CN103749441B - 一种玫烟色棒束孢可湿性粉剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种玫烟色棒束孢可湿性粉剂及其制备方法和应用。所述玫烟色棒束孢可湿性粉剂包括如下质量百分比的组分：玫烟色棒束孢分生孢子粉5%～20%、润湿剂3%～5%、分散剂3%～5%、紫外保护剂0.1%～0.5%，余量为载体。所述玫烟色棒束孢为玫烟色棒束孢菌株SCAU-IFCF02，于2013年11月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO：M2013526。本发明所述玫烟色棒束孢可湿性粉剂主要用于防治十字花科蔬菜害虫，对小菜蛾等害虫有很好的防治效果。具有杀虫活性高、效果稳定、持效期长、环境影响小、使用方便的优点。

Description

一种玫烟色棒束孢可湿性粉剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及无公害农药制剂领域。更具体地，涉及一种玫烟色棒束孢可湿性粉剂及其制备方法和应用。

背景技术

昆虫病原真菌是杀虫微生物的重要组成部分，约占昆虫病原微生物种类的60%以上。微生物农药的大量开发利用可有效降低和消除目前化学农药普遍存在的残留、毒性和抗药性等诸多负面作用。玫烟色棒束孢（Isaria fumosorosea）是一种重要的可致害虫死亡的昆虫病原真菌，广泛分布于热带、亚热带和温带地区，寄主范围广，已记载的有25个不同科的昆虫，包括同翅目、双翅目、鳞翅目、半翅目、鞘翅目和膜翅目等多种蔬菜、果树及茶树害虫，特别是小菜蛾、麦双尾蚜和烟粉虱等一些重要农业害虫，是生物防治中极具开发应用潜力的种类。玫烟色棒束孢的致病力强，对人畜作物安全，对环境友好，不易产生抗药性，是研究和应用最广的一类微生物杀虫剂之一。

用真菌微生物农药防治植物病虫害是无公害农产品可持续生产中的重要手段之一，具有广阔的应用前景。然而真菌制剂化是其微生物农药应用的先决条件，自20世纪60年代以来，国外已有10种玫烟色棒束孢制剂产品被研究出来并获得注册登记，近几年间问世的商品制剂有分生孢子制剂Biocon（荷兰）、AgoBiocontrol Bassiana 50（哥伦比亚）、Pae-sin（墨西哥）、Bemisin（委内瑞拉），芽生孢子制剂PFR-97以及芽生孢子与菌丝体的混合制剂PreFeRal。虽然这些现有的玫烟色棒束孢制剂对害虫取得了较好的防治效果，但是，同其他生防真菌一样，这些制剂仍然存在杀虫速度较慢这一缺点，严重制约了其在田间的应用。

正因为玫烟色棒束孢的寄主范围广，流行性强，以及对人畜和环境安全等特点，长期以来被研究工作者作为防治害虫的主要手段，但是该菌在使用过程中存在侵染速度慢、防治效果受环境条件影响大、附着力不好，防治效果很不稳定等缺点。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有玫烟色棒束孢农药制剂剂型存在的问题和不足，提供了一种玫烟色棒束孢可湿性粉剂。

本发明另一目的是提供上述玫烟色棒束孢可湿性粉剂的制备方法。

本发明再一目的是提供上述玫烟色棒束孢可湿性粉剂的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现： 

本发明提供了一种玫烟色棒束孢可湿性粉剂，包括如下质量百分比的组分：玫烟色棒束孢分生孢子粉5%～20%、润湿剂3%～5%、分散剂3%～5%、紫外保护剂0.1%～0.5%，余量为载体。

优选地，所述玫烟色棒束孢可湿性粉剂，包括如下质量百分比的组分：玫烟色棒束孢分生孢子粉8%～15%、润湿剂3.5%～4.5%、分散剂3.5%～4.5%、紫外保护剂0.2%～0.4%，余量为载体。

