CN110305813A

CN110305813A - 一种西姆芽孢杆菌、制备方法及其用途

Info

Publication number: CN110305813A
Application number: CN201910617717.3A
Authority: CN
Inventors: 林志楷; 林文珍; 卢秋华; 郭迟鸣
Original assignee: SUBTROPICAL CROPS INSTITUTE OF FUJIAN PROVINCE
Current assignee: SUBTROPICAL CROPS INSTITUTE OF FUJIAN PROVINCE
Priority date: 2019-07-10
Filing date: 2019-07-10
Publication date: 2019-10-08
Anticipated expiration: 2039-07-10
Also published as: CN110305813B

Abstract

本发明公开了一种西姆芽孢杆菌、制备方法及其用途。所述西姆芽孢杆菌为西姆芽孢杆菌Bacillus siamensis sp HY‑075，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC 60680。该菌株具有防治菜蔬植物病害的用途。

Description

一种西姆芽孢杆菌、制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及微生物领域，尤其涉及一种西姆芽孢杆菌及其用途。

背景技术

目前已申请专利的陆生土壤或植物内生的西姆芽孢杆菌(Bacillus siamensis)均是陆生土壤和植物内生，其用途是开发成肥料或者防治单一病害的生防菌剂。用于生防菌剂时，剂型配制工序复杂，大都是与多菌种、生化材料复配合成混合使用，工序复杂，成本高；而单一菌剂常以发酵液或发酵液提取物为原料，不易保存运输，使用不便。

同时随着可利用的陆生生物资源的逐渐减少，人们将目光转向其他生态系统，占地球资源71％的海洋继而成为首选。海洋生物约占地球生物种群总数的80％，拥有生理活性物质和新陈代谢产物的庞大资源。而从海洋生物尤其是海洋微生物中寻找特殊的先导化合物，筛选具有杀虫、杀菌、除草的农用抗生素，成为农药开发的新方向。

发明内容

本发明的目的在于提供一种海生来源的西姆芽孢杆菌。

为实现上述目的，本发明提供一种西姆芽孢杆菌Bacillus siamensis sp HY-075，其特征在于，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC 60680。

进一步，采用梯度稀释法从海洋材料中分离微生物细菌；将分离的微生物细菌培养用LB 培养基培养，挑取单菌落进行纯化培养，以7种常见农作物病原真菌为靶标，采用活菌对峙培养法结合纸片扩散法初筛，再采用活菌对峙培养法结合菌丝生长抑制率法复筛，选出对7 种病原真菌均具有抗真菌活性的细菌即为西姆芽孢杆菌Bacillus siamensis spHY-075。

进一步，所述海洋材料为南中国海-3000米科考挖取的深海沉积物。

进一步，所述7种常见农作物病原真菌为柑桔生疫霉菌Phytophthora citricola、草莓灰霉病灰葡萄孢菌Botrytis cinerea Pers.ex Fr.、黄瓜枯萎病尖镰孢菌Fusariumoxysporum、白术白绢病齐整小核菌Sclerotium rolfsii、菊花黑斑病细极链格孢菌Alternaria tenuissima、甘蓝立枯病立枯丝核菌Rhizoctonia solani和甘蓝黑斑病芸苔生链格孢菌Alternaria brassicicola。

本发明还保护所述西姆芽孢杆菌Bacillus siamensis sp HY-075的用途。

进一步，所述用途为防治菜蔬植物病害的用途；优选的，植物病害为柑桔生疫霉菌Phytophthora citricola、草莓灰霉病灰葡萄孢菌Botrytis cinerea Pers.ex Fr.、黄瓜枯萎病尖镰孢菌Fusarium oxysporum、白术白绢病齐整小核菌Sclerotium rolfsii、菊花黑斑病细极链格孢菌Alternaria tenuissima、甘蓝立枯病立枯丝核菌Rhizoctoniasolani 和甘蓝黑斑病芸苔生链格孢菌Alternaria brassicicola中的至少一种。

