CN116333891B - 一种草莓灰霉病和炭疽病的生防菌jsnl-tx55及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于草莓生防技术领域，公开了一种草莓灰霉病和炭疽病生防菌及其应用，所述生防菌命名为TalaromycesfusiformisJSNL‑TX55，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMC CNO.40435。本发明提供的生防菌TalaromycesfusiformisJSNL‑TX55能够显著降低草莓灰霉病和草莓炭疽病的病害严重度，其平均生防效果达到了74.33％，同时植物根长、鲜重等生长指标显著提高。
Description
技术领域
本发明属于草莓生防技术领域，涉及一种草莓灰霉病和炭疽病的生防菌JSNL-TX55及其应用。
背景技术
草莓是一种深受世界各地消费者欢迎的水果，在全世界各地广泛栽培。在草莓生产过程中，危害最严重、造成的经济损失最大的障碍因素是草莓的病害问题。由灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）引起的灰霉病，是世界第二重要的植物真菌病害，该病原真菌主要侵染草莓、葡萄、黄瓜、西红柿、辣椒等多种植物，寄主范围广泛。灰霉病是草莓开花后危害最严重的一种真菌性病害，该病害主要侵染果实，也侵染叶片、果梗、花萼、花瓣及叶柄，造成花及果实腐烂，感病品种的病果率可达30％-60％，严重的情况下甚至绝收，给草莓生产造成巨大的损失。
炭疽菌（刺盘孢）属（Colletotrichum spp.）真菌，属于一类全球分布的植物病原真菌。由炭疽菌属引起的草莓炭疽病是近几年草莓的主要病害，主要发生在草莓育苗期和定植初期。炭疽菌寄主范围广，除了可侵染草莓，还可侵染葡萄、苹果、可可、芒果、柑橘、桃、梨、辣椒、豌豆、大豆、玉米和铁皮石斛等植物。草莓炭疽病发生时，草莓叶片、叶柄、托叶、匍匐茎、花瓣和果实均可受害。该病危害性大、毁灭性强，一般造成草莓减产25％-30％，严重时达80％，甚至毁灭性损失。草莓炭疽病是制约中国草莓产业的第三大病害。
目前生产上防治草莓灰霉病和炭疽病仍以化学防治为主，化学药剂虽然能够在一定程度上防治草莓灰霉病和炭疽病，但是长期大量使用化学药剂一方面给生态环境和食品安全带来极大威胁，尤其是我国草莓消费主要以鲜食为主，其绿色生态生产格外重要；另一方面会导致病原菌抗药性不断增强，出现农药防治无效的现象。
因而，找到一种环境友好且行之有效的灰霉病和炭疽病防治措施是现今亟待解决的问题。植物内生真菌（endophyte fungi）不同于病原菌，病原菌会导致病害发生，并降低宿主植物的适应性，而内生真菌栖息于无症状的宿主植物组织内，是影响植物生长、营养和健康的关键因素之一，可以帮助植物获得营养物质，抑制植物病原菌以及抵抗生物和非生物胁迫。由于植物内生真菌来源于植物，对植物安全、对环境友好且不易产生抗药性，使用这些微生物防治植物病害有利于保持生态平衡。因此，植物内生真菌是促进有机农业的新型化合物的来源。
综上所述，现有技术还缺少一种预防草莓灰霉病和炭疽病的绿色、高效的益生菌。
发明内容
针对上述存在的问题，本发明提供了一种能够有效防治草莓灰霉病和炭疽病的生防菌Talaromyces fusiformis JSNL-TX55及其应用。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
第一方面，本发明提供了一种防治草莓灰霉病菌（Botrytis cinerea）引起的草莓灰霉病和炭疽病菌（Colletotrichum siamense）引起的草莓炭疽病的生防菌，所述生防菌命名为Talaromyces fusiformis JSNL-TX55，分离自镇江市句容市白兔镇健康草莓叶片。
Talaromyces fusiformis JSNL-TX55，分类命名为Talaromyces fusiformis，已于2022年12月8日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC）登记保藏，保藏编号为CGMCC NO. 40435，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
第二方面，本发明提供了一种工程菌，所述工程菌包含本发明第一方面所述的Talaromyces fusiformis JSNL-TX55的核酸片段。
进一步地，所述核酸片段的碱基序列包括SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。
SEQ ID NO.1:
GGACTTCGAGTGCGGGCTCGCGGCCCAACCTCCCACCCGTGTCTCTCTCTACCTGTTGCTTTGGCGGGCCCACCGGGGCCACCCGGTCGCCGGGGGACGTCCGTCTCCGGGCCCGCGCCCGCCGAAGCGCCCTGTGAACCCTGATGAAGATGGGCTGTCTGAGTCGCATGAAAATTGTCAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGCATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTTCTGCCCTCAAGCGCGGCTTGTGTGTTGGGCGTGGTCCCCCCGGGGACCTGCCCGAAAGGCAGCGGCGACGTCCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTCTGTCACTCGCTCGGGACGGATCGGCGGAGGTTGGTCACCACCACAGTTTTACCACGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAGTTACCCGCTGAACTTAAGCATATCTAAAACCGGGGAGGAAAAGGT
SEQ ID NO.2:
GGTCTTTACGACTCGGTCATTGTCGCCACAAACAAGCTGACTTTTCCAGGCAAATCATCTCTGCTGAGCACGGTCTCGATGGCTCCGGTGTGTAAGTGTTGCAAACGATTCGAATGCAGTTATAATCCGACACCATCTGATCATCAACAGCTACAATGGCTCCTCCGACCTCCAGTTGGAGCGTATGAACGTCTACTTCAACGAGGTGTGTGGAATCAACCATCAGAAAACCCATCGAATGCTTGGAACTCATGTCTCGAATATAGGCCTCCGGCAACAAGTACGTTCCCCGTGCCGTCCTCGTCGACTTGGAGCCCGGTACCATGGATGCCGTCCGCGCTGGTCCCTTTGGTCAGCTCTTCCGTCCCGACAACTTTGTTTTCGGTCAATCCGGTGCCGGTAACAACTGGGCCAAGGGCTAC
第三方面，本发明提供了一种能够防治草莓灰霉病菌（B. cinerea）引起的草莓灰霉病和草莓炭疽病菌（C. siamense）引起的草莓炭疽病的生防菌剂，其活性成分为如下一种或多种：
A1)本发明第一方面所述的Talaromyces fusiformis JSNL-TX55；
A2)本发明第一方面所述的Talaromyces fusiformis JSNL-TX55的菌丝、孢子或次生代谢物中的一种或多种；
A3)本发明第二方面任一所述的工程菌。
进一步地，所述Talaromyces fusiformis JSNL-TX55的菌丝由Talaromyces fusiformis JSNL-TX55接种于PDA培养基培养制得。
进一步地，所述生防菌剂包括生防化肥或生防农药。
第四方面，本发明还提供了第三方面所述的生防菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、制备无菌基质；
S2、向S1所述基质中加入Talaromyces fusiformis JSNL-TX55的菌丝、孢子或次生代谢物；
S3、将S2得到的基质密封培养数天即得生防菌剂。
进一步地，所述方法包括如下步骤：
A1：将基质装入带有透气孔的无菌三角瓶（250 mL）中，每瓶放入200 mL基质，在121℃环境下高温灭菌20 min。
A2：Talaromyces fusiformis JSNL-TX55接种于直径9 cm的含有15 mL的PDA培养基中，于25℃、避光培养3-5 d。
A3：将长满Talaromyces fusiformis JSNL-TX55菌落边缘切取3 mm×3 mm的菌丝块，无菌条件下转移到液体基质中，封口后置于25℃，160 rpm培养7 d，制得Talaromyces fusiformis JSNL-TX55的液体发酵菌剂。
第五方面，本发明还提供了上述的生防菌、上述的工程菌或上述的生防菌剂在防治草莓灰霉病菌（B. cinerea）引起的草莓灰霉病和草莓炭疽病菌（C. siamense）引起的草莓炭疽病害中的应用。
第六方面，本发明还提供了一种草莓灰霉病和草莓炭疽病的防治方法，所述方法包括向植物生长环境中施用本发明所提供的生防菌、工程菌或生防菌剂。
进一步地，所述植物生长环境为植物苗根部或叶部。
与现有技术相比，本发明提供的生防菌Talaromyces fusiformis JSNL-TX55能够显著降低草莓灰霉病和草莓炭疽病的病害严重度，其平均生防效果达到了74.33%，同时植物根长、鲜重等生长指标显著提高。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1为实施例1中Talaromyces fusiformis JSNL-TX55在平板上抑制B. cinerea（左）和C. siamense（右）菌丝生长的效果图；