更优选地，所述玫烟色棒束孢可湿性粉剂，包括如下质量百分比的组分：玫烟色棒束孢分生孢子粉10%、 润湿剂3%、分散剂3%、紫外保护剂0.1%，余量为载体。

本发明所述的玫烟色棒束孢为玫烟色棒束孢（Isaria fumosorosea (Wize) Brown & Smith）菌株SCAU-IFCF02，最初分离自家白蚁。该菌株于2013年11月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2013526，保藏地址为中国武汉市武汉大学。

优选地，本发明所述的玫烟色棒束孢分生孢子粉的孢子含量为124亿/g。

优选地，所述的润湿剂为辛烷基苯酚聚氧乙烯醚-10（OP-10）或脂肪醇聚氧乙烯醚（AEO-9）；

所述的分散剂为亚甲基二萘磺酸钠（分散剂NNO）；

所述的紫外保护剂为抗坏血酸或荧光素钠；

所述的载体为滑石粉或硅藻土。

更优选地，所述的润湿剂为辛烷基苯酚聚氧乙烯醚-10；

所述的分散剂为亚甲基二萘磺酸钠（分散剂NNO）；

所述的紫外保护剂为抗坏血酸；

所述的载体为滑石粉。

本发明还提供了所述玫烟色棒束孢可湿性粉剂在制备防治同翅目、双翅目、鳞翅目、半翅目、鞘翅目或膜翅目害虫药剂方面的应用。

优选地，所述害虫为十字花科蔬菜害虫。

更优选地，所述害虫为小菜蛾，红火蚁或烟粉虱。

本发明上述玫烟色棒束孢分生孢子粉的制备方法如下：

S1.一级固体培养，将玫烟色棒束孢菌株SCAU-IFCF02涂布于SDAY固体培养基培养；

S2.二级液体振荡培养，用含有0.03% Tween-80的无菌水洗下上述固体培养基上的孢子，过滤制成1×10⁷个孢子/mL的悬浮液，将悬浮液接种于萨氏培养液振荡培养；

S3.三级产孢培养。

更具体地，所述制备方法包括以下操作：

S1.一级固体培养，将玫烟色棒束孢菌株SCAU-IFCF02涂布于SDAY固体培养基（SDAY培养基为最适培养基），于24℃进行培养，最佳培养时间为15天；

S2.二级液体振荡培养，用含有0.03% Tween-80的无菌水洗下上述固体培养基上的孢子，再用灭菌纱布过滤，制成1×10⁷个孢子/mL的悬浮液，100uL的上述悬浮液接种于200mL的萨氏培养液（简称SDB，为最适接种液），24℃、170r/min振荡培养72小时；

S3.三级产孢培养，低值陈米（普通的大米，购于华南农业大学农贸市场）加等质量蒸馏水，121℃湿热灭菌30min后冷却备用，将S2得到的含有大量菌丝的菌液接入经蒸汽灭菌的大米上，菌液与低值陈米充分混合后平铺于垫有纱布的托盘中，并用保鲜膜覆盖，24℃黑暗培养6天。待培养基表面长满菌丝时揭去保鲜膜继续培养4天，使菌丝大量产孢，收获孢子粉，真空冷冻干燥24小时，干燥后的孢子粉贮存于无菌容器中，4℃保存备用。获得的孢子粉孢子含量为124亿/g，活孢率为97.8%，含水量为2.56%，外观为淡玫烟色粉末。