进一步，采用西姆芽孢杆菌Bacillus siamensis sp HY-07的发酵液或粉剂稀释后直接喷施到菜蔬叶片以及灌根。

进一步，所述粉剂为将西姆芽孢杆菌Bacillus siamensis sp HY-075发酵，获得含菌量大于1×10⁹CFU/mL浓度菌液，加10m/v％灭菌硅藻土后电磁搅拌器常温下中速搅拌后离心，取沉降物冷冻干燥，粉碎颗粒过60目筛混匀制得粉剂。

进一步，所述粉剂稀释为用水将粉剂按照1:50-1:200的体积比进行稀释。

即使是同种属细菌，海洋环境多样性孕育出的菌株也更具多样性，抗病潜力更大。单一菌株粉剂制备工序简单，生产成本低，便于保存及供农业使用。

本技术方案：为获得对植物真菌具有稳定拮抗作用的菌株，从深海沉积物中分离纯化的菌株进行微生物分离，并以病害甘蓝炭疽病等7种病原菌为靶标菌株，采用平板对峙法和含药介质法对拮抗菌的抑菌活性进行评价，同时根据形态特征、培养特征及生理生化特征和1 6SrDNA序列分析对其进行鉴定，筛选出具有高效拮抗作用的菌株。通过人工发酵培养繁殖足量活性菌体，研制活性菌株粉剂。最后进行田间试验。

本发明的技术方案具有如下优点：

1、所用原料简单明了，使用单一生防菌种，添加物仅为硅藻土，加工省时省力，任何普通生物实验室都能具备研制的条件，适合大规模生产。

2、活菌生物农药防治效果显著，田间包菜种植实验显示，在接种病原菌后，取粉剂按体积比1:200的纯净水配制成水溶液对包菜施药三周，对包菜病害的防预率接近90％。

3、西姆芽孢杆菌为海洋菌株，相对陆生菌株其特异性更强，更具广谱抗菌性，试验证明可对多种植物病害真菌起抑制作用，后续研究及开发潜力更巨大。

附图说明

图1是本发明所述西姆芽孢杆菌Bacillus siamensis sp HY-075的电子显微镜观察图。

图2是包菜发病程度中判定为1级的示意图。

图3是包菜发病程度中判定为4级的示意图。

图4是实施例2包菜试验效果验证的结果图。

图5是实施例中采用本发明所制备的西姆芽孢杆菌粉剂喷施组的效果图。

图6是实施例中采用空白清水对照组的效果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：菌株的分离与提取

海洋材料：海洋材料为南中国海-3000米科考挖取的深海沉积物，由国家海洋局第三海洋研究所海洋生物遗传资源重点实验室汤熙翔副研究员惠赠。

7种常见农作物病原真菌：均购自中国农业微生物菌种保藏管中心，具体为柑桔生疫霉菌株编号36282(Phytophthora citricola)、草莓灰霉病灰葡萄孢菌菌株编号37271(Botrytis cinerea Pers.ex Fr.)、黄瓜枯萎病尖镰孢菌菌株编号36933(Fusariumoxysporum)、白术白绢病齐整小核菌菌株编号37946(Sclerotium rolfsii)、菊花黑斑病细极链格孢菌菌株编号37286(Alternaria tenuissima)、甘蓝立枯病立枯丝核菌菌株编号37289(Rhizoctonia solani)、甘蓝黑斑病芸苔生链格孢菌菌株编号37290(Alternariabrassicicola)。

采用梯度稀释法从海洋材料中分离微生物细菌。分离的微生物细菌培养用LB培养基培养。挑取单菌落进行纯化培养，根据菌株形态编号记录并超低温保存，备用。

以7种常见农作物病原真菌为靶标，采用活菌对峙培养法结合纸片扩散法初筛，采用活菌对峙培养法结合菌丝生长抑制率法复筛，选出对7种病原真菌均具有抗真菌活性的细菌。

初步筛选方法为：用直径约6mm的打孔器打取培养3d的靶标病菌菌饼置于PDA培养基中央，在菌饼中心等距约12mm处放置蘸透待测菌株菌液的6mm滤纸片，每平板接种4个待测菌株，以不接任何待测菌株的靶标菌株为对照，3次重复。28℃培养4～6d后，观察透明抑菌圈的有无以代表是否有抑菌作用。

