CN115806880A - 一种白僵菌及其分离和筛选方法和在防治枳壳虫害上的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种白僵菌XGA1016及其分离和筛选和应用，涉及农业生物技术领域，保藏编号为CGMCC No.40077，其分离和筛选方法包括：选择江西本地虫害较为严重的自然林地，采集被白僵菌感染致死的僵虫，进行分离与鉴定，挑取生长迅速、粗壮有力、浓密整齐且产孢量大于1200亿个孢子/g、孢子萌发率在95％以上的菌丝，获得优良菌菌株XGA1016；白僵菌XGA1016的菌粉的制备方法包括斜面菌种培养、二级液体扩大培养、三级固体扩大培养和干燥、粉碎。本发明的有益效果通过分离和筛选获得了高毒力、适应性强的江西本土自然生长的优良白僵菌菌株XGA1016，有利于提高白僵菌野外适应能力和长效杀虫效果，有助于枳壳虫害的防治效果。

Description

一种白僵菌及其分离和筛选方法和在防治枳壳虫害上的应用

技术领域

本发明涉及农业生物技术领域，尤其涉及一种白僵菌XGA1016及其分离和筛选和应用。

背景技术

传统的枳壳虫害防治主要依靠喷洒化学农药，易造成枳壳品质受损。农药残留物严重威胁消费者的健康和生命安全。长期大量施用化学农药势必破坏种植地的生态环境。

随着社会经济的持续发展和人民生活水平的不断提高，生物防治在病虫害综合防治中的作用日益受到重视，已成为国家有机食品生产领域研究的热点。利用生物农药白僵菌作为防治虫害的重要手段，因其具有高效、无毒、虫害不易产生抗性等优点，符合现代社会对中药材种植质量的要求。白僵菌(Beauveria bassiana)作为一种微生物广谱杀虫剂，易培养、无环境污染，对害虫具有持续感染力，最终导致害虫因代谢紊乱而僵死。

球孢白僵菌(Beauveria bassiana)作为虫生真菌之一，寄生范围广泛。据统计，球孢白僵菌可寄生鳞翅目、鞘翅目、同翅目、膜翅目等700多种昆虫及蜱螨类，具有良好的生防潜力，已被广泛用于防治多种农林害虫。全球以球孢白僵菌为有效成分的制剂占全部真菌杀虫剂的33.9％，我国已登记的11种真菌杀虫剂中就有6种为球孢白僵菌产品。国内外从事相关研究的主要机构不超过5家。

白僵菌属于气传昆虫病原菌，具有广域流行的特点，极易在潮湿的环境中侵染昆虫。但白僵菌又属于中温型的虫生真菌，温度过高过低均会威胁到它在自然环境的存活。为克服这一问题，改造白僵菌的施用剂型，改善白僵菌孢子的微生境成为研究重点，球孢白僵菌分生孢子制剂常用的助剂有载体、润湿分散剂、紫外保护剂、悬浮稳定剂等。

目前已研制出白僵菌的主要剂型包括粉剂、乳剂、油剂和混合粉剂等。李增智等(2013)在前人的基础上筛选出能有效延长白僵菌孢子活性的载体，同时赵军等(2009)研制出了能够有效保护白僵菌孢子免受紫外线损伤的微胶囊剂。而无纺布菌剂作为一种新型白僵菌制剂，能够有效改善白僵菌孢子的微生境，一旦环境适宜，还能够促进白僵菌继续生长和产孢。为克服白僵菌制剂杀虫速度慢的缺点，将白僵菌制剂Bover和敌杀死混配，用以防治马铃薯甲虫，其防效达到了80％。曹伟平等(2016)通过对球孢白僵菌与11种新型化学杀菌剂相容性的研究发现，对小菜蛾有一定的杀虫活性的吡唑醚菌酯，与白僵菌同时使用，可达到病虫害同时防治的目的。除白僵菌的不同剂型会对杀虫效果产生影响，不同的施药时间与方法也会影响白僵菌菌剂对虫害的防治效果。巴永芳等(2016)在对运用白僵菌防治玉米螟的试验中发现，在玉米螟卵孵化盛期或低龄期应用白僵菌乳剂进行喷洒能够收到良好的杀虫效果。崔雨虹等(2017)通过对玉米不同施用方式的研究发现，对玉米苗叶面喷施白僵菌乳剂，用1×10⁶孢子/mL的白僵菌孢子悬浮液处理土壤最为经济、高效，能促进根部生长。有研究认为，白僵菌孢子浓度、施药方式以及施药土壤深度均会影响白僵菌对蓝莓蛴螬的毒杀效果。