其中，步骤S1所述SDAY固体培养基配制方法如下：

葡萄糖40g/L、蛋白胨10g/L、酵母浸膏20g/L、琼脂15～20g/L、H₂0 1L，搅拌混匀，然后分装，灭菌，备用。

S2所述萨氏培养液配制方法如下：

葡萄糖40g/L、蛋白胨10g/L、酵母浸膏20g/L、H₂01L，搅拌混匀，然后分装，灭菌，备用。

在微生物活体农药开发研究中，其配套制剂的研究是微生物活体农药实际开发和推广应用的重要基础。助剂对农药制剂具有重要影响，其好坏直接影响到农药药效，尤其在真菌孢子制剂中对助剂具有更高的要求，除了要求优良的理化性能外，还必须不能影响真菌孢子的萌发，否则将严重影响制剂的生防效果及贮存稳定性。合适的助剂不仅可以延长真菌制剂产品货架期，也可以降低真菌制剂对外界环境的依赖，提高对靶标害虫的田间防效。因此，筛选与真菌具有优良生物学相容性的助剂对真菌制剂的研制相当重要。害虫亲脂性表皮和兑水使用的药剂之间存在着很高的界面张力，让药剂很难与害虫和植物表面亲和。不合理的制剂，不仅造成部分菌体死亡或孢子失活，而且会将大大降低其效果发挥，从而影响持效性。制备稳定、效果好的新剂型是真菌杀虫剂制备的关键。可湿性粉剂具有成本较低，市场竞争力强，应用范围广等优点，可湿性粉剂的研制是新型微生物农药产业化开发的不可或缺的环节。

本专利发明人分离得到的玫烟色棒束孢菌株SCAU-IFCF02，对小菜蛾具有非常低的致死浓度和最快的致死速度，克服了普通真菌微生物农药杀虫速度慢这一制约因素。因此，本发明以玫烟色棒束孢菌株SCAU-IFCF02的常见侵染体分生孢子为活性成分，制备成玫烟色棒束孢可湿性粉剂，能够为玫烟色棒束孢菌株SCAU-IFCF02的产业化奠定基础，为该菌株的田间应用提供理论指导，具有良好的应用前景。

    本发明具有以下有益效果：

本发明制备方法获得了一种性能稳定的真菌微生物杀虫制剂，得到的玫烟色棒束孢可湿性粉剂产品性能指标优良：玫烟色棒束孢孢子萌发率≥90%；润湿性<1min；质量悬浮率为75.28%；孢子的悬浮率为95.12%，水分含量为2.88%；细度（过325目标准筛）≥98%；pH 值为6.20；所使用的助剂与玫烟色棒束孢具有很好的生物相容性，对玫烟色棒束孢分生孢子的萌发没有影响或影响极小。

本发明玫烟色棒束孢可湿性粉剂对同翅目、双翅目、鳞翅目、半翅目、鞘翅目或膜翅目害虫，尤其是十字花科蔬菜害虫具有非常好的防治效果，克服了微生物农药速效性差、效果不稳定以及阿维菌素的抗药性、农药残留严重等缺点，具有使用方便、速效、高活性、效果稳定、持效期长，且控制能力强、环境影响小、低毒、低残留等优点，符合当前生物农药研究的趋势，是一种理想的替代高残留农药的新型生物农药，对于我国开发无公害蔬菜，维护生态环境，实现可持续农业具有重要的意义，具有很好的推广应用价值。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

以下实施例中涉及的玫烟色棒束孢具体为玫烟色棒束孢SCAU-IFCF02菌株。以下实施例中所使用的玫烟色棒束孢分生孢子粉为玫烟色棒束孢菌株SCAU-IFCF02的分生孢子粉，孢子含量124亿/克。

除特别说明以外，本发明实施例中所用百分比均为质量百分比（w/w）。

实施例1 玫烟色棒束孢分生孢子粉的制备

本发明实施例所用玫烟色棒束孢为玫烟色棒束孢菌株SCAU-IFCF02，该菌株于2013年11月1日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2013526。

本发明所述玫烟色棒束孢分生孢子粉的制备步骤如下：

S1.一级固体培养，取50uL玫烟色棒束孢菌株SCAU-IFCF02原始菌液涂布于SDAY固体培养基上（SDAY培养基为最适培养基），于24℃进行培养，最佳培养时间为15天；

S2.二级液体振荡培养，用含有0.03% Tween-80的无菌水洗下SDAY固体培养基上的孢子，再用纱布过滤，制成1×10⁷个孢子/mL的孢子悬浮液，100uL的上述孢子悬浮液接种于200mL的萨氏培养液（简称SDB，为最适接种液），24℃、170r/min振荡培养72小时；

