CN112322560B - 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在香梨病害防治中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株贝莱斯芽孢杆菌及其在香梨病害防治中的应用，属于植物病害生物防治技术领域。本发明从果蔬酵素发酵液细菌中筛选获得的一株对梨树腐烂病菌（Valsa mali var.pyri）、梨火疫病菌（Erwinia amylovora）和梨锈水病菌（Dickeya fangzhongdai）均具有显著抑菌作用的gjfn2菌株，经鉴定为贝莱斯芽孢杆菌，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2020年11月18日，保藏编号为CGMCC No.21203。本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌gjfn2菌体发酵液及其发酵液中的活性代谢产物对梨树腐烂病菌、梨火疫病菌和梨锈水病菌具有广谱抗性，具有选择性强、不易产生抗药性，安全高效、环境友好等突出优势，在梨树病害的生物防治方面具有巨大的潜力。

Description

一株贝莱斯芽孢杆菌及其在香梨病害防治中的应用

技术领域

本发明属于农用微生物技术领域，特别是涉及一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治香梨病害中的应用。

背景技术

中国是全球栽培梨的三大起源中心之一，也是全球主要的梨生产区域，梨种植面积和产量占世界梨栽培面积总产量的80%左右。库尔勒香梨（简称香梨）（Pyrus sinkiangensi，Kuerlexiangli）是新疆名优特水果，已有1400年栽培历史，主要分布在新疆巴州库尔勒和阿克苏地区。随着香梨产业生产的发展，种植规模扩大和栽培模式的改变，多种病害并发，防治难度大，成为影响生产的突出问题。由苹果黑腐皮壳梨变种（Valsa mali var. pyri）引起的梨树腐烂病是是梨树栽培生产中最重要真菌病害之一，在国内梨主产区均有分布，尤其在库尔勒香梨上危害最为普遍而严重，重病园病株率高达77.8％～100％。在梨树进入结果期后，持续低温、冻害、夏季高温、干燥，管理不当等导致树势衰弱，随着树龄的增加，腐烂病逐年加重，造成树皮腐烂、枝干枯死、大量死树甚至毁园。

梨锈水病是我国梨树上特有的一种危害枝干的新的细菌性病害，最早在江苏徐淮地区发现，在浙江、山东、德州、新疆等地也有发生，其病原近期鉴定为迪基氏菌属中的一个新种Dickeya fangzhongdai。梨火疫病是由解淀粉欧文氏菌（Erwinia amylovora）侵染梨、苹果等仁果类果树造成的最具毁灭性的细菌病害，为我国一类农作物病害和农业植物检疫性有害生物。该病害目前已扩散分布于世界近60个国家和地区，目前我国尚无发生的报道。最近十年内与我国毗邻的韩国、日本、哈萨克斯坦、吉尔吉斯斯坦和俄罗斯等国相继有发现梨火疫病的报道。随着林果品种引进和种苗调运，进口水果贸易增加，加剧了梨火疫病传播的风险性，是梨产业安全生产的重大隐患，值得高度关注并及早采取预防措施。

目前在生产中对梨树病害的防治仍然是主要依赖化学农药及配合水肥管理、增强树势和提高树体抗病能力进行预防，防治效果有限，至今都还没有用于梨树病害防治效果显著的专用登记药物。生产中安全高效的病害新防控技术匮乏，针对一种病害单一用药常顾此失彼，农药使用次数多、乱施滥用问题突出，不可避免地造成病原菌抗药性增加，果品农药残留超标和环境污染等一系列问题。

研究和实践证明，发掘对病原菌具有抑菌作用的有益微生物，利用其活体及其活性物质研制成生物菌剂防治植物病害，具有选择性强、不易产生抗药性、安全高效、环境友好等突出优势。优良的菌剂产品能达到优于或相当于化学农药的良好防效，在国家大力倡导农业生产方式转变，推行“农药化肥双减、农药负增长”行动方案的驱动下，有害生物的生物防治是现代林果生产发展的必然选择。因此，筛选出对多种植物病害具有兼防作用的优良菌株一直是本领域技术人员不断追求的目标。

