jd和漳州芽孢杆菌（ Bacillus zhangzhouensis）cc-4-jz分别接种于LB液体培养基中，28℃、150 r/min振荡培养72～84 h，当菌液浓度达到1×109 cfu/mL时，收集菌液备用；
（2）复合微生物菌剂的制备：将发酵液按照体积比混合。
所述的复合微生物菌剂在防治草莓空心病中的应用，所述空心病病菌为棒孢新拟盘多毛孢 Neopestalotiopsis clavispora，命名为CMSF-1，所述复合微生物菌剂的具体应用方法为：草莓定植后将复合微生物菌剂进行灌根处理，具体用量为每株草莓 100 ml菌液。
本发明所述复合微生物菌剂制备方法简单，实验结果显示：在盆栽实验中，复合微生物菌剂确实有效的促进了草莓植株的生长，各项指标均比对照组要高出很多，株高、根鲜重、根干重、茎叶鲜重和茎叶干重分别提高了11.19%、8.46%、11.83%、15.51%和20.50%。复合微生物菌剂在草莓促生和防病都有良好的效果。
附图说明
图1为发生病害的草莓叶片背部示意图；
图2为发生病害的草莓根部剖面图；
图3为菌株CMSF-1在PDA培养基上的生长状态，图中：A为菌株CMSF-1正面；B为菌株CMSF-1背面；
图4为菌株CMSF-1的分生孢子；
图5为菌株CMSF-1的ITS序列的系统发育树；
图6为不同菌株对病原CMSF-1的抑菌实验，图中：A为对照；B为菌株cc-2-jd；C为菌株cc-4-jz；
图7为亲和力实验；图中：A为菌株cc-2-jd为平板菌株，菌株cc-4-jz为测试菌株；B为菌株cc-4-jz为平板菌株，菌株cc-2-jd为测试菌株。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例；基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除非另有定义，所有在此使用的技术和科学术语，和本发明所属领域内的技术人员所通常理解的意思相同，在此公开引用及他们引用的材料都将以引用的方式被并入。
本领域技术人员意识到的通过常规实验就能了解到的描述的特定实施方案的等同技术，都将包含在本申请中。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的仪器设备，如无特殊说明，均为实验室常规仪器设备；下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为由常规生化试剂商店购买得到的。
本实验室自草莓根际土壤中成功分离到了一株阿氏芽孢杆菌cc-2-jd（保藏编号CGMCC No. 23937）和一株漳州芽孢杆菌cc-4-jz（保藏编号CGMCC No. 23938），二者对于多种植物病原真菌有良好的抑制效果。由于目前还没有关于这两种菌株用于草莓空心病防治的报道，所以利用这两种菌开发出一种能够抑制或者拮抗病原菌的复合微生物制剂是非常有意义的。
实施例1 ：菌株对于病原菌的抑菌实验
实验方法：采用平板对峙法，在 PDA 平板中心接种直径为 8mm 的病原菌棒孢新拟盘多毛孢（ Neopestalotiopsis clavispora）菌块，在距菌块 3 cm 处接种阿氏芽孢杆菌（ Bacillus aryabhattai）cc-2-jd和漳州芽孢杆菌（Bacillus  zhangzhouensis）cc-4-jz ，对照为只接种病原菌的平板，28 ℃培养 3-5 d，重复3次，观察实验结果。
抑菌实验结果见图6。从图6中看出，这两株细菌都具备抑制病原菌生长的能力，抑菌效果明显。
实施例2 ：2株细菌的亲和力实验
菌株cc-2-jd在PDA平板上生长36 h后，接种到50 mL的LB培养基中，28 ℃、150 r/min振荡培养72 h。当菌液浓度达到1×109 cfu/mL时，取1 mL菌株cc-2-jd的菌液稀释至1×108 cfu/mL，涂布于平板；用牙签蘸取同样条件下培养的菌株cc-4-jz菌液（1×108cfu/mL），轻点在上述平板（此平板记为A）上，28 ℃培养24h，测量菌株cc-4-jz的抑菌圈大小。反之亦然，实验重复3次，平板记为B。
16h之后，结果如图7所示，检测发现平板A上，菌株cc-4-jz的抑菌圈大小为0.5mm；平板B上，菌株cc-2-jd的抑菌圈大小为0.5mm，所以可以认为两个菌株之间有弱亲和力，不存在拮抗效果，能够进行混合培养。
实施例3：菌株配方的确定
菌株发酵液的准备：取菌株cc-2-jd和cc-4-jz的单菌落分别接种到50 mL的LB培养基中，28 ℃、150 r/min振荡培养72～84 h，当菌液浓度达到1×109 cfu/mL时，收集菌液备用。
菌株发酵液两两组合的抑菌效果：菌株cc-2-jd和cc-4-jz的发酵液按照体积比1:1、2:1、1:2、3:1、3:2、2:3和1:3分别进行两两组合，进行抑菌效果的检测；选择单菌株的发酵液和空白培养基作为对照。
采用牛津杯法测定菌株发酵液对病原菌的抑制效果，在PDA平板中央放置供试真菌菌饼（d＝8 mm），在平皿对角线上距中心3 cm处放置4个牛津杯。取过滤后的200 μL发酵液加入牛津杯。以空白培养基作为对照，每个处理重复3次。待对照菌落长满后，测定病原菌菌落直径，计算抑制率。抑制率（%）＝（对照组菌落直径－处理组菌落直径）/（对照组菌落直径－原菌饼直径）×100。
菌株混合培养的抑菌效果：将菌株cc-2-jd和cc-4-jz分别在PDA平板上生长24 h后，接种到30 mL的LB培养基中，28 ℃、150 r/min振荡培养24～36 h，调整菌液浓度为1×105 cfu/mL。调整好的菌液按照体积1:1、2:1、1:2、3:1、3:2、2:3和1:3比例进行混合，混合菌液以1%的接种量接种于新的LB培养基中，于28 ℃、150 r/min振荡培养36～48 h，当混合菌液浓度达到1×109 cfu/mL时，收集菌液。同样，选择单菌株的发酵液和空白培养基作为对照。检测方法同上。检测结果如表1所示。