S3.三级产孢培养，低值陈米（普通的大米，购于华南农业大学农贸市场）加等质量蒸馏水，121℃ 湿热灭菌30min后冷却备用，将S2得到的含有大量菌丝的菌液接入灭菌的大米上，菌液与低值陈米充分混合后平铺于垫有纱布的托盘中，并用保鲜膜覆盖，24℃黑暗培养6天。待培养基表面长满菌丝时揭去保鲜膜继续培养4天，使菌丝大量产孢，收获孢子粉，真空冷冻干燥24小时，干燥后的孢子粉贮存于无菌容器中，4℃保存备用。

获得的孢子粉孢子含量为124亿/g，活孢率为97.8%，含水量为2.56%，外观为淡玫烟色粉末。

步骤S1所述SDAY固体培养基配制方法如下：

葡萄糖40g/L、蛋白胨10g/L、酵母浸膏20g/L、琼脂15～20g/L、 H₂0 1L，搅拌混匀，然后分装，灭菌，备用。

步骤S2所述萨氏培养液配制方法如下：

葡萄糖40g/L、蛋白胨10g/L、酵母浸膏20g/L、H₂01L，搅拌混匀，然后分装，灭菌，备用。

    以下实施例2～7中孢子萌发率测定方法如下：将孢子悬浮液接种到真菌萌发液（葡萄糖20g/L、蛋白胨5g/L、H₂0 1L）中，24℃，170 r/min，震荡培养18h后镜检统计活孢率。润湿时间按照GB/T5451-2001标准方法测定。悬浮率按GB/T 14825-2006标准方法测定。pH按GB/T1600-93标准方法测定。细度通过激光粒径分布仪测定。数据统计分析：所有实验数据用DPS数据处理系统进行分析，计算均值及标准误，均值差异显著性通过Duncan新复极差法进行多重分析比较。

实施例2 玫烟色棒束孢可湿性粉剂的润湿剂优选实验

1、试验材料

（1）实施例1制备的分生孢子粉。

（2）本实施例不能将本发明涉及的润湿剂一一在此赘述，选择以下几种实验过程中总结出的比较典型的润湿剂进行说明：SDBS（十二烷基苯磺酸钠）、SDS（十二烷基硫酸钠）、OP-10 （辛烷基苯酚聚氧乙烯醚-10）、AEO-9（脂肪醇聚氧乙烯醚）、渗透剂T（Penetrating agent T）和渗透剂JFC。

2、实验方法

   （1）润湿力测定：将各润湿剂按l%、3%和5%的比例、玫烟色棒束孢分生孢子粉10%的比例加入滑石粉中，混合均匀，制成润湿剂含量不同但孢子含量相同的样品。润湿时间按照GB/T 5451-2001标准方法测定，即准确称取样品5 g，从与烧杯口齐平的位置一次均匀倒进盛有100mL水的250mL烧杯液面上，不扰动液面，同时立即用秒表记时，直至样品全部润湿为止，记下润湿时间，每个处理重复5次，以不加润湿剂的样品作为对照。

    （2）生物相容性测定：将上述各样品加入真菌萌发液（葡萄糖20g/L、蛋白胨5g/L、H₂0 1L）中，使其终浓度为1×10⁶个孢子/mL，24℃，170 r/min振荡培养18小时，取样用血球计数板计算孢子萌发率。每浓度重复5次，以不加润湿剂的样品作为对照。

3、结果

（1）润湿力比较：润湿剂的润湿力因种类和浓度的不同而异。方差分析表明，润湿力的的极显著差异存在于不同润湿剂之间（F=392.0070，P＜0.01）和同种润湿剂不同浓度之间（F=1609.9990，P＜0.01）。各润湿剂在不同浓度下的润湿时间如表1所示，除十二烷基苯磺酸钠（SDBS）和渗透剂T（Penetrating agent T）在1%浓度与对照无显著差异之外，其余润湿剂各浓度下润湿时间都显著低于对照。在1%浓度下，各润湿剂的润湿时间都大于200 s，即使AEO-9也达286.6 s。在3%浓度下，不同润湿剂的润湿性能表现明显差异，OP-10润湿时间仅为21.36 s，其次是AEO-9的31.8 s。当浓度达到5%，仍是OP-10的润湿时间最短（8.2 s），AEO-9次之（14.6 s）。