发明内容

本发明的目的是针对梨树病害防治中存在的技术问题，提供从果蔬酵素发酵液细菌中筛选获得的一株对梨树腐烂病菌（Valsa mali var. pyri）、梨火疫病菌（Erwinia amylovora）和梨锈水病菌（Dickeya fangzhongdai）均具有显著抑菌作用的贝莱斯芽孢杆菌，及利用该菌株的发酵液或发酵滤液在梨树病害防治中的应用。

本发明提供一株贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）gjfn2菌株。该菌株已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。保藏日期为2020年11月18日，保藏编号为CGMCC No.21203。

本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）gjfn2的发酵培养液或发酵培养液的过滤液。

本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）gjfn2为活性成分的微生物菌剂。

本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）gjfn2的发酵培养液或发酵培养液的过滤液在防治香梨病害中的应用，其中，所述的病原细菌包括梨火疫病菌（Erwinia amylovora），梨锈水病菌（Dickeya fangzhongdai），所述的病原真菌包括梨树腐烂病菌（Valsa mali var. pyri）。

本发明所述的应用，优选将所述的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）gjfn2进行培养，得到菌株发酵培养液或发酵培养液的过滤液；用所得到的菌株发酵培养液或发酵培养液的过滤液应用于所述的香梨病害的生物防治。

本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）gjfn2对解淀粉欧文氏菌（Erwinia amylovora）引起的梨火疫病，方中达迪基氏菌（Dickeya fangzhongdai）引起的梨锈水病，苹果黑腐皮壳梨变种（Valsa mali var. pyri）引起的梨树腐烂病均显示出良好的生防效果。具有以下有益效果。

1.在杜梨盆栽苗试验中，贝莱斯芽孢杆菌gjfn2发酵液对梨火疫病具有较好的保护和治疗效果，防效与农用链霉素相当。

2.贝莱斯芽孢杆菌gjfn2发酵液和发酵滤液对梨树腐烂病菌分生孢子的萌发有明显的抑制作用，可显著降低腐烂病菌分生孢子的萌发率，并且菌体可致病原菌菌丝畸形，颜色明显加深，菌丝顶端显著膨大，部分菌丝细胞质外渗。同时在离体枝条试验中，发酵液和发酵滤液的保护型防效达到83.46%和75.72%。

3.在梨果针刺试验中，贝莱斯芽孢杆菌gjfn2发酵液对梨锈水病病菌有很好的保护效果，在接种病原菌第3天防效达到68.45%，第4天60.54%。

4.为农业上防治梨树病害提供了一种微生物菌株，对梨树腐烂病菌、梨火疫病菌和梨锈水病菌具有广谱抗性，与化学农药防效相当，同时可以有效避免化学农药带来的一系列问题，具有选择性强、不易产生抗药性，安全高效、环境友好等突出优势，在梨树病害的生物防治方面具有巨大的潜力。

附图说明

图1所示为贝莱斯芽孢杆菌gjfn2对梨树腐烂病菌、梨火疫病菌、梨锈水病菌的抑制效果图，其中A为梨树腐烂病菌，B为梨火疫病菌，C为梨锈水病菌。

图2所示为贝莱斯芽孢杆菌gjfn2在NA培养基上的菌落形态。

图3所示为贝莱斯芽孢杆菌gjfn2经革兰氏染色后在光学显微镜下的菌体形态图。

图4所示为基于16S rDNA基因构建的贝莱斯芽孢杆菌gjfn2的系统发育树。

图5所示为贝莱斯芽孢杆菌gjfn2对梨树腐烂病菌菌丝抑制作用，其中A为梨树腐烂病菌的为正常菌丝；B和C为对峙培养5天后梨树腐烂病菌的畸形菌丝。

图6所示为离体香梨枝条试验中贝莱斯芽孢杆菌gjfn2对梨树腐烂病保护性防治效果图，A为CK发病情况，B为贝莱斯芽孢杆菌gjfn2发酵液抑制梨树腐烂病发病情况，C为贝莱斯芽孢杆菌gjfn2发酵滤液抑制梨树腐烂病发病情况。