复筛选方法为：经初筛试验，菌株HY-075对7种病菌均能形成抑菌圈。进行单一生防菌与病菌对峙培养。将病菌菌饼置于圆形培养皿中心培养，距中心一侧约2.25cm处放置生防菌HY-075，测量抑菌带宽度，见表1。将HY-075用LB培养基摇瓶37℃培养3d后，转速180r/min，4℃离心10min。取上清液经22μm的细菌过滤器过滤，将滤液按体积比1:9与 PDA培养基充分混合倒平板。用6mm打孔器打取生长3d的靶标菌菌饼置于含滤液的PDA培养基上。以纯PDA培养基为对照。每个处理重复3次。28℃培养4～6d至对照菌落长至全皿时，观察测量靶标菌落直径计算菌丝生长抑制率。菌丝生长抑制率＝1-(处理菌落直径-菌饼直径) ÷(对照菌落直径-菌饼直径)×100％。见表1。

表1 HY-075对7种病原真菌抑制试验结果数据表

根据形态特征、16SrDNA序列分析、电子显微镜观察，鉴定其中抑菌效果最好的一株菌株所属种为西姆芽孢杆菌(Bacillus siamensis)。该株菌命名为西姆芽孢杆菌Bacillus siamensis sp HY-075。

该菌株的保藏信息为：

菌株名称：Bacillus siamensis sp HY-075，

保藏日期：2019-6-3，

保藏单位：广东省微生物菌种保藏中心，广州市先烈中路100号大院59号楼五楼。

保藏编号：GDMCC 60680。

鉴定：

1)16s rDNA鉴定：

用16s rDNA引物从西姆芽孢杆菌的基因组DNA中PCR扩增得到1条1387bp长的条带，将扩增产物测序(所述序列见SEQ ID NO:1)(上海美吉生物)，获得序列在NCBI上检索与 Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus velezensis、Bacillus siamensis三种菌的序列均高度一致；进一步在EzTaxon中进行同源序列检索，结果显示与Bacillussiamensis KCTC 13613(T)模式种比对结果相似度最高为99.93％；结合文献报道对氯化钠14％的强耐受性成为区分西姆芽孢杆菌与其他枯草群菌株的重要特征(对该菌进行微生物学特性测试试验，在LB液体培养基中添加氯化钠使终浓度为14％，摇瓶培养该菌可缓慢生长)。因此确定其为西姆芽孢杆菌。据查询，在GenBank数据库中有KCTC 13613T(AJVF00000000)西姆芽孢杆菌在分类学获得了全基因组数据的支持，其核心基因的同源性较高，可作为其他菌株是否是西姆芽孢杆菌的最重要依据。

SEQ ID NO:1如下所示：

2)微生物学特性

该菌株革兰氏反应呈阳性，好氧兼性厌氧，能水解淀粉及纤维素。LB培养基上培养2d 形成菌落，大小3–4mm、圆形、乳白色、粘稠状、有拉丝感、边缘整齐、凸起、呈褶皱。生长温度4–55℃,最适生长温度37℃,耐Nacl浓度为14％,生长pH为5–9.0,最适生长pH为 6–7。

电子显微镜观察形态：该菌周生鞭毛，具运动性；结果见图1。

根据伯杰细菌鉴定手册第九版判断其属于西姆芽孢杆菌。

将筛选出的西姆芽孢杆菌通过摇瓶发酵，获得含菌量大于1×10⁹CFU/mL浓度菌液，加 10％(m/v)灭菌硅藻土电磁搅拌器常温下中速搅拌半小时后离心，取沉降物冷冻干燥，粉碎颗粒过60目筛混匀制得粉剂。