表1 不同润湿剂在不同浓度下玫烟色棒束孢孢子可湿性粉剂润湿时间比较

 

表中大、小写字母表示同一浓度下不同润湿剂间和同种润湿剂不同浓度间的差异显著性（p＜0.05）。

（2）润湿剂与孢子的相容性：如表2所示，孢子相容性的差异在不同润湿剂之间（F=164.0720，P＜0.01）和同种润湿剂的不同浓度间（F=103.9760，P＜0.01）均达差异极显著水平。在所测定的6种润湿剂中，除AEO-9，其余5种润湿剂中，孢子萌发率均表现随润湿剂浓度增大而下降的趋势。除1%浓度下的OP-10和3%浓度下的AEO-9，其余各润湿剂各浓度组合中孢子萌发率均显著低于对照。其中十二烷基硫酸钠对孢子萌发率的负面作用最明显。综合各润湿剂润湿力和生物学相容性试验结果显示，3%～5% 的OP-10和AEO-9都是本发明玫烟色棒束孢可湿性粉剂较好的润湿剂；其中，OP-10为玫烟色棒束孢可湿性粉剂最佳润湿剂，NP-10最佳浓度为3%。

表2 不同润湿剂在不同浓度下对孢子萌发率影响的比较

实施例3 玫烟色棒束孢可湿性粉剂的分散剂优选实验

1、试验材料

（1）实施例1制备的分生孢子粉。

（2）本实施例不能将本发明涉及的分散剂一一在此赘述，选择以下几种实验过程中总结出的比较典型的分散剂进行说明：亚甲基二萘磺酸钠（Diffusion promoter NNO）、木质素磺酸钠（Sodium lignosulfonate）、聚丙烯酸钠（Sodium polyacrylate）、分散剂MF（Diffusion promoter MF）、分散剂P-19和聚乙二醇（Polyethylene glycol）。

2、实验方法

    （1）分散性的测定：分散剂的筛选包括粗筛和细筛两个过程。粗筛是各分散剂按5%（w/w）比例与含3%润湿剂OP-10、10%孢子粉、82%滑石粉的样品混配成可湿性粉剂。通过目测可湿性粉剂在标准硬水中的分散情况筛选出分散效果较好的分散剂。目测的分散效果通常分为优、良、劣三个等级，其中，用“﹢”表示优：在水中成云雾状自动分散，并无可见颗粒下沉；用“﹢﹣”表示良：在水中能够自动分散，有颗粒下沉，下沉颗粒可慢慢分散或轻摇后分散；用“﹣”表示劣：在水中不能自动分散，呈颗粒状或絮凝状下沉，经强烈摇动后才分散。细筛是将粗筛得到的各优良分散剂按1%、3%、5%比例与含3%润湿剂OP-10、10%孢子粉、82%滑石粉的样品混配成可湿性粉剂。按GB/T 14825-2006标准方法测定其悬浮率。每个处理重复5次。以不加分散剂的样品作为对照。

   （2）生物相容性测定：将上述样品加入到真菌萌发液（葡萄糖20g/L、蛋白胨5g/L、H₂0 1L）中，使其终浓度为1×10⁶个孢子/mL。24℃，170 r/min振荡培养18 小时，取样用血球计数板计算孢子萌发率。每浓度重复5次，以不加分散剂的样品作为对照。

3、结果

（1）分散剂粗筛是为了淘汰分散效果较差的分散剂。选用5%浓度的分散剂是为了避免遗漏低浓度下分散效果不明显，高浓度下分散效果较好的分散剂。粗筛结果（如表3所示），分散剂MF淘汰掉，其余5种分散剂进行细筛。