另外，传统白僵菌药剂杀虫周期长，防效慢，一般是1～2周，有时长达1～2个月，远高于化学农药。多数生物农药专一性较强，杀虫谱较窄，防治效果远低于常规化学农药，菌种资源主要来源于自然资源直接筛选的菌株，在转接培养过程中，菌株退化、毒力降低、防效不稳定，因此发现新的自然菌种，使用新的选育技术，选育出优良生产菌株，才能保持较长的稳定性。

发明内容

本发明的目的在于至少解决现有技术中存在的技术问题之一，提供一种白僵菌XGA1016及其分离和筛选和应用。

本发明的技术解决方案如下：

本发明第一方面提供一种白僵菌XGA1016，保藏编号为CGMCC No.40077。本发明第二方面提供的白僵菌XGA1016的分离和筛选方法，包括以下步骤：

1)分离：选择虫害较为严重的自然林地，采集被白僵菌感染致死的僵虫，进行分离与鉴定，分离方法采用组织分离法，然后挑取单菌落进行划线，25℃平板恒温培养5d。

2)优良菌菌株筛选：

将分离鉴定后的菌株接种于PDA固体培养基上，每组重复3次/株，25℃恒温培养，培养13d后，采用十字交叉法测量菌落直径，挑选生长迅速、粗壮有力、浓密整齐的菌丝；

将挑选的生长迅速、粗壮有力、浓密整齐的菌丝在PDA培养基上25℃恒温培养13d，在菌落中央到边缘中点处，用打孔器取出0.25cm²的菌落，放入0.05％吐温-80无菌水中，将孢子均匀分散，制成孢子悬浮液，显微测定孢子数量；

将1×10⁷个/mL的孢子悬浮液接种于10mLPDA液体培养基中，25℃振荡培养，分别于培养的第12、14、16、18、20h后镜检，测定其孢子萌发率；

挑取生长迅速、粗壮有力、浓密整齐且产孢量大于1200亿个孢子/g、孢子萌发率在95％以上的菌丝，获得优良菌菌株XGA1016。

本发明第三方面提供一种白僵菌XGA1016的菌粉的制备方法，包括以下步骤：

S1、斜面菌种培养：将白僵菌XGA1016放入斜面培养基接种，接种后的斜面培养基放入22-26℃恒温箱内培养，第1-2天着重检查有无细菌生长，如见斜面上有粘稠具光泽的薄膜出现即为细菌污染，应去掉，继续观察有无细菌生长，如有则重复上述操作至第15天，如无其他杂菌，则第一批斜面菌种制备完成；其中，斜面培养基的组成成分及重量百分数计为：马铃薯20％、白砂糖1％、琼脂1％、水78％；

S2、二级液体扩大培养：配制二级液体扩大培养基，将配好的二级液体培养基装入容量为1000L的三角瓶内，装量为三角瓶容量的2/5-1/3，塞好瓶塞，高压灭菌，在无菌条件下每瓶接种一支试管步骤S1制得的斜面菌种，接种后的二级液体扩大培养基置于往复式摇床上震荡10-14h，温度控制在22-26℃，频率80-100次/min，用电子显微镜检测孢子发芽率在85％以上即可做为二级液体菌种；其中，二级液体扩大培养基的组成成分及重量百分比数计分别为：黄豆粉1％、玉米粉1％、白砂糖1％、尿素0.02％、蛋白胨0.02％、磷酸二氢钾0.02％、水96.94％；