实施例2：包菜试验效果验证

取实施例1所得的粉剂分别按体积比1:50，1:100,1:200,1:400，1:800用水来稀释， (结果表明1:200与1:50，1:100效果差异不显著，为节约用药成本选择1:200)配制成水溶液，在包菜的植物病害(混合7种病原菌的植物病害：将7种病菌在PDA培养基上培养7d，分别用5mL0.02％的吐温20溶液洗下培养基上的病菌孢子，混合制得联合病菌孢子悬浮液，1:100以生理盐水稀释，将孢子悬浮液喷洒在包菜基部叶片处)。高发期前(3月)，喷施包菜的植株叶片以及灌根。用药周期为一周一次，前后一共3次。每次的喷施量为以叶面湿润又刚好不滴水为佳。

每大棚内分4垄，每垄种植10株包菜，一垄为一个处理组，3月全株喷施。A垄为使用西姆芽孢杆菌发酵液直接喷施组，B垄为本发明所制备的西姆芽孢杆菌粉剂喷施组(见图5)， C垄为清水对照组(见图6)，D垄为50％多菌灵可湿性粉剂1000倍液喷施组。喷药3d后用喷雾法接种7种病原真菌的混合孢子液。3次重复。30d后计算防治效果。包菜发病程度采用4级分级标准:0级,无症状；1级，仅茎基部或部分叶片产生病斑(如图2所示)；2级，染病部位占整株的三分之一以下；3级，染病部位占整株的三分之二以下；4级，植株接近或已经死亡(如图3所示)。病情指数＝∑(各级级值×各级病株数)×100÷(最高级值× 调查总株数)；防治效果＝[(空白对照病情指数-处理病情指数)÷空白对照病情指数]× 100％。结果见图4和表2。

图4-6和表2的结果表明本发明的西姆芽孢杆菌粉剂对7种病原菌的防治效果与多菌灵相当接近90％，且相较于西姆芽孢杆菌发酵液效果更加显著。

清水(C垄)作为无防治效果的空白对照组，无使用任何农药和生防菌，多数包菜植株发病程度4级，病情指数为86.7％。证明所制备联合病菌孢子悬浮液致病性高，符合试验需求。

多菌灵是一种广谱性杀菌剂，对多种作物由真菌病害有防治效果，在我国使用广泛，但多菌灵对哺乳动物有毒害。因此以多菌灵(D垄)为传统生化农药阳性对照。结果显示防治效果达89.4％。

西姆芽孢杆菌发酵液(A垄)是参照其他发明专利方法，直接喷施经水洗的发酵16h菌液，统计结果发病程度4级和3级各只有一株，其余零星有1级和2级病情。防治效果达80.7％。

西姆芽孢杆菌粉剂(B垄)暨为使用本发明制备的菌剂，统计结果为无观察到4级和3 级发病程度，零星有1级和2级病情，防治效果良好达88.5％。结果B垄较于A垄防治效果明显更高。本发明所制备的粉剂包含生防菌活菌体，适合储藏运输，无需受发酵液保存期短的限制。发酵液中活菌数有饱和度，而粉剂却可以达到更高的活菌承载量。

表2：包菜病害田间防治试验结果数据表(处理30天后)

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

SEQUENCE LISTING

<110> 福建省亚热带植物研究所

<120> 一种西姆芽孢杆菌、制备方法及其用途

<130> YRDZ-19001-CNI

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1387

<212> DNA

<213> 西姆芽孢杆菌

<400> 1

acagatggga gcttgctccc tgatgttagc ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc 60

tgcctgtaag actgggataa ctccgggaaa ccggggctaa taccggatgg ttgtttgaac 120

cgcatggttc agacataaaa ggtggcttcg gctaccactt acagatggac ccgcggcgca 180

ttagctagtt ggtgaggtaa cggctcacca aggcgacgat gcgtagccga cctgagaggg 240

tgatcggcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtaggga 300

atcttccgca atggacgaaa gtctgacgga gcaacgccgc gtgagtgatg aaggttttcg 360

gatcgtaaag ctctgttgtt agggaagaac aagtgccgtt caaatagggc ggcaccttga 420

cggtacctaa ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt 480

ggcaagcgtt gtccggaatt attgggcgta aagggctcgc aggcggtttc ttaagtctga 540

tgtgaaagcc cccggctcaa ccggggaggg tcattggaaa ctggggaact tgagtgcaga 600

agaggagagt ggaattccac gtgtagcggt gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaccag 660