表3 分散剂粗筛定性评价结果

（2）分散性能比较：可湿性粉剂悬浮率随分散剂的种类和浓度而异（如表4所示）。方差分析表明，悬浮率在不同分散剂间（F=14.56，P＜0.01）和同种分散剂的不同浓度之间（F=46.50，P＜0.01）差异均极显著。在1%浓度下，除聚乙二醇的悬浮率高于对照差异显著，其余与对照均无显著差异。在3%浓度下，木质素磺酸钠与对照无显著差异，其余分散剂悬浮率均高于对照，差异显著，其中NNO悬浮率最高为72.92%。在5%浓度下，聚乙二醇和NNO悬浮率与对照差异显著。

表4 分散剂优选实验结果

（3）分散剂与孢子相容性：方差分析表明，孢子相容性在不同分散剂间（F=3.1010，p＜0.05）差异显著；在同种分散剂不同浓度间（F=1.4280，p＞0.05）差异不显著（如表5所示）。在1%和3%浓度下，除聚丙烯酸钠孢子萌发率略低于对照，其余各分散剂对孢子萌发的影响不显著。在5%浓度下，木质素磺酸钠、聚丙烯酸钠和分散剂NNO孢子萌发率低于对照，而分散剂P-19和聚乙二醇与对照无显著差异。综合各分散剂悬浮率和生物学相容性试验结果显示，分散剂NNO为本发明玫烟色棒束孢可湿性粉剂最佳的分散剂，最佳浓度为3%。

表5 不同分散剂在不同浓度下对玫烟色棒束孢孢子萌发率影响的比较

实施例4 玫烟色棒束孢可湿性粉剂的紫外保护剂优选实验

1、试验材料

（1）实施例1制备的分生孢子粉。

（2）本实施例不能将本发明涉及的紫外保护剂一一在此赘述，选择以下几种实验过程中总结出的比较典型的紫外保护剂进行说明：腐植酸（Humic acid）、抗坏血酸（Ascorbic acid）、荧光素钠（Fluorescein sodium）和对氨基苯甲酸（P-aminobenzoic acid）。

2、实验方法

   （1）紫外保护剂效能的测定：将含3%润湿剂OP-10、3%分散剂NNO、10%孢子粉和84 %滑石粉混配成可湿性粉剂，称样配制成浓度为1×10⁶个孢子/mL的孢子悬浮液。然后按0.1%、0.3%及0.5%的浓度分别加入各种紫外线保护剂。混匀后静置10min，用移液器吸取0.1mL上述孢子液于无菌玻璃纸上，涂抹均匀。然后将各玻璃纸置于紫外灯（30W光强）下20cm 处分别照射20、40、60秒后，将玻璃纸平放在SDAY平板底部，放置在24℃下黑暗培养，以免孢子光复活，18小时后，在显微镜下抽样统计萌发孢子数并计算出萌发率。以不加紫外保护剂的可湿粉剂的稀释孢子悬浮液作照射和不照射处理，并分别作为残存活孢率和理论活孢率的对照。

保护效能指数计算公式如下：

保护效能指数=（照射后活孢率－残存活孢率）/（理论活孢率－残存活孢率）

   （2）生物学相容性的测定：孢子悬浮液的配制方法及浓度同上，不同之处是加保护剂后不经紫外照射就将培养皿置于24℃黑暗培养，18 小时后抽样统计孢子萌发率。每浓度重复5次，以不加紫外保护剂的可湿性粉剂悬浮液为对照。

3、结果

（1）紫外保护剂与孢子相容性：方差分析表明，孢子的相容性在不同保护剂之间（F=93.4040，P＜0.01）和不同浓度之间（F=9.8850，P＜0.01）均极为显著（如表6所示）。对氨基苯甲酸各浓度孢子萌发率均显著低于对照，相容性极差。抗坏血酸在0.3%和0.5%浓度下与对照萌发率有显著差异，在0.1%浓度下无显著差异，相容性较好。腐植酸和荧光素钠各浓度下对孢子萌发影响不显著，相容性最好。