图7所示为离体香梨枝条试验中贝莱斯芽孢杆菌gjfn2对梨树腐烂病治疗性防治效果图，A为CK发病情况，B为贝莱斯芽孢杆菌gjfn2发酵液抑制梨树腐烂病发病情况，C为贝莱斯芽孢杆菌gjfn2发酵滤液抑制梨树腐烂病发病情况。

图8所示为杜梨盆栽苗试验中贝莱斯芽孢杆菌gjfn2对梨火疫病防治效果图，A为CK发病情况，B为保护性试验中杜梨盆栽苗梨火疫病发病情况，C为治疗性试验中杜梨盆栽苗梨火疫病发病情况。

图9所示为香梨果实试验中贝莱斯芽孢杆菌gjfn2对梨锈水病防治效果图，A为CK发病情况，B为保护性试验中香梨果实梨锈水病发病情况，C为治疗性试验中香梨果实梨锈水病发病情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步阐明本发明。

本领域技术人员应理解，这些实施例仅用于说明本发明而绝不对本发明的范围构成任何限制。除另有说明外，本申请中的所有科技术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解相同的含义。

本发明中选用的所有试剂和仪器都为本领域熟知选用的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。

以下实施例所采用的培养基具体如下所述：

NA培养基：牛肉浸出粉3.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，琼脂粉18.0 g/L，蒸馏水1000 mL，pH7.2。

NB培养基：牛肉浸出粉3.0 g/L， 蛋白胨10.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，蒸馏水1000mL，pH 7.2。

PDA培养基：去皮土豆200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g，水1000 mL，pH自然。

实施例1 拮抗菌的分离与筛选

（1）菌株的分离纯化：在新疆库尔勒收集农户采用西瓜和甜瓜等果蔬为原料自制的酵素发酵液，通过稀释平板法对酵素发酵液中的发酵细菌进行分离。根据平板上长出菌落的不同形态、颜色、大小挑取单菌落，反复划线纯化后，转接到NA培养基斜面，4℃保藏。

（2）待测菌株发酵液的制备：将待测菌株纯培养物接种于装有80 mL NB培养液的250 mL锥形瓶中，160 r/min、28℃恒温振荡培养1-2 d至菌液OD₆₀₀为0.8～1.0。

（3）梨火疫病菌和梨锈水病菌拮抗菌株的筛选：将梨火疫病菌和梨锈水病菌纯培养物接种于装有100 mL NB培养液的250 mL锥形瓶中，置于恒温振荡器中30℃、160 r/min富集培养12 h。吸取1 mL培养液稀释至10⁷ CFU/mL，并取100 µL菌悬液涂布于NA平板表面，在距培养皿边缘2 cm的培养基上放置3个灭菌的牛津杯（直径5 mm），每杯内滴加200 µL待测细菌菌株的发酵液，以加入等体积无菌NB培养液的处理作为对照，每处理重复3皿，26～28℃培养2-3 d后，十字交叉法测量相对抑菌圈大小，计算抑菌率。抑菌率（%）=［（抑菌圈直径-5 mm）/（抑菌圈直径）］×100。

（4）梨树腐烂病菌拮抗菌株的筛选：将梨树腐烂病菌接种于PDA培养基平板上，在28℃恒温培养箱中培养5天后，用灭菌打孔器沿菌落边缘取直径为6 mm的菌饼。将菌饼放置在无菌PDA培养基平板中央，同时以菌饼为中心在其上下左右2 cm处各放置一张直径为5mm的灭菌滤纸片，每纸片滴加5 µL待测菌株的发酵液，以滤纸片滴加5 µL NB培养液的处理作为对照，每处理重复3皿，25℃暗培养3天后测量梨树腐烂病菌菌落直径并计算其抑菌率。抑菌率（%）=［（对照病原菌直径-处理病原菌直径）/（对照病原菌直径-6）］×100。

