CN108330089A

CN108330089A - 一种广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌HNt7及制备方法和应用

Info

Publication number: CN108330089A
Application number: CN201810202569.4A
Authority: CN
Inventors: 徐文兴; 赵梓茜; 郭大勇; 尤华锋; 王利平; 洪霓; 王国平
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2018-03-13
Filing date: 2018-03-13
Publication date: 2018-07-27
Anticipated expiration: 2038-03-13
Also published as: CN108330089B

Abstract

本发明公开了一种广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌HNt7及制备方法和应用，拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌HNt7，编号为CCTCC M 2018022。步骤是：A、无菌环境下挑取贝莱斯芽孢杆菌HNt7菌株单菌落，接种于培养基，调节温度，振荡培养；B、每瓶装发酵液，按照比例加入单菌落菌液，放置在大振幅恒温冷冻摇床中，振荡培养；C、拮抗菌的分离：用浓度的酒精浸泡，再用无菌水漂洗，于培养箱中暗培养，将长出来的细菌菌落转移至新的培养基上划线分离纯化单菌落；D、分离纯化后，获得贝莱斯芽孢杆菌HNt7。该菌在制备治疗或预防梨果实腐烂病药物中的应用。该菌株具有显著的防病效果，防效达到70.76%以上。经过贝莱斯芽孢杆菌HNt7喷施的梨树，显著抑制梨树提前落叶，有利于增强树势。

Description

一种广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌HNt7及制备方法和应用

技术领域

本发明属于植物病害生物防治技术领域，更具体涉及一种广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌HNt7，同时还涉及一种广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌HNt7的制备方法，再涉及一种广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌HNt7的用途。

背景技术

梨树锈病由担子菌门胶锈菌属梨胶锈菌(Gynmosporangium haraeanum Syd.＝Gynmosporangium asiaticum Miyabe ex Yamada)引起，在中国梨园内发生较为普遍，可以导致叶片和果实脱落，严重影响产量。目前中国主要采用化学药剂进行防治，如代森锰锌、烯唑醇、三唑酮等，生物防治除了有报道采用梨胶锈菌重寄生菌(葡酒锈生座孢Tuberculina vinosa Sacc.)进行防治外，尚无商品化的生防制剂。长期施用化学农药可以导致农残超标，并易使病原菌产生抗药性，导致防治效果下降。此外，长期、反复和大量使用化学农药可引起土壤、水体和大气的污染，同时也杀伤了其他有益微生物，破坏了生态平衡。从植物内筛选利用有益微生物，抑制病原菌的生长进行防病具有显著的经济和生态效益。

目前，抗病微生物以芽孢杆菌为主，已经发现具有防病潜力的芽孢杆菌主要包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、短小芽孢杆菌(B.pumilis)、多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)、侧胞芽孢杆菌(B.laterosporus)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)等，但这些芽孢杆菌主要用于防治由曲霉、镰孢菌、链格孢、轮枝孢和腐霉菌引起的作物根部的病害如立枯病、猝倒病、枯萎病、根腐病、茎腐病、立枯病【Kabaluk T,Gazdik K:Directory of Microbial Pesticides for Agricultural Crops in OECDCountries.Agriculture and Agri-Food.http://www4.agr.gc.ca/resources/prod/doc/pmc/pdf/micro_e.pdf 2005,accessed November 2014】，没有涉及梨树锈病的防治。

贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)相关研究较少，前期报道该菌对棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae Kleb)、白菜黑斑病病菌(Alternaria brassicae)和番茄灰霉病灰菌(Botrytis cinerea Pers)和兰花枯萎病菌(Fusarium oxysporiumSchlecht.)具有拮抗作用【王伟,李术娜,李红亚,等.大丽轮枝菌拮抗细菌菌株12-51的筛选鉴定与抗菌物性质分析[J].中国农学通报,2009,25(19):14-19.杜淑涛,李术娜,朱宝成.白菜黑斑病拮抗细菌Bacillus velezensis DL-59的筛选鉴定及田间防效实验[J].河北农业大学学报,2010,33(6):51-56.王伟,李术娜,李红亚,等.番茄灰霉病拮抗细菌的筛选与X-75菌株鉴定[J].园艺学报,2010,37(2):307-312.索雅丽,李术娜,李红亚,等.番茄灰霉病菌颉颃菌株的筛选及功能基因的分析[J].中国植保导刊,2010,8:7-10.连彩,郭晓军,朱宝成,等.兰花枯萎病拮抗细菌的筛选与鉴定[J].华北农学报,2012,27(2):222-225】，韩国学者发现该菌S3-5菌株对稻瘟病菌等有强拮抗作用【Choegyeongja K,Jin C,et al.Bacillusvelezensis S3-5strain and method for the biological[P].Republic of Korea,2008,10-1089149】，欧洲有研究者已将该菌AH2菌株申请专利作为作物病害的生物制剂[Fernandez M AI,Villaverde F M J,Casanova R J A,et al.A pure culture ofstrain AH2of the Bacillus velezensis species and a product for thebiologicalcontrol of phytopathogenic fungi[P].Europe,2008,(PAT-EP2138044A1.]。目前，国内外尚无研究采用该菌进行梨树锈病的防治。

发明内容

本发明的目的是在于提供了一种广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌HNt7，革兰氏染色反应阳性，芽孢杆状，单生或两个串生，大小为0.8-(1.1)-1.3×2.3-(3.0)-4.2μm。该菌株具有广谱抗真菌活性，如对果生核盘菌(Monilinia fructicola)、拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis theae)、葡萄座腔菌(Botryosphaeria berengeriana)、链格孢菌(Alternaria alternata)、胴枯病菌(Phomopsis fukushii)等均具有显著的抑菌活性，贝莱斯芽孢杆菌HNt7具有较强的活性以及耐储存特性，对梨锈病具有良好的防治效果、环境友好、抗菌谱广和防止梨树早期落叶的效果。

本发明还有一个目的是在于提供了一种具有广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌HNt7的制备方法，方法易行，操作简便，制备的液体发酵液易溶于水，方便使用。

本发明还有一个目的是在于提供了一种广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌HNt7在制备治疗或预防梨树锈病药物中的应用，该菌株的发酵液对梨锈病具有显著的防病效果，防效达到70.76％以上，优于较常用的化学杀菌剂甲基硫菌灵的防效(59.49％-63.7％)。此外，经过贝莱斯芽孢杆菌HNt7喷施的梨树，可以显著抑制梨树提前落叶，有利于增强树势。

为了实现上述的目的，本发明采用以下技术措施：

一种广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌HNt7的制备方法，其步骤是：

A、无菌环境下挑取贝莱斯芽孢杆菌HNt7菌株单菌落，接种于装有25mL LB培养基(蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，蒸馏水1000ml，121℃高压蒸汽灭菌20min)的100mL三角瓶中，放置在恒温培养振荡器NSKY－200B中，调节温度为26－30℃、转速为150r/min，振荡培养22－26h。

B、需要准备500ml三角瓶10个，每瓶装200mL发酵液，每瓶按照1:100的比例加入上步制备的单菌落菌液，放置在大振幅恒温冷冻摇床中，26－30℃下150r/min振荡培养46－50h。

C、拮抗菌的分离：在湖北省武汉市华中农业大学茶园采集健康的台茶四号茶叶，先用浓度为75％的酒精浸泡28－32s，再用无菌水漂洗2－4次，用无菌解剖刀将其切成长度约1cm的正方形小块，放于PDA培养基(200g马铃薯、20g蔗糖、15g琼脂粉溶于1000mL蒸馏水，PH值7.0左右)上，于25℃培养箱中暗培养2－4d左右，将长出来的细菌菌落转移至新的PDA培养基上划线分离纯化单菌落。

D、分离纯化后，获得一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HNt7，菌株编号为HNt7，平板对峙实验中对多种致病菌(见下)具有很强的拮抗能力，田间对梨树锈病具有良好防效。对该菌提取DNA后，分别采用PCR技术扩增其16S rDNA、gyrB和rpoB部分基因，提交生物公司进行序列测定，获得了所述的核苷酸序列，序列为SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3，序列比对显示其与登录的贝莱斯芽孢杆菌相似性最高。该菌株分类命名为贝莱斯芽孢杆菌HNt7，保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M2018022。通过上述措施获得一株健康茶叶片上的拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)HNt7。

一株健康茶叶片上的拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HNt7，其于2017年1月12日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 2018022。

