CN107460131A - 一种专一侵染鳞翅目害虫的绿僵菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种专一侵染鳞翅目害虫的绿僵菌及其应用，所述绿僵菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2017439，保藏日期为：2017年8月9日。该绿僵菌分离自菜青虫，毒力高、杀虫谱广，可用于制备生物农药制剂，为鳞翅目害虫生物防治提供了优良的菌株，具有生防菌剂的研制和应用的广阔前景。

Description

一种专一侵染鳞翅目害虫的绿僵菌及其应用

技术领域

本发明涉及生物农药制剂领域，主要涉及一种专一侵染鳞翅目害虫的绿僵菌及其应用。

背景技术

以菜青虫、小菜蛾、夜蛾、螟蛾为代表的鳞翅目害虫是危害蔬菜的主要害虫，尤其威胁十字花科、豆科、茄瓜类、以及旋花科蔬菜的生长和品质。长期以来，人们为了防治这些害虫，连续大量地使用化学农药，频繁地更换农药种类，甚至于使用高毒、剧毒农药，直接威胁到人类健康，使害虫的抗药性越来越强，防治成本越来越高，相比化学农药，生物农药具有选择性强，对人畜安全，害虫不易产生抗性，对生态环境影响小等优点，逐渐受到了广泛关注。

发明内容

鉴于上述现有在鳞翅目害虫防控中存在的不足，本发明的目的在于提供一株专一侵染鳞翅目害虫的绿僵菌及其应用，该绿僵菌分离自菜青虫，毒力高、可用于制备生物农药制剂，为鳞翅目害虫生物防治提供了优良的菌株，具有生防菌剂的研制和应用的广阔前景。

本发明的技术方案如下：

一种专一侵染鳞翅目害虫的绿僵菌，其特征在于，能够专一高效侵染鳞翅目害虫，所述绿僵菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2017439，保藏日期为：2017年8月9日。

一种如上所述的绿僵菌的应用，其中，将所述绿僵菌用于制备生物农药制剂。

所述的绿僵菌的应用，其中，将所述绿僵菌用于防治鳞翅目害虫的生物农药制剂。

所述的绿僵菌的应用，其中，所述鳞翅目害虫为菜青虫、玉米螟或小菜蛾。

所述的绿僵菌的应用，其中，将所述绿僵菌制成绿僵菌孢悬液，浓度为1×10⁷mL^-1以上。

所述的绿僵菌的应用，其中，将所述绿僵菌制成绿僵菌孢悬液，浓度为1x 10⁹mL^-1。

有益效果：本发明提供的一种专一侵染鳞翅目害虫的绿僵菌，该绿僵菌分离自菜青虫，毒力高、杀虫谱广，同时可以避免对鳞翅目益虫家蚕的侵害，可用于制备生物农药制剂，为鳞翅目害虫生物防治提供了优良的菌株，具有生防菌剂的研制和应用的广阔前景。

附图说明

图1a为本发明实施例2中菜青虫感染绿僵菌SZMA004后的僵虫图。

图1b为本发明实施例2中玉米螟感染绿僵菌SZMA004后的僵虫图。

图1c为本发明实施例2中小菜蛾感染绿僵菌SZMA004后的僵虫图。

图2a为本发明实施例2中不同浓度的绿僵菌SZMA004对菜青虫累计死亡率的影响及变化趋势图。

图2b为本发明实施例2中不同浓度的绿僵菌SZMA004对小菜蛾累计死亡率的影响及变化趋势图。

图2c为本发明实施例2中不同浓度的绿僵菌SZMA004对玉米螟累计死亡率的影响及变化趋势图。

图2d为本发明实施例2中不同浓度的绿僵菌SZMA004对家蚕累计死亡率的影响及变化趋势图。

具体实施方式

本发明提供一种专一侵染鳞翅目害虫的绿僵菌及其应用，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

金龟子绿僵菌是一类重要的生防真菌，能通过体表穿透进入害虫体内，在害虫体内繁殖消耗寄主营养使害虫致死。据不完全统计，全世界约有200多种昆虫能被绿僵菌感染致死，金龟子绿僵菌同时具有不污染环境、无残留、对人畜无害、害虫不会产生抗药性等优点，已经越来越广泛地用于蔬菜害虫生物防治。不同的绿僵菌对特定的靶标害虫的毒力是不同的，通常选取毒力强、易于萌发、容易培养的菌株作为商品化的生物农药制剂。在生物防治中，能够筛选一株高毒力、杀虫谱广、易于大规模发酵生产的菌株是最为关键的。