S3、三级固体扩大培养：将三级固体扩大培养基装入布袋或纤维袋，扎紧袋口置于灭菌锅炉中消毒，灭菌后的三级固体扩大培养基按20-25％的接种量加入步骤S2制得的二级液体菌种，培养室及用具彻底消毒后，将接种后的三级固体扩大培养基平铺在簸箕内，厚度为0.6-1寸，进行浅盘发酵，第1-5天内温度控制在22-24℃，当温度达到26-28℃时，打开窗门或用风扇进行降温至20-25℃，共计浅盘发酵15天，制得白僵菌；其中，三级固体培养基的组成成分及重量百分数计分别为：麦麸60％、谷壳40％；

S4、干燥、粉碎：将步骤S3制得的白僵菌经烘干和粉碎，得到白僵菌粉。

优选地，步骤S1中，所述斜面培养基中的马铃薯的制备方法为：将马铃薯去皮，切片煮30min过滤得到。

优选地，步骤S2中，所述二级液体扩大培养基的黄豆粉和玉米粉的粒度均为300-500目。

优选地，步骤S3中，所述培养室及用具彻底消毒的步骤包括：将用具在接种前洗净晾干放入培养室，然后将培养室用硫磺或40wt％的甲醛熏蒸。

优选地，步骤S4中，烘干温度30℃，烘干时间3天，白僵菌粉的细度在40目筛以上。

本发明第四方面提供一种生物杀菌剂，所述杀菌剂含有上述的白僵菌XGA1016。

优选地，所述杀菌剂为白僵菌水剂或白僵菌油剂或白僵菌乳剂。

本发明第五方面提供上述的白僵菌XGA1016。在防治枳壳虫害中的应用。

本发明至少具有以下有益效果之一：

1、本发明通过江西本地虫害较为严重的自然林地采集被白僵菌感染致死的僵虫，然后带回实验室，进行分离与鉴定，从而筛选获得了高毒力、适应性强的江西本土自然生长的优良白僵菌菌株XGA1016，有利于提高白僵菌野外适应能力和长效杀虫效果，有助于枳壳虫害的防治效果。

2、通过将优良白僵菌菌株XGA1016，进行放大培养、干燥和粉碎，制得白僵菌菌粉，该白僵菌菌粉对枳壳红蜘蛛具有较好的防治效果，有利于提高白僵菌野外适应能力和长效杀虫效果，有助于枳壳虫害的防治效果。

3、和传统化学农药相比，利用本发明中的生物农药优良白僵菌菌株XGA1016和白僵菌菌粉白僵菌作为防治枳壳红蜘蛛虫害的手段，具有高效、无毒、虫害不易产生抗性等优点，符合现代社会对中药材种植质量的要求，且白僵菌易培养、无环境污染，对害虫具有持续感染力，最终导致害虫因代谢紊乱而僵死。

附图说明

图1是基于ITS序列构建的菌株与其他球孢白僵菌的系统发育树。

具体实施方式

下面用具体实施例对本发明做进一步详细说明，但本发明不仅局限于以下具体实施例。

实施例1白僵菌菌株的分离、鉴定、筛选与毒力实验

1)分离与鉴定

选择江西本地虫害较为严重的自然林地(江西省信丰县枳壳种植地区)，采集被白僵菌感染致死的僵虫。带回实验室，进行分离与鉴定。分离方法采用组织分离法，然后挑取单菌落进行划线，在PDA固体培养基平板表面进行25℃恒温培养5d。

挑取单菌落，提取DNA基因组，PCR扩展及测序，将测序结果进行Blast比对。然后筛选与目的菌株具有较高同源性的序列，使用MEGA 7.0软件，通过邻接法，运行1000次bootstrap验证并构建系统发育树，如图1所示。

2)优良菌菌株筛选

比较菌落的生长速度：将分离鉴定后的菌株接种于PDA固体培养基上，每组重复3次/株。25℃恒温培养，培养13d后，采用十字交叉法测量菌落直径。相同条件下，生长迅速、粗壮有力、浓密整齐的菌丝一般为优良品种。

产孢量的测定：将分离鉴定后的菌株在PDA培养基上25℃恒温培养13d，在菌落中央到边缘中点处，用打孔器取出0.25cm²的菌落，放入0.05wt％吐温-80无菌水中。利用搅拌仪将孢子均匀分散，制成孢悬液。显微测定孢子数量，每组重复3次/株。