菌株HNt7经过发酵后可以应用于梨树锈病的防治，并可以阻止因锈病危害造成的梨树叶片脱落。

拮抗菌的分子鉴定:

对拮抗细菌基因组DNA的提取，以提取的DNA为模版，采用BSF(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和BSR(5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′)引物对16S rDNA部分序列进行扩增，预期大小为1500bp。PCR反应条件为95℃预变性4min，然后94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，35个循环，72℃再延伸5min，16℃终止。

采用同源引物(5’GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA3’)和互补引物(5’AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT)对gyrB部分序列进行扩增，预期大小约为1180bp。PCR反应条件为PCR反应程序：94℃2min，94℃1min，66℃1min，72℃2min，30个循环，72℃延伸7min，16℃保存。

采用同源引物(5’AGGTCAACTAGTTCAGTATGGAC3’)和互补引物(5’AAGAACCGTAACCGGCAACTT3’)对rpoB基因部分序列进行扩增，预期大小约为560bp。PCR反应程序：94℃2min，94℃30s，51℃45s，68℃50s，40个循环，68℃90s，16℃保存。

PCR产物都经浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳分析，将目标片段纯化后送上海生工生物工程技术服务有限公司测序。将获得序列与NCBI数据库中序列采用BLASTn进行相似性分析，结果表明菌株HNt7的16S rDNA序列(SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列)与Bacillusvelezensis NKG-1的16S rDNA序列(序列登陆号：CP024203.1)同源率为99％(coverage98％,E value 0.0,identity 99％)；gyrB序列(SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列)与Bacillus velezensis J01的gyrB序列(序列登陆号：CP023133.1)同源率为99％(coverage98％,E value 0.0,identity 99％)；rpoB序列(为SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列)与Bacillus velezensis S141的rpoB序列(序列登陆号：AP018402.1)同源率为99％(coverage 96％,E value 0.0,identity 99％)；

拮抗菌的菌落和形态特征

革兰氏染色反应阳性，芽孢杆状，单生或两个串生，大小为0.8-(1.1)-1.3×2.3-(3.0)-4.2μm(图1)。在LB平板上，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HNt7菌株的菌落呈圆形，淡黄色，有褶皱，不透明，菌落边缘常不整齐(图2)。

拮抗菌的液体发酵培养：

无菌环境下挑取贝莱斯芽孢杆菌HNt7菌株单菌落，接种于装有25mL LB培养基(蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，蒸馏水1000ml，121℃高压蒸汽灭菌20min)的100mL三角瓶中，放置在恒温培养振荡器NSKY－200B中，调节温度为28℃、转速为150r/min，振荡培养24h。每瓶装200mL发酵液，每瓶按照1:100的比例加入上步制备的单菌落菌液，放置在大振幅恒温冷冻摇床中，28℃下150r/min振荡培养48h。

一种广谱抑菌活性的多粘芽孢杆菌HNt7在作为保护梨树或预防梨树锈病的药物中的应用，其步骤是：

A、施药时期：在每年的3-4月份，采用手动喷雾器或机动喷雾器，在晴天早晨9时前和下午4时后或多云天气(主要为了避开高温时间)，进行喷雾施药，均匀喷施叶片表面。每隔10天再喷施1次，连续喷施3次。若喷施后24h遇到大雨天气，天晴后应再补施一次。

B、用量：取贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株HNt7发酵液，每亩地500ml，按照100-500倍浓度用水稀释。

C、叶片喷雾时候，可以与叶面肥和生长调剂剂一起使用。但不能与铜制剂或杀细菌剂混合使用。

拮抗菌的拮抗实验:

采用平板对峙法筛评价菌株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HNt7对真菌的拮抗活性：在PDA培养基上，用接种环取10μL摇培的菌液涂划于培养皿的一端，在离细菌线的6cm处接直径为5mm的菌丝块，设置无抑制菌处理为对照，每个处理重复3培养皿，于25℃暗培养，当对照组刚长满整培养皿时，测量各处理抑菌圈大小，根据有无抑菌带及抑菌带的大小判断其拮抗效果。