金龟子绿僵菌SZMA004菌株是新分离到的来自于菜青虫的一株金龟子绿僵菌，具有毒力高、杀虫谱广的优点。经表型分析及DNA序列比对确定该菌株属于金龟子绿僵菌大孢变种Metarhizium anisopliae var.major。

本发明所提供的专一侵染鳞翅目害虫的绿僵菌就是金龟子绿僵菌大胞变种SZMA004菌株(后述简称为“绿僵菌SZMA004”)，已在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M 2017439，保藏地址为湖北省武汉市，洪山区八一路武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2017年8月9日。

本发明所提供的绿僵菌SZMA004，具有毒力高、杀虫谱广的优点，采用点滴法对该菌株对四种鳞翅目昆虫的毒力进行测评，结果表明：该绿僵菌菌株对鳞翅目昆虫有较好的选择杀虫活性。该菌株对菜青虫、玉米螟、小菜蛾有很高侵染能力与杀虫活性，而对家蚕几乎没有侵染活性,可以避免该菌株对鳞翅目益虫家蚕的毒害。1.0x 10⁸mL^-1孢悬液用点滴法分别接种菜青虫、小菜蛾、玉米螟4龄幼虫，菜青虫、小菜蛾、玉米螟的校正死亡率分别为100％、83.3％、76.7％。家蚕的累计死亡率仅为10％，低于此浓度家蚕死亡率极低，和空白对照没有显著差异。所获数据经时间-剂量-死亡率模型(time-dose-mortality modelTMD)分析，所建模型均通过Hosmer-Lemeshow拟合异质性检验。并由模型估计出了该菌株对鳞翅目昆虫的剂量效应和时间效应的指标值LD₅₀LD₉₀和LT₅₀LT₉₀。该菌株的选择杀虫特性为鳞翅目害虫生物防治提供了优良的菌株，具有生防菌剂的研制和应用的广阔前景。因此，本发明中还提供所述绿僵菌的应用，可以将所述绿僵菌用于制备生物农药制剂。尤其是用于制备防治鳞翅目害虫的生物农药制剂。

以下通过具体实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

绿僵菌SZMA004，该菌株系发明人于2015年从菜青虫尸上分离。经表型分析及分子鉴定确定该菌株属于金龟子绿僵菌大孢变种Metarhizium anisopliae var.major。绿僵菌SZMA004的孢子粉由深圳市微生物基因工程重点实验室培养。

测定时另取少量绿僵菌孢子粉涂在铺有玻璃纸的1/4SDAY培养基上，28℃培养24h后，镜检孢子萌发率。取适量的绿僵菌孢子粉到1ml无菌的0.05％Tween-80溶液中，涡旋分散。用玻璃丝绵过滤除去菌丝，滤液收集与1.5ml离心管中，12000rpm离心3min收集孢子。去上清，用1ml大豆色拉油重悬孢子，血球计数板计算孢子数目，并将孢子悬液浓度调到10⁵-10⁹个/ml。

测定结果：绿僵菌可乳性微粉剂内含有的孢子粉在玻璃纸上培养24小时后镜检孢子萌发率均达到95％以上。

实施例2

将不同浓度的绿僵菌孢子悬浮液点滴法接种于4种鳞翅目昆虫。每头家蚕接种10μL、菜青虫5μL、小菜蛾1μL、玉米螟2μL，每一浓度梯度为1个处理，没有混入SZMA004孢子的蒸馏水做空白对照，每个处理设3重复，每重复20头试虫。实验重复三次。将虫子放入盒子中饲养，加入新鲜的菜叶或桑叶，养虫室温度28℃保持湿润，相对湿度在70％以上。每天定时观察、记录各处理的死亡情况；并将死虫移出放于盛有湿吸水纸的培养皿内的载玻片上，28℃保湿培养，罹病昆虫均镜检记数，持续观察15d。