图2为实施例1中Talaromyces fusiformis JSNL-TX55对B. cinerea（左）和C. siamense（右）的抑制活性；
图3为实施例2中Talaromyces fusiformis JSNL-TX55对草莓植株的影响；
图4为实施例3中Talaromyces fusiformis JSNL-TX55对B. cinerea导致的草莓灰霉病的影响；
图5为实施例3中Talaromyces fusiformis JSNL-TX55对C. siamense导致的草莓炭疽病的影响。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
如本发明中所述，术语“生防菌”指有益微生物，可以防治植物病害，主要有细菌、真菌和放线菌。
如本发明中所述，术语“工程菌”指采用现代生物工程技术加工出来的新型微生物，具有多功能、高效和适应性强等特点。
如本发明中所述，术语“草莓灰霉病菌（B. cinerea）”分类地位：真菌界（Fungi）、子囊菌门（Ascomycota）、锤舌菌纲（Leotiomycete）、柔膜菌目（Helotiales）、核盘菌科（Sclerotiniaceae）、孢盘菌属（Botryotinia）。主要分布在美国、瑞典、德国、法国、中国、巴西、日本、韩国、阿根廷、印度、智利等国家。
如本发明中所述，术语“草莓炭疽病菌（C. siamense）”分类地位：真菌门（Eumycota）、半知菌亚门（Deuteromyeotina）、腔孢纲（Coelomycetes）、黑盘孢目（Melanconiales）、黑盘孢科（Melanconiaceae）、炭疽属（Colletotrichum）。主要分布在美国、加拿大、澳大利亚、日本、英国、中国、比利时、德国、印度、越南、韩国、巴西、巴拿马、墨西哥、俄罗斯、以色列等国家。
实施例1 菌Talaromyces fusiformis JSNL-TX55的筛选
1、分离潜在的生防菌
1.1、获取试验材料：从田间（江苏农博园）选取长势良好的健康草莓植株，取其叶片组织。
1.2、草莓叶片内生真菌的分离及培养：剪取草莓叶片组织，混匀，称取2 g，进行表面消毒。为确保清除所有附生微生物，加入100 mL无菌水和2滴吐温20，在25°C下220 rpm震荡20 min，无菌水处理20 s，70%（v/v）乙醇处理30 s， 2.5%（v/v）次氯酸钠溶液处理2 min，最后用无菌水冲洗3-4遍，用无菌吸水纸吸干表面水分。在无菌条件下将叶片进一步剪成较小的小块（0.5 cm2），每个样品随机选取5块放置在含有氨苄（50 mg/L）和利福平（50 mg/L）的PDA平板培养基上。将培养皿密封，在25℃、黑暗条件下培养1-2 d。当菌丝体从叶片组织中出现时，将生长在培养基边缘的小块培养基连同菌丝体一起小心地转移到一个新的PDA平板上。
2、平板对峙法筛选拮抗菌
采用PDA平板对峙法，在直径9 cm的含有15 mL的PDA培养基平板距离边缘2 cm处分别对称接种培养3-5 d的B. cinerea和C. siamense菌株菌饼（直径5 mm）和供试内生真菌菌饼，以只接种B. cinerea和C. siamense菌株菌饼的平板作为对照。平板置于25℃、黑暗条件下培养。5 d后测量B. cinerea和C. siamense菌落半径并计算抑制率。抑制率按照公式计算：抑制率=（对照组菌落半径-处理组菌落半径）/对照组菌落半径×100%。
最终筛选得到1株在平板上对B. cinerea和C. siamense均有很好拮抗活性的菌株，具体表现为强烈的抑制病原菌菌丝生长，编号为JSNL-TX55。
如图1所示，左图为JSNL-TX55与B. cinerea菌株对峙，与对照相比，实验组B. cinerea菌株的菌落明显更小，抑制率达到了56.08％，右图为JSNL-TX55与C. siamense菌株对峙，与对照相比，实验组C. siamense菌株的菌落明显更小，抑制率达到了52.38％，说明B. cinerea和C. siamense菌株的菌丝生长均受到了抑制。
如图2所示，光学显微观察结果显示：正常B. cinerea菌丝外形规则，内含物在菌丝细胞壁内分布均一、较透明；与JSNL-TX55对峙7天后，B. cinerea菌丝肿胀变形、较混乱分布（左图），不能正常生长。正常C. siamense菌丝外形规则，生长顺直，菌丝细胞壁内容物分布均一；与JSNL-TX55对峙7天后，C. siamense菌丝内部物质凝聚、较混乱分布，菌丝粗细不均（右图），不能正常生长。
3、筛选所得菌株的分子生物学鉴定
3.1、采用TIANGEN公司的试剂盒（DP320-03）提取菌株JSNL-TX55的基因组DNA。