表1 不同配方的菌株组合的抑菌效果
从表1可以看出，在16个菌株组合中，抑菌能力最强的是菌株cc-2-jd和cc-4-jz的发酵液按照体积比1:2混合而成的组合，抑菌率达到了69.85%，比单菌株cc-2-jd的抑菌率高出6.98%，比单菌株cc-4-jz高出了15.66%。因此，这个组合是进行盆栽试验的最佳组合。
实验例4：盆栽防治效果实验
选取健康的、生长状态一致的2叶1心的健康草莓幼苗进行移植（基质已经进行了灭菌处理）；草莓苗定植后10 d进行伤根处理，同时浇灌病原菌的孢子悬浮稀释液（浓度达到1×106 cfu/mL）。此后，结合草莓生长状态和基质干湿情况，在接种病原菌后每隔5～7 d进行补施菌剂或者化学药剂，补施3次即可。
试验设置4个处理，处理方式见表2，具体为：A：病原菌100mL（孢子浓度为1×106 cfu/mL），需要在处理B施用复合微生物菌剂时施用100mL无菌水；B：病原菌100mL（孢子浓度为1×106 cfu/mL），根据情况施用复合微生物菌剂，每隔5-7d施用1次，每次100mL菌液（浓度为1×109 cfu/mL），一共3次即可；C：只施用复合微生物菌剂，施用菌液的浓度、体积和次数同处理B；CK：无菌水，次数和体积与处理B同步，共4次。每个处理30株草莓苗，重复3次，常规管理，接种50 d后观察草莓苗发病情况，同时测定草莓的株高、叶片面积、根鲜重和茎叶鲜重。结果见表3。
表2 不同处理方式
表3 复合微生物菌剂对草莓空心病的防治效果以及促生效果
结果显示：浇灌病原菌50d后，处理组A的草莓发病，叶片背部出现不规则的斑点块（图3），对其进行根部解剖，发现短缩茎内已经呈现水烫状，即空心的状态，这和田间发现的症状极为相似。
用组织分离法对发病的草莓茎部以及叶片进行病原菌分离，均能分离得到棒孢新拟盘多毛孢（ Neopestalotiopsis clavispora）CMSF-1，说明此菌株确实是引发草莓空心病的病原菌。
将表2中组A和组B的数据对比之后发现，复合微生物菌剂能够有效的防治草莓空心病对植株的侵害，施用之后，病情指数由61.50降低到24.37，防治效果高达57.79%；而且在防治病害的同时，复合微生物菌剂处理组B还促进了草莓植株的生长，株高、根鲜重、根干重、茎叶鲜重和茎叶干重分别比组A提高了41.65%、124.26%、39.43%、113.89%和67.33%。
组C和对照组CK相比展示了草莓在没有受到病原菌感染时，复合微生物菌剂对于草莓生长的促进效果。结果发现，在盆栽实验中，复合微生物菌剂确实有效的促进了草莓植株的生长，各项指标均比对照组要高出很多，株高、根鲜重、根干重、茎叶鲜重和茎叶干重分别提高了11.19%、8.46%、11.83%、15.51%和20.50%。
综上所述，两组盆栽实验的对比结果充分说明了复合微生物菌剂在草莓促生和防病都有良好的效果。
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (4)

1.一种复合微生物菌剂，其特征在于：由阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）cc-2-jd的发酵液和漳州芽孢杆菌（Bacillus zhangzhouensis）cc-4-jz的发酵液按照体积比为1:2、1:3、3:2或2:3混合而成；其中，所述阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）cc-2-jd和漳州芽孢杆菌（Bacillus zhangzhouensis）cc-4-jz保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号分别为：CGMCC No. 23937和 CGMCC No. 23938。
2.根据权利要求1所述的一种复合微生物菌剂，其特征在于：所述复合微生物菌剂由阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）cc-2-jd的发酵液和漳州芽孢杆菌（Bacillus  zhangzhouensis）cc-4-jz的发酵液按照体积比为1:3混合而成。
3.制备权利要求1或2所述的复合微生物菌剂的方法，其特征在于：具体步骤为：
菌株发酵液的制备：阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）cc-2-jd和漳州芽孢杆菌（Bacillus zhangzhouensis）cc-4-jz分别接种于LB液体培养基中，28℃、150 r/min振荡培养72～84 h，当菌液浓度达到1×109 cfu/mL时，收集菌液备用；
（2）复合微生物菌剂的制备：将发酵液按照体积比混合。
4.权利要求1或2所述的复合微生物菌剂在防治草莓空心病中的应用，其特征在于：所述空心病病菌为棒孢新拟盘多毛孢Neopestalotiopsis clavispora，命名为CMSF-1，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 40205；所述复合微生物菌剂的具体应用方法为：草莓定植后将复合微生物菌剂进行灌根处理，具体用量为每株草莓100 ml菌液。
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