试验结果表明，细菌菌株P-FN41、dc-FX43、xg-FX53、X2FN25、gjfn2对梨树腐烂病菌、梨火疫病菌、梨锈水病菌具有广谱抗性，其中菌株gjfn2对梨树腐烂病菌、梨锈水病菌和梨火疫病菌的抑菌效果最好，抑菌率分别为72.83%、75.75%、80.26%（见表1，图1）。

表1 梨树腐烂病菌、梨火疫病菌、梨锈水病菌拮抗菌株的筛选

实施例2 菌株gjfn2的鉴定

（1）菌株的形态和培养特征观察

将菌株gjfn2接种于NA固体培养基上进行培养，28℃培养24 h后，形成圆形，小而突起，呈乳白色，不透明，边缘不规则菌落（见图2）。光学显微镜下为短杆状，芽孢中央位，孢囊无明显膨大，革兰氏染色呈紫色，为革兰氏阳性菌（见图3）。

（2）gjfn2的生理生化特性

细菌菌株gjfn2的生理生化鉴定主要参照《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌鉴定手册》，鉴定结果如表2所示，gjfn2菌株的生理生化特性符合芽孢杆菌属的特征，与贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）模式菌株一致。

表2 菌株gjfn2生理生化特性测定结果

（3）菌株16S rDNA基因的序列测定及分析

提取gjfn2菌株总DNA为模板进行PCR扩增，引物为以细菌16S rRNA通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1429R（5'-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3'）。PCR反应体系为25 µL：DNA模板1.0 µL，10 µmol/L 27F/1429R各1.0 µL，10 mmol/L dNTPs 1.5 µL，10×PCR Buffer(2.5 mmol/L MgCl₂) 2.5 µL，2.5 U/µL TaqDNA 聚合酶0.5 µL，补足灭菌超纯水至25 µL。反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性45 s，58℃退火45 s，72℃延伸1.5min，35个循环；72℃延伸7 min，4℃保存。扩增产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测后，由上海生工生物工程股份有限公司对PCR产物进行克隆测序，测序结果见SEQ ID No: 1。

将所得的序列结果在美国国立生物信息中心（NCBI）进行BLAST检索，选择相似性高的模式菌株作为参比菌株，利用MEGA5.0软件中的邻接法（Neighbor-joining）构建16SrDNA 基因系统发育树，自展值（Bootstrap）1000。结果如附图4所示，菌株gjfn2与Bacillus velezensis多个菌株聚在形成一个分支，并且与贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）的模式菌株HC6同源性最高达到99.9%。

结合形态特征、生理生化特性及16S rDNA序列分析，将gjfn2菌株鉴定为贝莱斯芽孢杆菌。菌株已保藏于布达佩斯条约微生物国际保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。保藏日期为2020年11月18日，保藏编号为CGMCC No.21203。

实施例3贝莱斯芽孢杆菌gjfn2对梨树腐烂病菌分生孢子萌发和菌丝生长抑制作用

（1）贝莱斯芽孢杆菌gjfn2对梨树腐烂病分生孢子萌发的抑制作用

贝莱斯芽孢杆菌gjfn2发酵液的制备：将贝莱斯芽孢杆菌gjfn2菌株纯培养物接种于装有200 mL NB培养液的500 mL锥形瓶中，160 r/min、28℃恒温振荡培养1～2 d至菌液OD₆₀₀为0.8～1.0。

贝莱斯芽孢杆菌gjfn2发酵培养液的过滤液（简称发酵滤液）制备：收集200 mL发酵液在4℃条件下10000 r/min离心20 min，收集上清液经0.22 µm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存备用。