孢子萌发率的测定：将1×10⁷个/mL的孢子悬浮液接种于10mLPDA液体培养基中，25℃振荡培养，分别于培养的第12、14、16、18、20h后镜检，测定其孢子萌发率，每组重复3次/株。

挑取生长迅速、粗壮有力、浓密整齐且产孢量大于1200亿个孢子/g、孢子萌发率在95％以上的菌丝，获得优良菌菌株，命名为白僵菌XGA1016菌株。

将白僵菌XGA1016菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为球孢白僵菌Beauveria bassiana，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC NO.40077，保藏日期为2022年6月29日。

3)室内毒力实验

将经筛选后的白僵菌菌株在PDA培养基上25℃恒温培养14d后，用0.05％的吐温-80无菌水冲洗孢子，将孢子液稀释至浓度分别为1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸个/mL。将120头红蜘蛛侵入菌悬液2s，以浸泡于0.05wt％的吐温-80无菌水作为对照，重复4次。置于25℃恒温恒湿(RH 90％)培养箱中饲养，并隔天更换新鲜叶。逐日统计存活虫数、死虫数、校正死亡率和僵虫数及卵孵化情况。其中，校正死亡率计算方法为：

测定结果如表1所示。

表1白僵菌在3种浓度下对红蜘蛛的毒力

由表1可以看出，本实施例筛选得到的白僵菌菌株对红蜘蛛的校正死亡率在88％以上，僵虫率在85％以上，由此说明本实施例筛选得到的白僵菌菌株对红蜘蛛具有较好的防治效果。

实施例2白僵菌粉的制备及田间试验

1)白僵菌菌粉的制备

白僵菌菌粉的生产应用了常规的工业化生产方法，选择了斜面培养基、二级液体扩大培养基以及三级固体扩大培养基。其中斜面培养基的组成成分及重量百分数计分别为：马铃薯20％、白砂糖1％、琼脂1％、水78％；二级液体扩大培养基的组成成分及重量百分比数计分别为：黄豆粉1％、玉米粉1％、白砂糖1％、尿素0.02％、蛋白胨0.02％、磷酸二氢钾0.02％、水96.94％；三级固体培养基的组成成分及重量百分数计分别为：麦麸60％、谷壳40％，所述黄豆粉和玉米粉的粒度为300-500目。马铃薯的制备方法为先将马铃薯去皮，在切片煮30min过滤得到。具体操作步骤如下：

S1、斜面菌种培养：取马铃薯、白砂糖、琼脂、水按比例混合制得斜面培养基，将实施例1筛选得到的白僵菌XGA1016菌株放入斜面培养基接种，接种后的斜面培养基放入22℃恒温箱内培养，第1-2天着重检查有无细菌生长，如见斜面上有粘稠具光泽的薄膜出现即为细菌污染，应去掉，继续观察有无细菌生长，如有则重复上述操作至第15天，如无其他杂菌，则第一批斜面菌种制备完成。

S2、二级液体扩大培养：取黄豆粉、玉米粉、白砂糖、尿素、蛋白胨、磷酸二氢钾、水按比例混合制得二级液体扩大培养基，将配好的二级液体培养基装入容量为1000L的三角瓶内，装量为三角瓶容量的1/3，塞好瓶塞，高压灭菌，在无菌条件下每瓶接种一支试管步骤1制得的斜面菌种，接2瓶，接种后的二级液体扩大培养基置于往复式摇床上震荡10h，温度控制在22℃，频率80次/min，用电子显微镜检测孢子发芽率在85％以上即为二级液体菌种。

S3、三级固体扩大培养：取麦麸、谷壳按比例进行混合均匀制得三级固体扩大培养基，将5kg三级固体扩大培养基装入布袋或纤维袋，扎紧袋口置于灭菌锅炉中消毒，灭菌后的三级固体扩大培养基按20％的接种量加入步骤2制得的二级液体菌种，培养室及用具彻底消毒后，将接种后的三级固体扩大培养基平铺在簸箕内，厚度为0.6寸，进行浅盘发酵制得白僵菌；所述培养室及用具彻底消毒的步骤为：将用具在接种前洗净晾干放入培养室，然后将培养室用硫磺或40wt％的甲醛熏蒸；所述浅盘发酵的具体步骤为：第1-5天内温度控制在22℃，当温度达到26℃时，打开窗门或用风扇进行降温至20℃，共计浅盘发酵15天.