3.2、分别扩增基因组DNA的ITS基因、BenA基因和CAL基因。DNA扩增采用30 μL的反应体积，包含15 µL 2×EasyTaq PCR SuperMix (+dye)，引物F/R各1 μL（10 μM），2 μL模板DNA和11 μL ddH2O，PCR扩增程序条件如下：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，54℃退火45s，72℃延伸60 s，共35个循环；最后72℃延伸10 min。
3.3、扩增所得PCR产物经过1％琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯下观察，将有目标条带的PCR产物送至南京擎科生物科技有限公司测序，测序结果为：步骤2筛选得到的菌株JSNL-TX55的 ITS基因序列为SEQ ID NO.1，BenA基因序列为SEQ ID NO.2。
3.4、在NCBI数据库网站上比对SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2两条序列。比对结果如表1所示。根据表1结果可以推定本发明的生防菌JSNL-TX55为Talaromyces fusiformis，命名为Talaromyces fusiformis JSNL-TX55。
表1 SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2序列比对结果
实施例2 Talaromyces fusiformis JSNL-TX55对草莓自身生长的影响
1、将菌株JSNL-TX55接种于直径9 cm的培养皿中（内含15 ml PDA培养基），25℃、避光培养7 d。
2、选择直径为12 cm的盆钵，将培养7 d的Talaromyces fusiformis JSNL-TX55的培养基切成0.5 cm×0.5 cm的平板块。试验设置2组，对照组为：每个盆钵加入2个0.5 cm×0.5 cm的 PDA平板块；实验组为：每个盆钵加入2个0.5 cm ×0.5 cm的Talaromyces fusiformis JSNL-TX55的平板块。用无菌水和灭菌的蛭石将各种平板块混合均匀，加入盆钵到1/3处，向每个盆钵中移栽3株长势一致的健康草莓苗（品种为甜宝），再覆盖一层薄的菌丝块与蛭石的混合物。每个处理设置3个重复。
3、用无菌水浇灌各组草莓，30 d后统计草莓的根长、株高和鲜重。
结果如图3和表2所示。
表2草莓株高、根长及鲜重统计结果
其中，表中株高、根长和鲜重的数值表达方式为：平均值±标准误差。
从图3和表2数据可知，实验组的根长、鲜重、茂密程度明显优于对照组，可见Talaromyces fusiformis JSNL-TX55对草莓植株存在促生作用。
实施例3 Talaromyces fusiformis JSNL-TX55对由B. cinerea引起的草莓灰霉病和由C. siamense引起的草莓炭疽病的影响
1、菌株JSNL-TX55对由B. cinerea引起的草莓灰霉病的影响
1.1、将Talaromyces fusiformis JSNL-TX55和B. cinerea分别接种于直径 9 cm的含有15 mL PDA培养基的培养皿中，置于25℃培养箱，避光培养5 d。
1.2、选择直径为12 cm的盆钵，将培养5天的Talaromyces fusiformis JSNL-TX55的培养基切成0.5 cm×0.5 cm的平板块。试验设置2组，对照组为：每个盆钵加入2个0.5 cm×0.5 cm的PDA平板块；实验组为：每个盆钵加入2个0.5 cm ×0.5 cm的JSNL-TX55的平板块。用无菌水和灭菌的蛭石将各种平板块混合均匀，加入盆钵到1/3处，向每个盆钵中移栽3株长势一致的健康草莓苗（品种为桃熏），再覆盖一层薄的菌丝块与蛭石的混合物。设置3个重复。
1.3、用无菌水反复冲洗生长5 d的B. cinerea PDA平板表面，使分生孢子均匀地散落于水中。将获得的分生孢子悬浮液用双层纱布过滤，用血球计数板在光学显微镜下计数，计算B. cinerea孢子悬浮液的浓度，然后调整到1.0×106个/mL备用。
1.4、用无菌水每隔一天浇灌各组草莓，7 d后用小型喷雾器将1.3所得B. cinerea孢子悬液加2滴吐温20喷雾接种到各处理植株上, 使叶片、叶柄布满水珠但不滴落，接种后罩塑料薄膜密闭保湿。接种1周后记录发病情况，计算叶片的发病率和病情指数。
其中，叶片病级数分级标准：0：无病斑；1：病斑面积占整个叶（果）面积的5%以下；2：病斑面积占整个叶（果）面积的6%～15%；3：病斑面积占整个叶（果）面积的16%～30%；4：病斑面积占整个叶（果）面积的31%～50%；5：病斑面积占整个叶（果）面积的50%以上。