测定结果：鳞翅目昆虫感染SZMA004菌株后的僵虫，如图1a～1c所示，图1a为菜青虫，图1b为玉米螟，图1c为小菜蛾。不同浓度的绿僵菌SZMA004菌悬液对四种不同鳞翅目昆虫的累积死亡率观察值见图2a-2d所示。从测定结果可以看出，不同鳞翅目昆虫累积死亡率随着土壤中绿僵菌孢子浓度和作用时间的增加而增大。最高浓度1x 10⁹mL^-1孢悬液对菜青虫、小菜蛾、玉米螟的累计死亡率达到100％。对家蚕的累积死亡率仅为37.5％。1x 10⁸mL^-1孢悬液对菜青虫、小菜蛾、玉米螟的累计死亡率分别为100％、83.3％、76.7％，家蚕的累计死亡率不到10％。孢悬液低于此浓度(1x 10⁸mL^-1)家蚕死亡率极低，和空白对照没有显著差异，说明SZMA004菌株对家蚕没有明显侵染作用。综上，该绿僵菌菌株对鳞翅目昆虫有较好的选择杀虫活性，对菜青虫、玉米螟、小菜蛾有很高侵染能力与杀虫活性，而对家蚕相对安全。

绿僵菌孢悬液对鳞翅目昆虫幼虫致死的时间效应分析：SZMA004绿僵菌菌悬液对菜青虫、小菜蛾、玉米螟的致死中时见表1。随着浓度的增加，LT₅₀和LT₉₀递减。在绿僵菌SZMA004菌悬液浓度太低时，对某些鳞翅目昆虫死亡率均低于50％，因此计算不出LT₅₀的值。该菌株对菜青虫有很高的侵染能力，最高浓度1x 10⁹mL^-1不到一天就能使菜青虫的死亡率大于50％，所以计算不出LT₅₀。高浓度1x 10⁹mL^-1有家蚕的累积死亡率仅为37.5％。因此对于家蚕计算不出LT₅₀的值和LT₉₀的值。

表1不同浓度的绿僵菌孢悬液对鳞翅目昆虫的LT₅₀和LT₉₀

上述实施例中对绿僵菌SZMA004对四种不同鳞翅目昆虫的毒力效果以及时间、剂量、死亡率之间的关系进行了详细的研究，研究结果表明绿僵菌SZMA004对菜青虫、小菜蛾、玉米螟等蔬菜害虫有很好的防效，而对于家蚕相对来说侵染力不强，在田间施药时，能够避免对家蚕伤害，有潜力开发成为商品化生物农药的菌株。

生物测定是昆虫病理学和毒理学工作者的经常性工作。我们在生物测定分析方法中往往只是单独分析剂量或时间的效应，然而任何杀虫剂或生物活性物质的剂量效应与时间效应是彼此相关的，传统分析方法未体现这种相关关系。时间—剂量—死亡率模型则同时考虑了时间与剂量效应，充分利用了数据中包含的全部信息，避免了几率值分析中时间效应与剂量效应相互排斥的问题，显然更适评价病原微生物或杀虫剂对目标昆虫的效应，在生物测定中具有实践和理论价值。

目前绿僵菌制剂在蔬菜害虫的防治中喷洒剂量没有充分的依据，本发明的实施例方案为以后绿僵菌制剂大规模田间应用提供可理论依据。本研究的室内毒力测定显示1x10⁸mL^-1绿僵菌SZMA004孢子悬液对菜青虫、玉米螟、小菜蛾有很好的防效。对菜青虫而言1x10⁷mL^-1绿僵菌SZMA004菌悬液就能在一周内对菜青虫的死亡率控制在80％以上。但是环境条件如温度、相对湿度等直接影响绿僵菌农药防治作用的发挥。因此，田间施药应考虑到环境条件的影响，同时也要考虑害虫的发生规律，选择合适的施药时机和施药方式。

应当理解的是，本发明的应用不限于上述的举例，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (6)

1.一种专一侵染鳞翅目害虫的绿僵菌，其特征在于，所述绿僵菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2017439，保藏日期为：2017年8月9日。

2.一种如权利要求1所述的绿僵菌的应用，其特征在于，将所述绿僵菌用于制备生物农药制剂。

3.根据权利要求2所述的绿僵菌的应用，其特征在于，将所述绿僵菌用于防治鳞翅目害虫的生物农药制剂。

4.根据权利要求2所述的绿僵菌的应用，其特征在于，所述鳞翅目害虫为菜青虫、玉米螟或小菜蛾。

5.根据权利要求2所述的绿僵菌的应用，其特征在于，将所述绿僵菌制成绿僵菌孢悬液，浓度为1x10⁷mL^-1以上。

6.根据权利要求2所述的绿僵菌的应用，其特征在于，将所述绿僵菌制成绿僵菌孢悬液，浓度为1x10⁹mL^-1。