CN101654658B - 一种杀虫绿僵菌菌株 - Google Patents

Abstract

本发明是一种杀虫绿僵菌菌株，属于绿僵菌属，种名为金龟子绿僵菌大孢变种Metarhizium anisopliae CQMa117，保藏号CGMCC NO.2291。在优化的液固两相培养条件下与同类菌株相比具有抗污染力强、生长势旺、杀虫毒力高、对土天牛、蛴螬等地下害虫具有侵染力、对非靶标生物无害等优良特性。

Description

一种杀虫绿僵菌菌株

技术领域

本发明涉及一种对天牛幼虫具有高毒力的杀虫绿僵菌菌株，属于生物农药领域。

背景技术

真菌是植物害虫，病菌和害草的主要天敌，在植物病虫草害防治中起着重要作用。对真菌类生物农药的研发国际上已有许多成功的事例。在虫生真菌制剂方面，仅绿僵菌和白僵菌制剂国际上已经登记的产品有20多个，如澳大利亚Biogreen(2003)注册登记的“Green Guard”，用于防治草地蝗虫；美国(2003)公布完成防治蛴螬，蓟马，蜱等的绿僵菌F52颗粒剂等三种制剂以及孢子母药(1999)登记注册；重庆重大生物技术发展有限公司(2004，2008)完成杀蝗绿僵菌母药与油悬浮剂的农药正式登记注册，用于防治东亚飞蝗和草原蝗虫。

国内对真菌生防制剂的研究始于50年代，其中一些已具有了相当的规模，如白僵菌防治松毛虫在我国每年应用面积达几千万亩，我国研制的液固两相真菌孢子生产技术已经得到国内外同行的认可。国内已形成一批真菌杀虫剂研制单位和龙头企业，掌握了真菌生物制剂研发和规模化生产方面成熟技术，可以胜任各种类型的真菌农药的研制与生产，为我国农林害虫的绿色防控提供优质产品和应用技术。

天牛属鞘翅目天牛科昆虫，其生命周期较长，1至3年才能完成1世代；生活史隐蔽，自然控制作用较弱；寄主范围很广，危害多种农作物或林木花卉，造成重大经济损失。如我国南方地区的蔗根土天牛，对甘蔗的危害日趋严重，受害甘蔗一般减产12％-20％，重则达到50％以上，严重影响我国甘蔗生产及制糖业的发展。蔗根土天牛还可危害柑桔木薯，可造成整株死亡。双条杉天牛、星天牛、桑天牛等幼虫则钻蛀树干，引起树势衰弱，枝条折断，危害森林及经济林木。由于天牛幼虫蛀食树干活动隐蔽的特点或在地下根围活动的习性，天牛幼虫的防治难度非常大，至今未找到有效的防治方法。传统的化学防治方法是有一定的效果，但其长期大量使用既严重污染环境，危害人体健康，还大量杀伤害虫天敌，破坏生态环境。因此天牛防治需要安全有效，不杀伤非目标生物的生物农药。

发明内容

本发明通过自然感染的僵虫直接分离和土壤诱集法分离筛选的方法，获得了一种抗逆性强的高效杀虫绿僵菌菌株，利用该菌株生产的杀虫真菌制剂，能够大幅度提高对天牛类害虫的防治效果。

本发明所述的绿僵菌菌株已在北京中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏日期是2007年12月14日，保藏号是CGMCC NO.2291；具体内容是：金龟子绿僵菌大孢变种CQMa117 Metarhiziumanisopliae var.majus.CQMa117，CGMCC NO.2291。

本发明技术方案是经过采集自然感病天牛僵虫(或用天牛在寄主根围土壤诱集感染天牛形成僵虫)→分离纯化菌株→毒力测定获得高毒力菌株→鉴定菌株的分类地位→确定菌株的培养条件和培养特性→固体发酵配方优化→菌株发酵，干孢子粉收集纯化获得。

本发明通过采集自然感染僵虫和寄主根围土壤诱集法分离并筛选出一株对蔗根土天牛幼虫具有高毒力的金龟子绿僵菌大孢变种(Metarhiziumanisopliae var.majus)菌株CQMa117。室内多批生物活性的测定结果表明该菌株对鳞翅目的菜青虫、鞘翅目的蔗根土天牛、双条杉天牛、桔褐天牛等天牛幼虫都有良好的侵染控制作用。该菌株具有生物活性高、生长迅速、抗杂菌污染、抗逆性强等优良特性。进一步通过优化液固两相培养基配方和菌株生长产孢条件，大大提高菌株产孢能力。