切取带有成熟腐烂病菌分生孢子器的梨树树皮组织置于50 mL无菌水中待分生孢子角充分溢出后，用5%香梨果汁或香梨枝条煎汁制备成浓度为10⁶ CFU/mL的孢子悬浮液备用。将贝莱斯芽孢杆菌gjfn2发酵液或发酵滤液和孢子悬浮液各取25 µL滴在凹玻片中央，并置于装有1%水琼脂的培养皿中密封，25℃恒温保湿，分别于12 h、24 h、36 h后显微镜下观察孢子萌发情况，每处理3个重复。

试验结果如表3所示，拮抗菌株贝莱斯芽孢杆菌gjfn2发酵液和发酵滤液对腐烂病菌分生孢子的萌发有明显的抑制作用，可显著降低腐烂病菌分生孢子的萌发率。到36 h，gjfn2发酵液及发酵滤液对梨树腐烂病分生孢子的抑制率分别为87.01%和88.19%。

表3 贝莱斯芽孢杆菌gjfn2发酵液及发酵滤液对分生孢子萌发抑制效果

（2）贝莱斯芽孢杆菌gjfn2对梨树腐烂病菌丝生长抑制作用

将活化的梨树腐烂病菌菌饼接种于PDA平板中央、拮抗菌株点接于四周后25℃恒温对峙暗培养，观察在菌落和梨树腐烂病菌菌落之间产生的抑菌带，5天后挑取受抑制的菌丝，在光学显微镜下观察贝莱斯芽孢杆菌gjfn2对梨树腐烂病菌菌丝形态的影响，以未接种gjfn2的腐烂病菌菌丝作为对照。

试验结果如附图5所示，显微镜观察受抑制的梨树腐烂病菌菌丝和对照菌丝。发现梨树腐烂病菌菌丝受贝莱斯芽孢杆菌gjfn2抑制后表现出异常形态，对峙培养5天后，病原菌菌丝颜色明显加深，菌丝顶端显著膨大，部分菌丝细胞质外渗。表明菌株代谢所产生的拮抗物质对梨树腐烂病菌丝生长具有显著的抑制作用。而对照腐烂病菌菌丝粗细均匀，菌丝生长笔直且略细。

实施例4 离体枝条法测定贝莱斯芽孢杆菌gjfn2对梨树腐烂病的防治作用效果

（1）离体枝条的处理

采集1-2年生香梨树枝条，剪取30 cm长、粗细一致的枝段，无菌水冲洗三次后用75%乙醇溶液浸泡5 min，晾干，两端封蜡防止水分散失。

（2）贝莱斯芽孢杆菌gjfn2对梨树腐烂病的保护性防效

用铁钉帽（Ф=5 mm）在枝条中部烫伤树皮，取一小块（约1 cm²）灭菌的脱脂棉蘸取1 mL贝莱斯芽孢杆菌gjfn2发酵液或发酵滤液贴在伤口部位，用保鲜膜包裹保湿24 h，以含无菌水的脱脂棉包裹的PDA培养基接种为对照。24 h后接种新鲜培养的梨树腐烂病菌菌饼（Ф=5 mm）1块，每个枝条2个接种点，重复5个枝条。将处理后的枝条放置在塑料托盘中，盘底铺有加无菌水的灭菌吸水纸，盘口覆盖保鲜膜保湿，在25℃恒温培养箱中培养，观察记录腐烂病的发生情况。7天后调查发病率，测量病斑大小并按照公式计算病斑面积，统计防治效果。病斑面积=π×病斑长边半径×病斑短边半径。防治效果（%）=［（对照病斑面积-处理病斑面积）/对照病斑面积］×100。

结果表明（见表4，图6），贝莱斯芽孢杆菌gjfn2发酵液和发酵滤液均具有抑菌活性，病斑面积显著低于对照，发酵液和发酵滤液的防治效果相当，分别为83.46%和75.72%。

