CN112961811B

CN112961811B - 一株防治核桃落果病的芽孢杆菌及应用

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Publication number: CN112961811B
Application number: CN202110424403.9A
Authority: CN
Inventors: 杨莉; 王新; 杨育林; 杨双昱; 杨远亮
Original assignee: SICHUAN ACADEMY OF FORESTRY
Current assignee: SICHUAN ACADEMY OF FORESTRY
Priority date: 2021-04-20
Filing date: 2021-04-20
Publication date: 2022-12-23
Anticipated expiration: 2041-04-20
Also published as: CN112961811A

Abstract

本发明公开了一株防治核桃落果病的芽孢杆菌及应用，芽孢杆菌为Bacillus siamensis菌株CT04，于2018年6月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.15943，以期望解决现有的通过化学药剂防治核桃该病害，不仅会增强病原微生物的抗药性，降低防治效果，而且会对环境造成严重污染，并危及人、畜健康与安全和生态环境的问题。

Description

一株防治核桃落果病的芽孢杆菌及应用

技术领域

本发明涉及微生物应用领域，更具体的说，本发明主要涉及一株防治核桃落果病的芽孢杆菌及应用。

背景技术

核桃（Juglans regis L）是世界四大干果之一，果实营养丰富，含有人体所需的多种微量元素，和不饱和脂肪酸。四川省是我国核桃生产大省，资源极其丰富，产量居全国第二。近年来四川核产业发展迅猛，全省核桃栽培面积和产量由20世纪50年代的7万亩及年产606t发展到2000年的97.5万亩及年产29834.39t,到2016年底核桃种植面积已达1.95亿亩。但核桃病害发生也呈现爆发趋势。

核桃落果病是由已知的炭疽病菌（Colletotrichum gloeosporioides）、链格孢菌（Alternaria alternata）复合侵染引起的核桃果实黑果、烂果、提前掉果，对核桃产业造成巨大的经济损失，该病害是目前四川地区阻碍核桃产业发展的最重要问题。

目前核桃该病害的防治采用的是化学药剂防治，但长期使用化学农药，不仅会增强病原微生物的抗药性，降低防治效果，而且会对环境造成严重污染，并危及人、畜健康与安全和生态环境。而生物防治是目前病虫害防治的热点，生物防治对环境无污染，对人、畜无危害，能有效的防治病虫害。

发明内容

本发明的目的之一在于解决上述不足，提供一株防治核桃落果病的芽孢杆菌及应用，以期望解决现有的通过化学药剂防治核桃该病害，不仅会增强病原微生物的抗药性，降低防治效果，而且会对环境造成严重污染，并危及人、畜健康与安全和生态环境的问题。

为解决上述的技术问题，本发明采用以下技术方案：

本发明提供一株防治核桃落果病的芽孢杆菌，其特征在于：所述芽孢杆菌为Bacillus siamensis菌株CT04，于2018年6月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.15943。

本发明还提供一种防治核桃落果病的芽孢杆菌菌剂的制备方法，包括如下步骤，步骤a，将芽孢杆菌菌株在LB固体培养基进行培养，LB固体培养基进行培养中各组分质量分别为，NaCL6～8g，酵母浸膏4～6g，胰蛋白胨8～12g，琼脂粉16～24g，双蒸水定容至1L，pH值为7.0，并划线培养，培养温度30℃，培养时间为24h；步骤b，挑取单菌落接种于LB液体培养基中进行培养，LB液体培养基中各组分质量分别为，NaCL6～8g，酵母浸膏4～6g，胰蛋白胨8～12g，双蒸水定容至1L，pH值为7.0，温度30℃，转速160r/min振荡培养，培养20h；步骤c，将由步骤b制得的培养产物于8000 r/min，离心5min后，静置5～10min，并弃上清，所得沉淀为芽孢杆菌菌体；步骤d，将由步骤c所制得的芽孢杆菌菌体用双蒸水稀释到10⁸～10⁹cfu/mL，即制得防治核桃落果病的芽孢杆菌菌剂。