一、菌株的鉴定

1.形态鉴定将分离到的CQMa117菌株接种在1/4SDAY平板培养基上，培养观察菌落形态特征，产孢特性等。结果显示在1/4SDA培养基上培养7d菌落初期白色茸状，产孢时橄榄绿色，自菌落中心由里向外长出成丛的绿色分生孢子。分生孢子梗单生或聚集或紧密排列，帚状分枝或轮生体。后期培养物菌落呈壳状。菌株可以在1/4SDA上28℃生长一周，直径达3.5cm；25～28℃菌落初期白色茸状，菌落产孢后暗绿色至深绿色，分生孢子梗单生或聚集或紧密排列，帚状分支。由里向外生出中间密集，四周稀疏的丛状的暗绿色分生孢子。

菌株形态特征：在1/4SDA培养基上，菌丝具分枝分隔，粗1.4-2.1μm。瓶梗型产孢细胞，大小幅度为2.1-2.9x7.1-7.5μm；从瓶梗顶端产生向基成 熟的分生孢子链；孢子链连接点倾斜度小；分生孢子为长椭圆形，单细胞，两端钝圆，一端较膨大，尺寸在4.3～5.2um×10.9～12.6um。其孢子着生于分生孢子梗顶端，呈分生孢子链排列。分生孢子梗单生或聚集或紧密排列，帚状分支，在生长期间，有水珠分散于菌丝间。从以上特征看，菌株CQMa117应该为金龟子绿僵菌大孢变种M.anisopliae var.majus。

2.CQMa117菌株的ITS序列扩增与序列测定

将CQMa117在1/4SDAY液体培养基摇瓶培养3天(180rpm，28℃)，过滤收集菌丝体，加液氮研磨破碎，以氯化苄法提取菌株CQMa117的总DNA[10-11]。以总DNA为模板，参照Curran扩增绿僵菌ITS1-5.8S-ITS2rDNA区域。所用引物为TW81：5’-gtttccgtagctgaacctgc-3和AB28：5’atatgcttaagttcagcgggt-3’，产生552bP扩增条带。PCR反应体系(25μL)为：2.5μL 10×Taq酶缓冲液，dNTP各200μmol.L-1，MgCl2 1.5mmol.L-1，引物0.12ng，Taq酶1.5U，模板DNA 10ng～1μg。扩增反应在PCR仪上的反应程序：95℃ 3min，1个循环；94℃ 0.5min，52℃ 0.5min，72℃ 0.5min，30个循环；最后72℃ 5min。将凝胶电泳产物用凝胶回收试剂盒纯化回收，由上海生工进行双向脱氧法测序。序列与NCBI数据库中已知序列比对，经提取菌丝总DNA扩增，获得了552bp的扩增片段，符合预期长度。回收该片段以双脱氧测序法测定了CQMa117菌株的ITS序列及5.8SrRNA基因的序列如下。该序列5′端包含部分18S rRNA基因序列(1-49)，3′端包含部分28S rRNA基因序列(520-552)，其余的分别为ITS1区(50-195)5.8S rRNA基因全序列(196-342)以及ITS2区域全序列(343- 519)。

TTTTATGCTTTAATTCAGCGGGTAGTCCTACCTGATTCGAGGTCAACTATAAAAAGTTGGGGGTTTTTACGGCAGTGGACCGCGCCGGGCTCCTGTTGCG AGTGTTTTACTACTGCGCAGAGGAGGGCCACGGCGAGACCGCCAATCAATTTAAGGGACGGCTGTGCTGGAAAACCAGCCTCGCCGATCCCCAACA C C A A GTCCACAGGGGACTTGAGGGGCGTAATGACGCTCGAACAGGCATGCCCGCCAGAATACTGACGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGA

对所测得的ITS序列与GenBank中已知序列比对，结果表明，与该菌株ITS序列最为接近的为金龟子绿僵菌大孢变种，其ITS序列同源性为95％，结合CQMa117菌株的形态学特点，将该菌株鉴定为金龟子绿僵菌大孢变种(Metarhizium anisoplia var.majus)。

二、CQMa117菌株对天牛幼虫的杀虫活性

收集在1/4SDA上培养的成熟分生孢子，用色拉油分散，添加4％的与真菌活力兼容的乳化剂，配置成终浓度为1×10⁸个孢子/mL的油孢子悬浮液，接种在蔗根土天牛、双条杉天牛和桔褐天牛大龄幼虫。按点滴法每头试虫用微量点滴器点滴药剂10ul，每组接种30头，接种后在室温28℃，湿度30-50％的条件下饲养，各处理设一空白对照，对照实验由同浓度的色拉油和乳化剂代替油孢子悬液接种。每天定时观察，记录死亡虫数，经DPS2000软件统计分析得到LT50(致死中时)，LT90(致死终时)。