测试拮抗菌株包括果生核盘菌(Monilinia fructicola)、拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis theae)、葡萄座腔菌(Botryosphaeria berengeriana)、链格孢菌(Alternaria alternata)、胴枯病菌(Phomopsis fukushii)，由本实验室前期分离所得。结果显示，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HNt7对致病真菌均有强的抑菌作用，抑菌范围为12-30mm，且对不同的致病菌的抑菌效果具有显著性差异(图3)。

拮抗菌的田间防病实验：

2017年3月至4月在华中农业大学南湖梨园进行大田药效试验。实验药剂：7％甲基硫菌灵、贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HNt7发酵液、清水对照。

实验共设3个处理，每个品种的每个处理设置4个重复，每个重复3棵树。共计12个小区，36棵树。小区间设保护行。采用喷雾法处理，在晴天早晨9时前和下午4时后进行，避开高温时间。每隔10d喷一次，连喷3次。

调查方法：每小区采用五点取样法，每点自上至下调查30片叶子，调查发病情况，以片为单位记录各级病指数。

分级标准：

0级：没有发病

1级：每片叶有1～2个病斑；

2级：每片叶有3～4个病斑；

3级：每片叶有5～6个病斑；

4级：每片叶有7个及以上病斑。

结果显示，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HNt7发酵液具有显著的防病效果(图4)，在两个品种(黄花和丰水梨)的梨树上对梨锈病均表现良好的防病效果，防病达到62.03％和70.76％，优于化学农药甲基硫菌灵的防效(59.49％和63.7％)(表1)。秋季(9月中旬)观察落叶情况，喷施贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HNt7发酵液的梨树叶片仍保持绿色，较少落叶，而清水对照叶片已经大量脱落(图4)

表1采用贝莱斯芽孢杆菌HNt7发酵液和甲基硫菌灵防治梨锈病后的病情指数和防治效果

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

A、目前，抗病微生物以芽孢杆菌为主，已经发现具有防病潜力的芽孢杆菌主要包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、蜡样芽孢杆菌(B.cereus)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、短小芽孢杆菌(B.pumilis)、多粘芽孢杆菌(Paenibacillus polymyxa)、侧胞芽孢杆菌(B.laterosporus)、短小芽孢杆菌(B.pumilus)等，没有涉及梨树锈病的防治。

B、贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)相关研究较少，前期报道该菌对棉花黄萎病菌(Verticillium dahliae Kleb)、白菜黑斑病病菌(Alternaria brassicae)和番茄灰霉病灰菌(Botrytis cinerea Pers)和兰花枯萎病菌(Fusarium oxysporiumSchlecht.)具有拮抗作用，韩国学者发现该菌S3-5菌株对稻瘟病菌等有强拮抗作用。目前，尚无研究采用该菌进行梨树锈病的防治。

C、目前，其它芽孢杆菌是否可以用于梨锈病的防治尚缺乏室内和室外的药效试验数据，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HNt7是首次发现的对梨锈病具有良好防效的芽孢杆菌。

D、目前，其它芽孢杆菌是否对梨树早期落叶具有一定的防效尚缺乏室内和室外的药效试验数据，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HNt7是首次发现的对梨树早期落叶具有良好防效的芽孢杆菌。在黄花梨上对锈病防效为62.03％，在丰水梨上防效为70.76％，均优于对照化学农药甲基硫菌灵的防效(分别为59.49％和63.70％)。

附图说明

图1为一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HNt7透射电镜下观察到的细胞形态及革兰氏染色后在油镜先观察到的形态示意图。

HNt7透射电镜下观察显示呈杆状，有粘质层(a)；革兰氏染色后HNt7菌细胞呈紫色(b)，个别细胞中有芽孢，显示为革兰氏阳性。

图2为一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HNt7形态及抑制病原真菌的作用效果示意图。

PDA培养基下方为果生核盘菌(Monilinia fructicola)菌株，显示生长被周围菌株抑制；PDA培养基上方为(Bacillus velezensis)HNt7划线生长菌落。

图3为一种在PDA培养基上贝莱斯芽孢杆菌HNt7对6个真菌菌株的对峙抑菌效果分析示意图。

平板一端为划线的贝莱斯芽孢杆菌HNt7，距其6cm处的另一端为接种的真菌菌丝块。设置不加菌株HNt7，仅接种真菌菌丝块的平板为空白对照。所用真菌和菌株标注在平板上方。