表6 四种紫外线保护剂在不同浓度下对玫烟色棒束孢孢子萌发率的影响

（2）保护效能比较  紫外保护剂的效能因保护剂的种类和浓度而异（如表7所示）。方差分析表明，在不同保护剂之间（F=11.4791，P＜0.01），在不同浓度之间（F=18.3138，P＜0.01）和在不同的照射时间（F=46.7277，P＜0.01）差异均极显著。由表7可知腐植酸和对氨基苯甲酸保护效果极差。抗坏血酸的保护效果优于荧光素钠。综合保护效能和孢子相容性结果显示，0.1～0.5%的抗坏血酸和荧光素钠都是本发明玫烟色棒束孢可湿性粉剂较好的紫外保护剂；其中，抗坏血酸是最佳紫外保护剂，抗坏血酸最佳浓度为0.1%。

表7 四种紫外线在不同浓度不同照射时间下对孢子的紫外保护效能指数比较

表中数据为Mean±S.E.，数据后不同小写字母表示差异显著（p﹤0.05）。

实施例5 玫烟色棒束孢可湿性粉剂的载体优选实验

1、试验材料

（1）实施例1制备的分生孢子粉。

（2）本实施例不能将本发明涉及的载体一一在此赘述，选择以下几种实验过程中总结出的比较典型的载体进行说明：滑石粉（Talcum powder）、硅藻土（Diatomite）、高岭土（Kaolin）和轻质碳酸钙（Light calcium carbonate）。

2、实验方法

（1）萌发率的测定：将载体与玫烟色棒束孢分生孢子粉以9:1的比例混匀放置10天，取适量的孢子粉与载体混合物添加到真菌萌发液（葡萄糖20g/L、蛋白胨5g/L、H₂0 1L）中，使其终浓度为1×10⁶个孢子/mL。将孢子液在24℃，170 r/min振荡培养18 小时，镜检观察，统计孢子萌发率，5次重复，计算平均数。

（2）菌落生长速率的测定：将各载体加入SDAY培养基中，分别配制浓度为 0.05g/mL，湿热灭菌，倒入直径为9 cm的培养皿中，待凝固后接入用直径5 mm打孔器打下并培养2～3天的菌饼，5次重复，培养7天，测量菌落直径，计算菌落生长速率。

3、结果

从表8可以看出，玫烟色棒束孢孢子粉与载体混合处理后，孢子的萌发率因载体的不同而呈现出差异。高岭土和轻质碳酸钙混合处理的玫烟色棒束孢孢子萌发率明显低于对照；滑石粉与硅藻土混合处理的玫烟色棒束孢孢子其萌发率与对照并无显著差异。4种载体中，添加滑石粉的培养基中，菌丝的生长速率显著高于对照，对玫烟色棒束孢的生长表现出促进作用，其他与对照无显著差异。载体对产孢量的影响：轻质碳酸钙和高岭土对玫烟色棒束孢的产孢有一定的抑制作用，但抑制作用较小，滑石粉和硅藻土的产孢量与对照无显著差异。综合载体对玫烟色棒束孢分生孢子萌发率、菌落生长速率及产孢量的影响，结果显示，滑石粉、硅藻土、高岭土和轻质碳酸钙均可作为本发明玫烟色棒束孢可湿性粉剂的载体。其中，滑石粉为最佳载体。

表8 载体对玫烟色棒束孢分生孢子的影响

实施例6 玫烟色棒束孢可湿性粉剂的制备

1、制备方法：将实施例1制备的玫烟色棒束孢孢子粉与辛烷基苯酚聚氧乙烯醚-10（OP-10）、分散剂NNO、抗坏血酸，滑石粉混合，即得。

    具体地，用气流粉碎机将润湿剂、分散剂、紫外保护剂和载体粉碎后备用，将各助剂按比例混合均匀，然后将干燥过的高纯度的孢子粉加入到混合物中，混合均匀后加工成可湿性粉剂。