更进一步的技术方案是：在步骤a中，所述LB固体培养基中各组分质量分别为NaCL7g，酵母浸膏5g，胰蛋白胨10g，琼脂粉20g。

更进一步的技术方案是：在步骤b中，LB液体培养基中各组分质量分别为NaCL7g，酵母浸膏5g，胰蛋白胨10g。

更进一步的技术方案是：所述芽孢杆菌菌剂的活性成分包括芽孢杆菌的发酵培养物、芽孢杆菌、芽孢、发酵上清液。

本发明还提供一种生物农药，所述生物农药包括防治核桃落果病的芽孢杆菌菌剂。

本发明还提供一种防治核桃落果病的方法，包括向具有落果病的核桃施用Bacillus siamensis菌株CT04的菌剂。

与现有技术相比，本发明的有益效果之一是：本发明的Bacillus siamensis菌株CT04具有菌株新颖、高效、活体菌含量高的特点，其发酵原粉防治核桃落果病效果显著，防治率达到82.65%，且核桃生长健壮，无药害产生；同时具有安全高效，无药残，无毒副作用，能减少化学农药的使用，因而在生物防治核桃中具有重要的应用前景；同时Bacillus siamensis菌株CT04对核桃炭疽病病原菌和核桃褐斑病病原菌菌丝生长具有较强的抑制作用。

附图说明

图1为本发明中基于16srDNA 构建的菌株CT04系统进化树。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步阐述。

本发明提供一株防治核桃落果病的芽孢杆菌，所述芽孢杆菌为Bacillus siamensis菌株CT04，于2018年6月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.15943。

实施例1

菌株CT04的分离、鉴定和保藏

本发明的Bacillus siamensis菌株CT04是从四川省广元市朝天区曾家山核桃种植区土壤中采用土壤稀释分离法分离获得的。

1、分离

（1）土样采集：在核桃种植区随机取样，从土壤表层到15cm处取样，每处取200g，过粗筛，取10g作分离用；

（2）平板制备：将已灭菌的LB固体培养基融化，倒入已灭菌的培养皿中，冷却，制成平板，备用；

（3）称取10g土样于已灭菌的三角瓶中，加入90ml无菌水，摇床上170r/min，振荡5min，制成土壤悬浮液，静置10min，取上清，用双蒸水稀释到10⁶ cfu/mL。

（4）取上述土壤悬浮液100µl，用无菌玻璃棒涂布于LB平板上，无菌风吹干，置于培养箱28℃恒温培养24h。

（5）用无菌牙签挑取单菌落在LB固体培养基上划线，得到纯化后的菌株，再挑取单菌落转移至LB培养基中28℃恒温培养。

（6）采用平板对峙法，以核桃炭疽病和核桃褐斑病病原菌为靶标菌，通过平板对峙法筛选到一株对核桃炭疽病和核桃褐斑病具有较强抑制活性的菌株，编号为CT04。

所述LB固体培养基配方为：NaCL7g，酵母浸膏5g，胰蛋白胨10g，琼脂粉20g，双蒸水定容至1L，pH7.0。

需要说明的是，上述分离方法（4）中，所述LB平板为含有琼脂的固体培养基的培养皿。

2、菌株鉴定

（1）微生物学特性：在LB固体培养基上单菌落为圆形，菌落中间凹陷，米白色，不透明；革兰氏染色阳性，芽孢染色中芽孢呈绿色，菌体呈红色。

（2）分子生物学特性：16srDNA测序结果如下， TGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTCTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCG，其中NCBI登录号MH482939；将菌株CT04的16srDNA扩增序列在NCBI数据库中比对,与Bacillus siamensis同源性为 99.84%；根据菌株CT04的16srDNA序列构建的系统发育树如图1所示，并命名为芽孢杆菌CT04（Bacillus siamensis）。

3、菌株保藏

本发明提供的菌株CT04是从四川省广元市朝天区曾家山核桃种植区土壤中分离得到，已于2018年6月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所），保藏号为CGMCCNo.15943。