YZ：果生核盘菌(Monilinia fructicola)YC-2-1：拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsistheae)

TCF3-4：链格孢菌(Alternaria alternata)MAO+：葡萄座腔菌(Botryosphaeriaberengeriana)

5-1：枝枯病菌(Phomopsis fukushii)3-1：链格孢菌(Alternaria alternata)

图4为一种HNt7田间防治梨锈病代表效果图。

左上：喷施清水对照秋季梨树叶片提前大量脱落；中上：喷施贝莱斯芽孢杆菌HNt7三次后梨树叶片仍保持绿色，很少脱落；右上：喷施甲基硫菌灵后梨树叶片部分脱落；左下：喷施清水对照梨树叶片；中下：喷施贝莱斯芽孢杆菌HNt7三次后梨树叶片；右下：喷施甲基硫菌灵后梨树叶片。

具体实施方式

实施例1：

无菌环境下挑取贝莱斯芽孢杆菌HNt7菌株单菌落，接种于装有25mL LB培养基(蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，蒸馏水1000ml，121℃高压蒸汽灭菌20min)的100mL三角瓶中，放置在恒温培养振荡器NSKY－200B中，调节温度为26-30℃、转速为150r/min，振荡培养24h。每瓶装200mL发酵液，每瓶按照1:100的比例加入上步制备的单菌落菌液，放置在大振幅恒温冷冻摇床中，26-30℃下150r/min振荡培养48h。

一种广谱抑菌活性的枯草芽孢杆菌DYr3.3的制备方法，其步骤是：

A、无菌环境下挑取贝莱斯芽孢杆菌HNt7菌株单菌落，接种于装有25mL LB培养基(蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，蒸馏水1000ml，121℃高压蒸汽灭菌20min)的100mL三角瓶中，放置在恒温培养振荡器NSKY－200B中，调节温度为26或28或30℃、转速为150r/min，振荡培养24h。

B、需要准备500ml三角瓶10个，每瓶装200mL发酵液，每瓶按照1:100的比例加入上步制备的单菌落菌液，放置在大振幅恒温冷冻摇床中，26或28或30℃下150r/min振荡培养46h。

C、在湖北省武汉市华中农业大学茶园采集健康的台茶四号茶叶，先用浓度为75％体积比的酒精浸泡30s，再用无菌水漂洗3次，用无菌解剖刀将其切成长度约1cm的正方形小块，放于PDA培养基(200g马铃薯、20g蔗糖、15g琼脂粉溶于1000mL蒸馏水，PH值7.0左右)上，于24或25℃培养箱中暗培养2或3d左右，将长出来的细菌菌落转移至新的PDA培养基上划线分离纯化单菌落。

D分离纯化后，获得一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HNt7，菌株编号为HNt7，平板对峙实验中对多种致病菌(见下)具有很强的拮抗能力，田间对梨树锈病具有良好防效。该菌株分类命名为贝莱斯芽孢杆菌HNt7，保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 2018022。

通过上述措施获得一株健康茶叶片上的拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)HNt7。

实施例2：

一种广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)在制备治疗或预防梨果实腐烂病药物中的应用，其步骤是：

A、施药时期：在每年的3或4月份，采用手动喷雾器或机动喷雾器，在晴天早晨9时前和下午4时后或多云天气(主要为了避开高温时间)，进行喷雾施药，均匀喷施叶片表面。每隔10天再喷施1次，连续喷施3次。若喷施后24h遇到大雨天气，天晴后应再补施一次。

B、用量：取贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株HNt7发酵液，按照100-500倍浓度用水稀释，每亩地500ml。

C、叶片喷雾时候，不能与铜制剂或杀细菌剂混合使用。

拮抗菌的拮抗实验

拮抗菌的发酵

拮抗菌的田间防病实验

分级标准：

0级：没有发病

1级：每片叶有1～2个病斑；

2级：每片叶有3～4个病斑；

3级：每片叶有5～6个病斑；

4级：每片叶有7个及以上病斑。

结果显示，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HNt7发酵液具有显著的防病效果(图4)，在两个品种(黄花和丰水梨)的梨树上对梨锈病均表现良好的防病效果，防病达到62.03％和70.76％，优于化学农药甲基硫菌灵的防效(59.49％和63.7％)(表1)。秋季(9月中旬)观察落叶情况，喷施贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HNt7发酵液的梨树叶片仍保持绿色，较少落叶，而清水对照叶片已经大量脱落(图4)。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌HNt7及制备方法和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1468