从表1中可以看出CQMa117菌株对蔗根土天牛、桑天牛、双条杉天牛和桔褐天牛等幼虫有明显的防治效果，6-7d为死亡的高峰期，天牛幼虫感染 真菌致死后虫体变白并出现皱纹，3d后长出白色菌丝体，6d后虫体长满灰

表1 CQMa117菌株对不同天牛幼虫的毒力

绿色孢子，成熟后变为黑褐色孢子堆。

三、CQMa117菌株在基础培养基上的生长和产孢情况

以CQMa117菌株在各个基础固体培养基上培养2周生长速率和单位面积上的产孢量为标准，采用打孔器转接固定大小的菌丝块在各个固体培养基上生长的方法，测定了CQMa117菌株在1/4SDA，PSA，察氏琼脂培养基等

表2 CQMa117菌株在基础培养基上的生长速率和产孢量

基础培养基上的生长和产孢情况。

由表2可知，察氏琼脂培养基上CQMa117菌株能够正常生长，但是在2周后其白色菌丝仍占其生长总量的1/2左右，较PSA和1/4SDA上产孢量少。而后两者相比，选用产孢量最高的1/4SDA为CQMa117菌株的菌种培养基。

四、CQMa117菌株培养特性

同样以CQMa117菌株在变化固体培养基上培养2周时的生长速率和单位面积上的产孢量为标准，以1/4SDA为基础固体培养基，通过变换其培养时的温度(15℃，22℃，25℃，28℃，30℃，37℃)，培养基的pH(4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0)，得出CQMa117菌株在25℃和pH6.0条件下生长和产孢最佳。测定CQMa117菌株的最佳培养条件。在此基础上，分别变换碳源(同量的D-山梨醇，葡萄糖，乳糖，麦芽糖，淀粉代替蔗糖)，氮源(同量的硝酸铵，尿素，L-精氨酸，L-甘氨酸代替蛋白胨)和添加0.1％(质量/体积)的微量元素(K⁺、Fe³⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺、Mg²⁺或Ca²⁺)的单因素水平，测定CQMa117培养最适合的单因子营养条件；并进行3因素3水平的正交实验，得出以可溶性淀粉10g，蛋白胨2.5g，酵母膏5g，1g的K⁺，琼脂粉18g，溶入1L蒸馏水中，调节pH至6.0的固体培养基为最佳固体培养基，可以使CQMa117菌株在生长速率基本不变的情况下，单位面积的产孢量提高40％左右。

五、CQMa117菌株固体发酵物料的优化

液体培养CQMa117菌丝体作为发酵种子，接种到不同的物料培养基中，各个物料配方为：麦麸+米粉，麦麸+面粉，麦麸+玉米粉的混合物(每个混合物的比例分别为99∶1；97∶3；95∶5的质量比)，并进行添加各种液体培养基(1/2SDA，1/4SDA，1/8SDA液体培养基，同量的无菌水)，以及分别加入K⁺，Ca²⁺，Fe³⁺的无机盐溶液(浓度分别为：0.1％，0.5％，0.01％)，并对筛选出的各个较好培养条件进行正交实验，以产孢量为检验标准，最 后确定CQMa117的固体物料发酵的优化条件是：97％的麦麸+3％的面粉为基础物料配方，添加0.05-0.1％的K⁺⁺或Fe⁺³无机盐的减量SDA为营养液。

实验数据一、CQMa117菌株的杀虫谱

将在1/4SDA平板上28℃条件下培养10天的绿僵菌CQMa117孢子收集后，放入干燥器中干燥至含水量5％，用色拉油分散CQMa117孢子，使其终浓度为1×10⁷spores/ml，分别接种大小基本一致的菜青虫、甘蔗土天牛、桑天牛、玉米螟幼虫，用细毛刷蘸取一定量的油剂孢子接种于虫体胸部，每种虫接种30头，

接种后放入20cm×20cm×10cm的饲养磁盘中添加其天然饲料正常饲养，调节室温至30℃、湿度40～50％，光暗周期16h/8h。各种虫设一用食用油代替绿僵菌孢子接种的空白对照。每天定时观察，更换各虫新鲜饲料，记录死亡虫数，经DPS2000软件统计分析得到LT50、LT90。