S4、干燥、粉碎：将步骤3制得的白僵菌经烘干、粉碎由输送带输入储存罐中，再进行包装，贮存；所述烘干操作在烘干房中进行，烘干房采用煤炉、电炉、暖气片加温，烘干温度30℃，烘干时间3天；粉碎收集时，白僵菌粉的细度在40目筛以上，待储存罐收有的菌粉含孢量为100亿/g时，将菌粉分袋包装，此时菌粉的活孢子率在85％以上。

2)田间试验

白僵菌粉采用上述方法制得，其中高孢粉含孢量为1200亿个孢子/g，孢子萌发率在95％以上。

供试剂型：

白僵菌水剂：向白僵菌粉再分离纯化得到的白僵菌纯孢子粉，加清水和0.1wt％洗衣粉稀释成试验要求浓度的水剂待用；

白僵菌乳剂：市购的稀释剂“82乳油”与水按1:8的比例均匀混合，加入白僵菌粉备用；

白僵菌油剂：白僵菌孢子粉加0号柴油混合而成；

以上3种剂型都分别配制成0.5万亿个/亩、1万亿个/亩、1.5万亿/个/亩、2万亿个/亩四个梯级浓度。

试验方法：

于2019年3月-2019年10月选择新干和樟树两地枳壳红蜘蛛害虫危害较严重的种植地作为试验地。施菌量按0.5万亿个/亩、1万亿个/亩、1.5万亿/个/亩、2万亿个/亩孢子四种处理。每个试验区和对照区面积均为100m²，小区间设20m宽的隔离带，重复3次，以施氧化乐果为对照。每个处理区内按对角线法选取样株10株，防治前统计样株的虫口数，施菌后检查虫口变化情况，并统计叶片受害情况，具体调查结果如表2所示。

表2白僵菌不同剂型防治枳壳红蜘蛛效果

由表2可以看出，白僵菌乳剂、白僵菌水剂和白僵菌油剂对枳壳红蜘蛛的校正死亡率在79.0～96.1％之间，具体而言，白僵菌乳剂、白僵菌水剂和白僵菌油剂的浓度为1.5万亿个/亩或2万亿个/亩时，对枳壳红蜘蛛的杀灭效果最好，与氧乐果乳油1000倍液的杀虫效果相当，由此说明，实施例2制得的白僵菌粉对红蜘蛛具有较好的防治效果。

4、研究生产不同剂型的白僵菌生物农药

1)材料：选用来源广泛且成本低廉的天然基质如次米、麦麸、谷壳，白僵菌XGA1016菌株。

2)配制种子液SDY培养基：将2.5g蛋白胨，10g葡萄糖，2.5g酵母和250mL蒸馏水，加热溶解。灭菌：稍微冷却后倒入锥形瓶，放入灭菌锅，压力103.4KPa，灭菌50min。接菌：待灭菌后冷却至室温，无菌接种，轻微晃动锥形瓶使孢子散开。培养：接种后培养基放入震荡培养箱，恒温培养，温度25℃，转速120转/min，培养4d，观察菌球生长情况。

3)优化工厂化生产条件：利用Design-Expert软件(参考李茂业，2012年)设计多因素配方。运用浅层培养法，将灭菌后的固体培养基装入浅盘(420×370×45mm)。浅盘表面覆盖半透膜性玻璃纸，灭菌后用注射器向袋内玻璃纸上注射液体菌种。25℃恒温培养，观察孢子生长情况。

4)将其制备成如上述的白僵菌水剂、油剂和乳剂不同剂型农药，但也不局限于此。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种白僵菌XGA1016，其特征在于，保藏编号为CGMCC No.40077。

2.权利要求1所述的白僵菌XGA1016的分离和筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)分离：选择虫害较为严重的自然林地，采集被白僵菌感染致死的僵虫，进行分离与鉴定，分离方法采用组织分离法，然后挑取单菌落进行划线，平板恒温培养。