表4 贝莱斯芽孢杆菌gjfn2对梨树腐烂病保护性防效

（3）贝莱斯芽孢杆菌gjfn2对梨树腐烂病治疗性防效

采用和预防性防效试验相同的方法处理枝条。接种顺序和预防性防效试验相反，即在枝条烫伤伤口处先接种梨树腐烂病菌饼，24 h后再取一小块（约1 cm²）灭菌的脱脂棉蘸取1 mL贝莱斯芽孢杆菌gjfn2发酵液或发酵滤液贴在伤口部位，以接种无菌水包裹的PDA培养基为对照，保鲜膜保湿24 h，于25℃恒温培养箱中培养，观察梨树腐烂病的发生情况，测量病斑大小，计算病斑面积和防治效果。

试验结果表明（见表5，图7），对照处理在接种梨树腐烂病菌后1-2天后即在枝条上出现典型的黑褐色环形病斑病斑。而贝莱斯芽孢杆菌gjfn2发酵液和发酵滤液处理后的病斑面积与对照的病斑面积有显著差异，病斑面积显著低于对照，对腐烂病菌均有不同程度的治疗作用，防效分别为68.45%、64.99%。

表5 贝莱斯芽孢杆菌gjfn2对梨树腐烂病治疗性防效

实施例5 贝莱斯芽孢杆菌gjfn2对梨火疫病杜梨盆栽苗的作用效果

（1）贝莱斯芽孢杆菌gjfn2对盆栽杜梨苗梨火疫病的保护性防效

以健康盆栽杜梨幼苗为接种材料。用手持式压力喷雾器将贝莱斯芽孢杆菌gjfn2菌液喷雾至叶片与枝条完全湿润，喷施5盆（约25个枝条），重复3次。同时设喷施农用链霉素（华北制药厂生产，有效成分72%）4000倍液为对照，以无菌水喷雾为空白对照。拮抗菌接种后的杜梨苗放入搭建的塑料膜保湿棚中，25~30℃，相对湿度90%、自然光照培养。48h后揭开塑料膜，72h后喷雾接种病原菌液，发病后每天观察发病情况，记录发病枝条数、测定枝枯长度、枝枯长度占接种枝条长度的比例及发病级别。根据统计结果，计算发病率和病情指数，统计防效。试验结束后将发病植株材料干热灭菌后销毁。

梨火疫病杜梨苗盆栽试验的病情分级标准为，0级：枝条正常无病斑；Ⅰ级：枝条病斑长度占接种枝条长度<1/3；Ⅲ级：枝条病斑长度占接种枝条长度的1/3～2/3；Ⅴ级：枝条病斑长度占接种枝条长度的>2/3。病情指数（DI）=∑（各级发病枝条数×病级代表值）×100/接种总枝条数×最高级值；防治效果（%）=（对照病情指数-处理病情指数）×100% /对照病情指数。

试验结果表明（见表6，图8），贝莱斯芽孢杆菌gjfn2对梨火疫病具有很好的保护效果，其在第10天时保护效果最好防效达到85.24%，与农用链霉素的防效相当（88.03%）。

表6贝莱斯芽孢杆菌 gjfn2对梨火疫病保护型性防效

（2）贝莱斯芽孢杆菌gjfn2对盆栽杜梨苗梨火疫病的治疗性防效

治疗性试验病原菌和拮抗菌的接种顺序与保护作用试验相反，即先在杜梨苗上喷施接种病原菌液72 h后再喷施洁抗菌液，其他试验材料及培养条件、防效调查方法均与保护作用试验一致。

试验结果表明（见表7，图8），贝莱斯芽孢杆菌gjfn2对梨火疫病具有很好的治疗效果，其在第10天时治疗效果最好防效达到61.78%，农用链霉素的防效为70.82%。