表3 CQMa102对不同昆虫的毒力

从表3可以看出CQMa117对菜青虫、甘蔗土天牛、桑天牛、玉米螟等几种农业害虫都具有侵染活性，具有明显的防治效果。

实验数据二、CQMa117菌株固体发酵产孢率

将大米在含有1-10％NaNO₃、0.01-0.1％F_e ³⁺、2-10％微量元素溶液、1-10％酵母粉的液体中浸泡2h后装入两头透气的聚丙烯袋中(大米第二次利用时，按大米∶营养液为2∶1的比例加入1-10％NaNO₃、0.01-0.1％F_e ³⁺、2-10％ 微量元素溶液、1-10％酵母粉的营养液，拌匀后装袋)，121℃、0.10-0.15MP_a湿热灭菌30min，自然冷却后按10-15∶1比例接入在2/4SDA液体基中培养3天的绿僵菌CQMa117菌液并拌匀，置于27±1℃的发酵室中发酵10-12天后出袋干燥(30℃-34℃)至湿度≤5％。干燥后随机抽取10袋培养料，每袋混匀后各取5g左右的样品，放入装有20mL 0.05％Tween-80的50ml三角瓶中，充分混匀后用血球计数板测定浓度。按100×10⁸个/g与大米第一次用后损失15％换算出固体发酵产孢率。设用清水处理(不加营养液)的大米为对照。

表4 CQMa117菌株固体发酵产孢率

*：菌丝生长旺盛不能进入微循环产孢；**：大米未进行第二次利用

从上表4可以看出：大米第一次利用时，CQMa117在经过处理的大米上发酵能进入微循环产孢，产孢率为2.09％左右，而在未处理的大米上菌丝生长旺盛不能进入微循环产孢，产孢率仅为0.46％，比对照提高4.5倍；

大米经第二次利用总产孢率达到3％以上，比不加营养液的产孢量提高了7.5倍，比大米利用一次的产孢率提高了60％左右。

具体实施方式

实施例1：田间采集自然感病天牛僵虫→直接分离纯化菌株→接种天牛幼虫测定杀虫毒力→获得高毒力菌株CQMa117→菌株形态、孢子形态、鉴定→提取菌株DNA，以真菌ITS序列通用引物扩增菌株DNA，将获得的扩 增序列测序并在GENEBANK中比对→确定菌株CQMA117为金龟子绿僵菌大孢变种。

设置不同温度，培养基pH，在不同条件下培养菌株CQMA117确定最佳培养条件25℃和pH6.0，加入可溶性淀粉10g，蛋白胨2.5g，酵母膏5g，1g的K⁺，琼脂粉18g，溶入1L蒸馏水中，调节pH至6.0的固体培养基为最佳固体培养基。以麦麸为主要培养物料，按97％的麦麸+3％的面粉为基础物料配方，添加0.05-0.1％的K⁺⁺或Fe⁺³无机盐的1/4SDA为营养液对菌株进行固体发酵，其一次产孢量可达3％以上。

序列表

<140>一种杀虫绿僵菌菌株

<210>1

<211>552

<212>DNA

<213>Metarhiziumanisopliae var. majus

<400>1

ttttatgctt taattcagcg ggtagtccta cctgattcga ggtcaactat aaaaagttgg60

gggtttttac ggcagtggac cgcgccgggc tcctgttgcg agtgttttac tactgcgcag120

aggagggcca cggcgagacc gccaatcaat ttaagggacg gctgtgctgg aaaaccagcc180

tcgccgatcc ccaacaccaa gtccacaggg gacttgaggg gcgtaatgac gctcgaacag240

gcatgcccgc cagaatactg acgggcgcaa tgtgcgttca aagattcgat gattcactga300

attctgcaat tcacattact tatcgcattt cgctgcgttc ttcatcgatg ccagaaccaa360

gagatccgtt gttgaaagtt ttgattcatt tttttttaac cactcagaag atacttatta420

aaaaattcag aaggtttggg tccccggcgg gcgcgaagtc ccgccgaagc aacaatgaaa480

ggtataattc acaggggttg ggagttggat aactcggtaa tgatccctcc gcaggttcac540

taaacggaaaca552

Claims (1)

1.一种杀虫绿僵菌菌株，其特征是该菌株是金龟子绿僵菌大孢变种(Metarizium anisopliae var.major)CQMa117株，其保藏号为CGMCC NO.2291。