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggggaccttt ggcggcgttg ctaatacatg caagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc 60

cctgatgtta gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat 120

aactccggga aaccggggct aataccggat ggttgtctga accgcatggt tcagacataa 180

aaggtggctt cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt 240

aacggctcac caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga 300

ctgagacacg gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga 360

aagtctgacg gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agcttctgtt 420

gttagggaag aaacaagtgc cgttcaaata gggcggcacc ttgacggtac ctaaccagaa 480

agccacggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg 540

aattattggg cgtaaagggc tcgcaggcgg tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggs 600

tcaaacccgg ggagggtcat tggaaactgg ggaacttgag tgcagaagag gagagtggaa 660

ttccacgtgt agcggtgaaa tgcgtagaga tgtggaggaa caccagtggc gaaggcgact 720

ctctggtctg taactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg agcgaacagg attagatacc 780

ctggtagtcc acgccgtaaa cgatgagtgc taagtgttag ggggtttccg ccccttagtg 840

ctgcagctaa cgcattaagc actccgcctg gggagtacgg tcgcaagact gaaactcaaa 900

ggaattgacg ggggcccgca caagcggtgg agcatgtggt ttaattcgaa gcaacgcgaa 960

gaaccttacc aggtcttgac atcctctgac aatcctagag ataggacgtc cccttcgggg 1020

gcagagtgac aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt 1080

cccgcaacga gcgcaaccct tgatcttagt tgccagcatt cagttgggca ctctaaggtg 1140

actgccggtg acaaaccgga ggaaggtggg gatgacgtca aatcatcatg ccccttatga 1200

cctgggctac acacgtgcta caatggacag aacaaagggc agcgaaaccg cgaggttaag 1260

ccaatcccac aaatctgttc tcagttcgga tcgcagtctg caactcgact gcgtgaagct 1320

ggaatcgcta gtaatcgcgg atcagcatgc cgcggtgaat acgttcccgg gccttgtaca 1380

caccgcccgt cacaccacga gagtttgtaa cacccgaagt cggtgaggta accttttagg 1440

agccagccgc cgaagtgacc aagaattg 1468

<210> 2

<211> 1181

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atcggggaaa ggcgggatat aagtatccgg cggtcttcac ggtgtagggg catccgtcgt 60

aacgccttgt cgaccactct tgacgttacg gttcatcgtg acggaaaaat ccattatcag 120

gcgtacgagc gcggtgtacc tgtggccgat cttgaagtga tcggcgaaac tgataagacc 180

ggaacgatta cgcacttcgt tcctgacccg gaaattttca aagaaacaac tgtatatgac 240

tatgatctgc tttcaaaccg tgtccgggaa ttggccttcc tgacaaaagg cgtaaacatc 300

acgattgaag acaaacgtga aggacaagaa cggaaaaacg agtaccacta cgaaggcgga 360

atcaaaagct atgttgagta cttaaaccgt tccaaagaag tcgttcatga agagccgatt 420

tatatcgaag gcgagaaaga tggcataacg gttgaagttg cattgcaata caacgacagc 480

tatacaagca atatttattc tttcacaaat aatatcaaca catacgaagg cggcacgcac 540

gaggccggat ttaaaaccgg tctgacccgt gtcataaacg actatgcaag aagaaaaggg 600

attttcaaag aaaatgatcc gaatttaagc ggggatgatg tgagagaagg gctgactgcc 660

attatttcaa ttaagcaccc tgatccgcaa ttcgaagggc agacgaaaac caagctcggc 720

aactccgaag cgagaacgat cactgatacg ctgttttctt ctgcgctgga aacattcctt 780

cttgaaaatc cggactcagc ccgcaaaatc gttgaaaaag gtttaatggc cgcaagagcg 840

cggatggcgg cgaaaaaagc ccgggaattg acccggcgca aaagtgcgct tgagatttcc 900

aatctgccgg gcaaactggc ggactgttct tctaaagatc cgagcatttc cgagctgtat 960

atcgtagagg gtgactctgc gggcggatca gcgaaacagg gacgggaccg tcatttccaa 1020

gccattctgc cgctgcgcgg taagattctg aacgttgaga aagccagact tgataagatt 1080

ctctcaaaca atgaggtcag atcaatgatc acggccctcg gaacaggaat cggagaagat 1140

tttaatctga aaaagcgcgt atcataacgt tgtcaatccg c 1181

<210> 3

<211> 594

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tttataggtt tcaaactgtt cagtatggac gacaccgcca gcgcagaagc tatgctcgca 60