发病率（%）=发病叶（叶柄、匍匐茎、花、果实）数/调查总叶片（叶柄、匍匐茎、花、果实）数×100；病情指数=［Σ（各级发病数×病级数）/（最高发病级数×调查总数）］×100；防治效果（%）=[（对照组病情指数-实验组病情指数）/对照组病情指数]×100。
结果如图4和表3所示。
表3草莓灰霉病发病率、病情指数和防治效果统计结果
从图4和表3可知，本发明的生防菌Talaromyces fusiformis JSNL-TX55能够显著降低植物灰霉病的病害严重度，其生防效果达到了87.15％，表明Talaromyces fusiformisJSNL-TX55对B. cinerea导致的草莓灰霉病有预防或防治的作用。
2、菌株JSNL-TX55对由C. siamense引起的草莓炭疽病的影响
2.1、将Talaromyces fusiformis JSNL-TX55和C. siamense分别接种于直径 9cm的含有15 mL PDA培养基的培养皿中，置于25℃培养箱，避光培养5 d。
2.2、采用步骤1.2的方法设置两组处理移栽草莓。草莓品种为甜宝。
2.3、采用步骤1.3的方法制得C. siamense孢子悬浮液，调整到1.0×105个/mL备用。
2.4、用无菌水每隔一天浇灌各组草莓，14 d后用小型喷雾器将2.3所得C. siamense孢子悬液加2滴吐温20喷雾接种到各处理植株上, 使叶片、叶柄布满水珠但不滴落，接种后罩塑料薄膜密闭保湿。接种1周后记录发病情况，计算叶片、叶柄和匍匐茎的发病率和病情指数。
其中，叶片病级数分级标准：0：无病斑；1：叶片边缘有针尖大小的褐点，或叶片出现褐色病斑，病斑面积占叶面积５%以下；3：出现近圆形或纺锤形灰褐色病斑，病斑面积占叶面积6%～10%；5：病斑中央出现黑色坏死斑，或叶片局部病斑连片，病斑面积占叶面积11%～25%；7：典型病斑，黑色坏死斑扩大，或叶缘枯死，病斑面积占叶面积26%～50%； 9：病斑面积占叶面积的50%以上，或叶片枯死。
叶柄和匍匐茎病级数分级标准：0：无病斑；1：病部出现浅红色和褪色晕圈，或红褐色斑点，病斑长度＜3.0 mm；2: 病斑扩大呈梭形，黑褐色凹陷，病斑长度在3-10.0 mm；3：典型的纺锤形病斑，病斑长度在11～20.0 mm，环绕叶柄或匍匐茎；4：叶柄或匍匐茎病部变黑，干缩，病斑长度＞20.0 mm，或整个叶柄坏死；5：根茎坏死，植株死亡。
发病率（%）=发病叶（叶柄、匍匐茎、花、果实）数/调查总叶片（叶柄、匍匐茎、花、果实）数×100；病情指数=［Σ（各级发病数×病级数）/（最高发病级数×调查总数）］×100；防治效果（%）=[（对照组病情指数-实验组病情指数）/对照组病情指数]×100。
结果如图5和表4所示。
表4草莓炭疽病发病率、病情指数和防治效果统计结果
从图5和表4可知，本发明的生防菌Talaromyces fusiformis JSNL-TX55能够显著降低植物炭疽病的病害严重度，其平均生防效果达到了61.51％，表明Talaromyces fusiformis JSNL-TX55对C. siamense导致的草莓炭疽病有预防或防治的作用。
除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。
Claims (6)
1.一种草莓灰霉病和炭疽病生防菌，其特征在于 ，所述生防菌为Talaromyces fusiformis JSNL-TX55，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO.40435。
2.一种能够防治B.cinerea引起的草莓灰霉病和C.siamense引起的草莓炭疽病的生防菌剂，其特征在于，其活性成分为如下一种或多种：
A1)权利要求1所述的Talaromyces fusiformis JSNL-TX55；
A2)权利要求1所述的Talaromyces fusiformis JSNL-TX55的菌丝或孢子。
3.根据权利要求2所述的生防菌剂，其特征在于，所述Talaromyces fusiformis JSNL-TX55的菌丝由Talaromyces fusiformis JSNL-TX55接种于PDA培养基培养制得。
4.权利要求2或3所述的生防菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：S1、制备无菌基质；
S2、向S1所述基质中加入Talaromyces fusiformis JSNL-TX55的菌丝或孢子；
S3、将S2得到的基质密封培养数天即得生防菌剂。
5.权利要求1所述的生防菌、权利要求2或3所述的生防菌剂在防治B.cinerea引起的草莓灰霉病和C.siamense引起的草莓炭疽病病害中的应用。
6.一种草莓灰霉病和草莓炭疽病的防治方法，其特征在于，所述方法包括向植物生长环境中施用权利要求1所述的生防菌或权利要求2或3所述的生防菌剂。
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