tggcgaaggc gactctctgg tctgtaactg acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa 720

caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg ttagggggtt 780

tccgcccctt agtgctgcag ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt acggtcgcaa 840

gactgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt 900

cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct tgacatcctc tgacaatcct agagatagga 960

cgtccccttc gggggcagag tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag 1020

atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttgatct tagttgccag cattcagttg 1080

ggcactctaa ggtgactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat 1140

catgcccctt atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg acagaacaaa gggcagcgaa 1200

accgcgaggt taagccaatc ccacaaatct gttctcagtt cggatcgcag tctgcaactc 1260

gactgcgtga agctggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc 1320

ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc acgagagttt gtaacacccg aagtcggtga 1380

ggtaacc 1387

Claims

1.一种西姆芽孢杆菌Bacillus siamensis sp HY-075，其特征在于，其保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC 60680。

2.如权利要求1所述西姆芽孢杆菌Bacillus siamensis sp HY-075，其特征在于，采用梯度稀释法从海洋材料中分离微生物细菌；将分离的微生物细菌培养用LB培养基培养，挑取单菌落进行纯化培养，以7种常见农作物病原真菌为靶标，采用活菌对峙培养法结合纸片扩散法初筛，再采用活菌对峙培养法结合菌丝生长抑制率法复筛，选出对7种病原真菌均具有抗真菌活性的细菌即为西姆芽孢杆菌Bacillus siamensis sp HY-075。

3.如权利要求1所述西姆芽孢杆菌Bacillus siamensis sp HY-075，其特征在于，所述海洋材料为南中国海-3000米科考挖取的深海沉积物。

4.如权利要求3所述西姆芽孢杆菌Bacillus siamensis sp HY-075，其特征在于，所述7种常见农作物病原真菌为柑桔生疫霉菌Phytophthora citricola、草莓灰霉病灰葡萄孢菌Botrytis cinerea Pers.ex Fr.、黄瓜枯萎病尖镰孢菌Fusarium oxysporum、白术白绢病齐整小核菌Sclerotium rolfsii、菊花黑斑病细极链格孢菌Alternaria tenuissima、甘蓝立枯病立枯丝核菌Rhizoctonia solani和甘蓝黑斑病芸苔生链格孢菌Alternariabrassicicola。

5.一种权利要求1所述西姆芽孢杆菌Bacillus siamensis sp HY-075的用途。

6.如权利要求5所述西姆芽孢杆菌Bacillus siamensis sp HY-075的用途，其特征在于，所述用途为防治菜蔬植物病害的用途；优选的，植物病害为柑桔生疫霉菌Phytophthoracitricola、草莓灰霉病灰葡萄孢菌Botrytis cinerea Pers.ex Fr.、黄瓜枯萎病尖镰孢菌Fusarium oxysporum、白术白绢病齐整小核菌Sclerotium rolfsii、菊花黑斑病细极链格孢菌Alternaria tenuissima、甘蓝立枯病立枯丝核菌Rhizoctonia solani和甘蓝黑斑病芸苔生链格孢菌Alternaria brassicicola中的至少一种。

7.如权利要求5所述西姆芽孢杆菌Bacillus siamensis sp HY-075的用途，其特征在于，采用西姆芽孢杆菌Bacillus siamensis sp HY-07的发酵液或粉剂稀释后直接喷施到菜蔬叶片以及灌根；优选的，所述菜蔬为包菜。

8.如权利要求7所述西姆芽孢杆菌Bacillus siamensis sp HY-075的用途，其特征在于，所述粉剂为将西姆芽孢杆菌Bacillus siamensis sp HY-075发酵，获得含菌量大于1×10⁹CFU/mL浓度菌液，加10m/v％灭菌硅藻土后电磁搅拌器常温下中速搅拌后离心，取沉降物冷冻干燥，粉碎颗粒过60目筛混匀制得粉剂。

9.如权利要求7所述西姆芽孢杆菌Bacillus siamensis sp HY-075的用途，其特征在于，所述粉剂稀释为用水将粉剂按照1:50-1:200的体积比进行稀释。