表7 贝莱斯芽孢杆菌gjfn2对梨火疫病治疗性防效

实施例6 贝莱斯芽孢杆菌对梨锈水病香梨果实的作用效果

（1）贝莱斯芽孢杆菌gjfn2对梨绣水病香梨果实的保护作用

采集巴州农科所试验田大小一致香梨梨果，用无菌水冲洗三次后，晾干。用喷壶将贝莱斯芽孢杆菌gjfn2菌液均匀喷在梨果表面，保湿24 h后，采用针刺法接种病原菌，把牙签尖部浸泡入10⁷ CFU/mL的梨锈水病菌菌液10 min，在梨果表面进行针刺接种，每梨果3个接种点，每个处理重复3个梨果，试验重复三次。将处理后的梨果放置在托盘中，在盘底铺有加无菌水的灭菌吸水纸，盘口覆盖保鲜膜保湿，在28℃恒温培养箱中培养，观察记录梨锈水病的发生情况， 测量病斑直径，统计防治效果。防治效果(%)=［(对照病斑直径－处理病斑直径)/对照病斑直径］×100。

试验结果表明（见表8，图9），贝莱斯芽孢杆菌gjfn2对梨锈水病具有很好的保护效果，其在第3天时治疗效果最好防效达到68.45%，第4天防效达到60.54%。

表8 贝莱斯芽孢杆菌gjfn2对梨锈水病保护性防效

（2）贝莱斯芽孢杆菌gjfn2对香梨果实梨锈水病的治疗性防效

采用和预防性防效试验相同的方法处理梨果。接种顺序和预防性防效试验相反，即在梨果上先接种梨锈水病菌，再接种贝莱斯芽孢杆菌gjfn2菌液，以接种无菌水为对照，保鲜膜保湿24 h，于28℃恒温培养箱中培养，观察记录梨锈水病的发生情况，测量病斑直径，统计防治效果。

试验结果表明（见表9，图9 ），贝莱斯芽孢杆菌gjfn2对梨锈水病具有一定的治疗效果，其在第3天时治疗效果达到24.82%。

表9 贝莱斯芽孢杆菌gjfn2对梨锈水病治疗性防效

序列表

<110> 新疆农业大学

<120> 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在香梨病害防治中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1438

<212> DNA

<213> 贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)

<400> 1

gctatacatg caagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta gcggcggacg 60

ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat aactccggga aaccggggct 120

aataccggat ggttgtttga accgcatggt tcagacataa aaggtggctt cggctaccac 180

ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt aacggctcac caaggcgacg 240

atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg gcccagactc 300

ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg gagcaacgcc 360

gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga acaagtgccg 420

ttcaaatagg gcggcacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa ctacgtgcca 480

gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg taaagggctc 540

gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag ggtcattgga 600

aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg gtgaaatgcg 660

tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac tgacgctgag 720

gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacgat 780

gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc 840

cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg cccgcacaag 900

cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt cttgacatcc 960

tctgacaatc ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt ggtgcatggt 1020

tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc aacccttgat 1080

cttagttgcc agcattcagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa accggaggaa 1140

ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac gtgctacaat 1200

ggacagaaca aagggcagcg aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat ctgttctcag 1260

ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa tcgcggatca 1320

gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca ccacgagagt 1380

ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct tttaggagcc agccgccgaa ggtggaca 1438

Claims (5)

1.一株贝莱斯芽孢杆菌及其在香梨病害防治中的应用，其特征在于所述菌株保藏名称为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）gjfn2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期是2020年11月18日，保藏编号为CGMCC No.21203。

2.如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌gjfn2的发酵培养液或发酵培养液的过滤液。

3.如权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌gjfn2为活性成分的微生物菌剂。

4.如权利要求2所述的贝莱斯芽孢杆菌gjfn2的发酵培养液或发酵培养液的过滤液在香梨病害防治中的应用，其中所述病害 的病原细菌包括梨火疫病菌Erwinia amylovora，梨锈水病菌Dickeya fangzhongdai，病原真菌包括梨树腐烂病菌Valsa mali var. pyri。

5.如权利要求4所述的应用，其特征是，包括将权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌gjfn2进行培养，得到菌株发酵培养液或发酵培养液的过滤液，用所得到的菌株发酵培养液或发酵培养液的过滤液应用于所述的香梨病害的生物防治。

Images