2)优良菌菌株筛选：

将分离鉴定后的菌株接种于PDA固体培养基上，恒温培养，培养后，采用十字交叉法测量菌落直径，挑选生长迅速、粗壮有力、浓密整齐的菌丝；

将挑选的生长迅速、粗壮有力、浓密整齐的菌丝在PDA培养基上恒温培养，在菌落中央到边缘中点处，用打孔器取出菌落，放入吐温-80无菌水中，将孢子均匀分散，制成孢子悬浮液，显微测定孢子数量；

将孢子悬浮液接种于PDA液体培养基中，振荡培养，分别于培养的第12、14、16、18、20h后镜检，测定其孢子萌发率；

挑取生长迅速、粗壮有力、浓密整齐且产孢量大于1200亿个孢子/g、孢子萌发率在95％以上的菌丝，即获得优良菌菌株XGA1016。

3.权利要求1所述的白僵菌XGA1016的菌粉的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、斜面菌种培养：将白僵菌XGA1016放入斜面培养基接种，接种后的斜面培养基放入22-26℃恒温箱内培养，第1-2天着重检查有无细菌生长，如见斜面上有粘稠具光泽的薄膜出现即为细菌污染，将其去掉，继续观察有无细菌生长，如有则重复上述操作至第15天，如无其他杂菌，则第一批斜面菌种制备完成；其中，斜面培养基的组成成分及重量百分数计为：马铃薯20％、白砂糖1％、琼脂1％、水78％；

S2、二级液体扩大培养：配制二级液体扩大培养基，将配好的二级液体培养基装入容量为1000L的三角瓶内，装量为三角瓶容量的1/5-1/3，塞好瓶塞，高压灭菌，在无菌条件下每瓶接种一支试管步骤S1制得的斜面菌种，接种后的二级液体扩大培养基置于往复式摇床上震荡10-14h，温度控制在22-26℃，频率80-100次/min，用电子显微镜检测孢子发芽率在85％以上即为二级液体菌种；其中，二级液体扩大培养基的组成成分及重量百分比数计分别为：黄豆粉1％、玉米粉1％、白砂糖1％、尿素0.02％、蛋白胨0.02％、磷酸二氢钾0.02％、水96.94％；

S3、三级固体扩大培养：将三级固体扩大培养基装入布袋或纤维袋，扎紧袋口置于灭菌锅炉中消毒，灭菌后的三级固体扩大培养基按20-25％的接种量加入步骤S2制得的二级液体菌种，培养室及用具彻底消毒后，将接种后的三级固体扩大培养基平铺在簸箕内，厚度为0.6-1寸，进行浅盘发酵，第1-5天内温度控制在22-24℃，当温度达到26-28℃时，进行降温至20-25℃，共计浅盘发酵15天，制得白僵菌；其中，三级固体培养基的组成成分及重量百分数计分别为：麦麸60％、谷壳40％；

S4、干燥、粉碎：将步骤S3制得的白僵菌经烘干和粉碎，得到白僵菌粉。

4.根据权利要求3所述的白僵菌XGA1016的菌粉的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述斜面培养基中的马铃薯的制备方法为：将马铃薯去皮，切片煮30min过滤得到。

5.根据权利要求3所述的白僵菌XGA1016的菌粉的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述二级液体扩大培养基的黄豆粉和玉米粉的粒度均为300-500目。

6.根据权利要求3所述的白僵菌XGA1016的菌粉的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述培养室及用具彻底消毒的步骤包括：将用具在接种前洗净晾干放入培养室，然后将培养室用硫磺或40％的甲醛熏蒸。

7.根据权利要求3所述的白僵菌XGA1016的菌粉的制备方法，其特征在于，步骤S4中，烘干温度30℃，烘干时间3天，白僵菌粉的细度在40目筛以上。

8.一种生物杀菌剂，其特征在于，所述杀菌剂含有权利要求1所述的白僵菌XGA1016。

9.根据权利要求8所述的一种生物杀菌剂，其特征在于，所述杀菌剂为白僵菌水剂或白僵菌油剂或白僵菌乳剂。

10.权利要求1所述的白僵菌XGA1016或权利要求8或9所述的生物杀菌剂在防治枳壳虫害中的应用。

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