ttagcgaagt gttagaatta ccaaatctca ttgaaattca aacctcttct tatcagtggt 120

ttcttgatga gggtcttaga gagatgtttc aagacatatc accaattgag gatttcactg 180

gtaacctctc tctagagttc attgactaca gtttaggaga tcctaagtat cccgttgaag 240

agtcaaaaga acgtgatgtg acttactcag ctccgctaag agtgaaggtt cgtttaatta 300

acaaagaaac tggagaggta aaagaccagg atgtcttcat gggtgatttc cctattatga 360

cagataccgg tacttttatc atcaacggtg cagaacgtgt tatcgtatct cagcttgttc 420

ggtctccaag tgtatatttc agtggtaaag tagacaaaaa cggtaaaaaa ggttttaccg 480

cgactgtcat tccaaaccgt ggcgcatggt tagaatacga aactgatgcg aaagatgttg 540

tgtatgtccg cattgatcgc acacgtaagt tgccggtgac ggtttcttaa atta 594

Claims

1.一种广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌HNt7，其特征在于：拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）HNt7，保藏编号为CCTCC M 2018022。

2.根据权利要求1所述的一种广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌HNt7，其特征在于：所述的拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌HNt7菌株中含有SEQ ID NO：1所示的16S rDNA核苷酸序列。

3.根据权利要求1所述的一种广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌HNt7，其特征在于：所述的拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌HNt7菌株中含有SEQ ID NO：2所示的gyrB核苷酸序列。

4.根据权利要求1所述的一种广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌HNt7，其特征在于：所述的拮抗细菌贝莱斯芽孢杆菌HNt7菌株中含有SEQ ID NO：3所示的rpoB核苷酸序列。

5.权利要求1所述的一种广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌HNt7的制备方法，其步骤是：

A、无菌环境下挑取贝莱斯芽孢杆菌HNt7菌株单菌落，接种于装有25 mL LB培养基：蛋白胨10g，酵母膏5g，NaCl 10g，蒸馏水1000ml，121℃高压蒸汽灭菌20 min的100 mL 三角瓶中，放置在恒温培养振荡器中，调节温度为26－30℃、转速为150 r/min，振荡培养22－26h；

B、准备500 ml三角瓶10个，每瓶装200 mL发酵液，每瓶按照1:100的比例加入上步制备的单菌落菌液，放置在大振幅恒温冷冻摇床中，26－30℃下150 r/min振荡培养46－50h；

C、拮抗菌的分离：先用浓度为75%的酒精浸泡28－32 s，再用无菌水漂洗2－4次，用无菌解剖刀将其切成长度1cm的正方形小块，放于PDA培养基：200 g马铃薯、20 g蔗糖、15 g琼脂粉溶于1000 mL蒸馏水，PH值7.0，于25℃培养箱中暗培养2－4 d，将长出来的细菌菌落转移至新的PDA培养基上划线分离纯化单菌落；

D、分离纯化后，获得一种贝莱斯芽孢杆菌HNt7，菌株编号为HNt7。

6.权利要求1所述的一种广谱抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌在制备治疗或预防梨果实腐烂病药物中的应用，其步骤是：

A、施药时期：在每年的3-4月份，采用手动喷雾器或机动喷雾器，在晴天早晨9时前和下午4时后或多云天气，进行喷雾施药，均匀喷施叶片表面，每隔10天再喷施1次，连续喷施3次，喷施后24h遇到雨天气，天晴后应再补施一次；

B、用量：取贝莱斯芽孢杆菌菌株HNt7发酵液，按照100-500倍浓度用水稀释，每亩地500ml；

C、叶片喷雾时候，与叶面肥和生长调剂剂一起使用，不能与铜制剂或杀细菌剂混合使用。