实施例 2

芽孢杆菌菌株CT04对核桃落果病室内效果验证

1.实验方法

采用平板对峙法，用无菌打孔器将供试的核桃落果病病原菌（核桃炭疽病病原菌和核桃褐斑病病原菌）分别打孔，再转接到PDA固体培养基上，将病原菌菌饼放在平板中央，四周2cm处接种芽孢杆菌Bacillus siamensis CT04菌株,置28℃生化培养箱培养,每个处理重复3 次，并以空白LB为对照；待对照菌丝长满平板时, 用十字交叉法测量菌落直径、抑菌帯直径,计算平均值和抑菌率。

抑菌率(%)=(对照菌落直径－处理菌落直径)／对照菌落直径×100。

2、实验结果

表 1 Bacillus siamensis菌株对核桃炭疽病和褐斑病病原菌室内抑菌活性测定

供试菌株	菌落直径/mm	抑菌率/%
			链格孢菌（<i>Alternaria alternata</i>）	15.47	83.43
炭疽菌（<i>Colletotrichum gloeosporioides</i> Penz.）	16.64	85.26

由表1可以看出，菌株CT04对核桃炭疽病病原菌和核桃褐斑病病原菌菌丝生长均具有较强的抑制作用, 抑菌带直径分別为15.47 mm、16.64 mm菌丝生长抑制率分別为83.43%、85.26%。

实施例3

一种防治核桃落果病的芽孢杆菌菌剂的制备方法，包括如下步骤，步骤a，将芽孢杆菌菌株在LB固体培养基进行培养，LB固体培养基进行培养中各组分质量分别为，NaCL6～8g，酵母浸膏4～6g，胰蛋白胨8～12g，琼脂粉16～24g，双蒸水定容至1L，pH值为7.0，并划线培养，培养温度30℃，培养时间为24h；步骤b，挑取单菌落接种于LB液体培养基中进行培养，LB液体培养基中各组分质量分别为，NaCL6～8g，酵母浸膏4～6g，胰蛋白胨8～12g，双蒸水定容至1L，pH值为7.0，温度30℃，转速160r/min振荡培养，培养20h；步骤c，将由步骤b制得的培养产物于8000 r/min，离心5min后，静置5～10min，并弃上清，所得沉淀为芽孢杆菌菌体；步骤d，将由步骤c所制得的芽孢杆菌菌体用双蒸水稀释到10⁸～10⁹cfu/mL，即制得防治核桃落果病的芽孢杆菌菌剂。

进一步的，在步骤a中，所述LB固体培养基中各组分质量分别为NaCL7g，酵母浸膏5g，胰蛋白胨10g，琼脂粉20g；在步骤b中，LB液体培养基中各组分质量分别为NaCL7g，酵母浸膏5g，胰蛋白胨10g，并制得防治核桃落果病的芽孢杆菌菌剂。

在上述防治核桃落果病的芽孢杆菌菌剂中，活性成分包括：芽孢杆菌的发酵培养物、芽孢杆菌、芽孢、发酵上清液。

实施例5

CT04菌剂对核桃落果病田间防治效果验证

1、实验材料

（1）供试菌株，本实验室分离自广元朝天区曾家山核桃田间土壤，标记为BS菌株。

（2）对照药剂，50% 多菌灵WP、70%代森锰锌WP 。

（3）防治对象，由真菌引起的核桃落果病。

（4）试验作物，8年生核桃，品种为辽核，株距为4 m X 4 m，树势中等，病害发生较严重。

（5）试验地，试验地在四川省中江县双龙镇凉水井村核桃种植基地。

2、实验设计

（1）试验药剂：供试菌株BS喷雾处理剂量为10⁹ cfu/mL；对照药剂50% 多菌灵WP、70%代森锰锌WP的喷雾处理剂量分别为600 mg/L;另设空白对照。

（2）小区安排：试验菌剂、对照药剂和空白对照处理采用随机抽取，每个供试菌或药剂分别喷施核桃树3株，3次重复。

（3）施药方式：按照设计剂量，对果树进行喷雾处理，每隔10天施药1次，共施药8次。

（4）调查方法：调查施药果树的发病率、病情指数，并用邓肯氏新复极差检验法(DMRT法)对试验结果进行差异显著性分析；核桃果实采收前5d调查，每个处理随机调查400个果实，计算病果率和防治率。

（5）计算方法：病情指数=∑（各级发病数×级数）/(调查总数×最高级数) ×100；发病率（%）=∑各级发病数/调查总数×100；防治率（%）=(对照病情指数一处理病情指数)／对照病情指数×100。

表2 病果分级方法

级别	病害发生程度	代表值
			Ⅰ	无病斑	0
II	病斑面积占整组织的1/4以下	1
			III	病斑面积占整组织的>1/4～1/2	2
IV	病斑面积占整组织的>1/2～3/4	3
			V	病斑面积占整组织的3/4以上	4

3、实验结果

（1）供试药剂对核桃落果病的防治效果：采用Duncan’s进行差异显著性比较，相同小写字母表示不同处理间差异不显著（P>0.05）。

表2 几种药剂对核桃落果病的田间防治结果

处理	发病率（%）	防治率（%）	差异显著性
				菌株10<sup>9</sup> cfu/mL	13.48	73.45	a
多菌灵WP 600倍	14.27	71.41	a
				代森锰锌WP600倍	12.64	76.78	a

实验结果表明，菌株CT04和多菌灵、代森锰锌对核桃落果病防治率无明显差异，用于作为应用的微生物菌剂。

通过将该微生物菌剂用作生物农药，用于防治核桃落果病。

在本说明书中所谈到的“一个实施例”、“另一个实施例”、“实施例”等，指的是结合该实施例描述的具体特征、结构或者特点包括在本申请概括性描述的至少一个实施例中。在说明书中多个地方出现同种表述不是一定指的是同一个实施例。进一步来说，结合任一实施例描述一个具体特征、结构或者特点时，所要主张的是结合其他实施例来实现这种特征、结构或者特点也落在本发明的范围内。

尽管这里参照本发明的多个解释性实施例对本发明进行了描述，但是，应该理解，本领域技术人员可以设计出很多其他的修改和实施方式，这些修改和实施方式将落在本申请公开的原则范围和精神之内。更具体地说，在本申请公开、附图和权利要求的范围内，可以对主题组合布局的组成部件和/或布局进行多种变型和改进。除了对组成部件和/或布局进行的变型和改进外，对于本领域技术人员来说，其他的用途也将是明显的。

Claims

1.一株防治核桃落果病的芽孢杆菌，其特征在于：所述芽孢杆菌为暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）菌株CT04，于2018年6月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.15943。

2.一种防治核桃落果病的芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤，步骤a，将权利要求1的芽孢杆菌菌株在LB固体培养基进行培养，LB固体培养基进行培养中各组分质量分别为，NaCl 6～8g，酵母浸膏4～6g，胰蛋白胨8～12g，琼脂粉16～24g，双蒸水定容至1L，pH值为7.0，并划线培养，培养温度30℃，培养时间为24h；步骤b，挑取单菌落接种于LB液体培养基中进行培养，LB液体培养基中各组分质量分别为，NaCl 6～8g，酵母浸膏4～6g，胰蛋白胨8～12g，双蒸水定容至1L，pH值为7.0，温度30℃，转速160r/min振荡培养，培养20h；步骤c，将由步骤b制得的培养产物于8000 r/min，离心5min后，静置5～10min，并弃上清，所得沉淀为芽孢杆菌菌体；步骤d，将由步骤c所制得的芽孢杆菌菌体用双蒸水稀释到10⁸～10⁹cfu/mL，即制得防治核桃落果病的芽孢杆菌菌剂。

3.根据权利要求2所述的防治核桃落果病的芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于：在步骤a中，所述LB固体培养基中各组分质量分别为NaCl 7g，酵母浸膏5g，胰蛋白胨10g，琼脂粉20g。

4.根据权利要求2所述的防治核桃落果病的芽孢杆菌菌剂的制备方法，其特征在于：在步骤b中，LB液体培养基中各组分质量分别为NaCl 7g，酵母浸膏5g，胰蛋白胨10g。

5.一种生物农药，其特征在于：所述生物农药包括权利要求2至4任意一项制备的防治核桃落果病的芽孢杆菌菌剂。

6.一种防治核桃落果病的方法，其特征在于：包括向具有落果病的核桃施用权利要求2至4任意一项制备的暹罗芽孢杆菌（Bacillus siamensis）菌株CT04的菌剂。