2、本实施例所制备的可湿性粉剂包括以下质量百分比的组成成分：玫烟色棒束孢分生孢子粉10%、辛烷基苯酚聚氧乙烯醚-10（OP-10）3%、分散剂NNO 3%、抗坏血酸0.1%，滑石粉83.9%。

3、本实施例所制备的可湿性粉剂的性能指标测定

检测结果表明，产品性能指标优良，玫烟色棒束孢孢子萌发率≥90%；润湿性<2min；质量悬浮率为75.28%；孢子的悬浮率为95.12%，水分含量为2.88%；细度（过325目标准筛）≥98%；pH值为6.20。所配制的可湿性粉剂的性能指标符合农药制剂商品要求。

实施例7 玫烟色棒束孢可湿性粉剂的制备

1、制备方法同实施例6。

2、本实施例所制备的可湿性粉剂包括以下质量百分比的组成成分：玫烟色棒束孢分生孢子粉9%、OP-10 5%、分散剂NNO 3%、抗坏血酸0.1%，滑石粉82.9%。

3、本实施例所制备的可湿性粉剂的性能指标测定

检测结果表明，产品性能指标较好，玫烟色棒束孢孢子萌发率≥90%；润湿性< 2min；质量悬浮率为79.32%；孢子的悬浮率为95.52%，水分含量为2.91%；细度（过325目标准筛）≥98%；pH值为6.30。所配制的可湿性粉剂的性能指标符合农药制剂商品要求。

实施例8 玫烟色棒束孢可湿性粉剂的制备

1、制备方法同实施例6。    

2、本实施例所制备的可湿性粉剂包括以下质量百分比的组成成分：玫烟色棒束孢分生孢子粉12%、AEO-9 3%、分散剂 NNO 3%、抗坏血酸0.5%，硅藻土81.5%。

3、本实施例所制备的可湿性粉剂的性能指标测定

检测结果表明，产品性能指标较好，玫烟色棒束孢孢子萌发率≥90%；润湿性<2min；质量悬浮率为74.77%；孢子的悬浮率为93.46%，水分含量为2.97%；细度（过325目标准筛）≥98%；pH值为6.40。所配制的可湿性粉剂的性能指标符合农药制剂商品要求。

实施例9 玫烟色棒束孢可湿性粉剂的制备

1、制备方法同实施例6。

2、本实施例所制备的可湿性粉剂包括以下质量百分比的组成成分：玫烟色棒束孢分生孢子粉14%、OP-10 5%、分散剂 NNO 3%、荧光素钠0.5%，硅藻土77.5%。

3、本实施例所制备的可湿性粉剂的性能指标测定

检测结果表明，产品性能指标较好，玫烟色棒束孢孢子萌发率≥90%；润湿性<2min；质量悬浮率为78.17%；孢子的悬浮率为95.46%，水分含量为2.97%；细度（过325目标准筛）≥98%；pH值为6.60。所配制的可湿性粉剂的性能指标符合农药制剂商品要求。

实施例10 玫烟色棒束孢可湿性粉剂的制备

1、制备方法同实施例6。

2、本实施例所制备的可湿性粉剂包括以下质量百分比的组成成分：玫烟色棒束孢分生孢子粉15%、OP-10 4%、分散剂NNO 3%、荧光素钠0.3%，滑石粉77.7%。

3、本实施例所制备的可湿性粉剂的性能指标测定

检测结果表明，产品性能指标较好，玫烟色棒束孢孢子萌发率≥90%；润湿性<2min；质量悬浮率为78.82%；孢子的悬浮率为94.16%，水分含量为2.92%；细度（过325目标准筛）≥98%；pH值为6.5。所配制的可湿性粉剂的性能指标符合农药制剂商品要求。

实施例11 玫烟色棒束孢可湿性粉剂的制备

1、制备方法同实施例6。

2、本实施例所制备的可湿性粉剂包括以下质量百分比的组成成分：玫烟色棒束孢分生孢子粉10% 、AEO-9 3%、分散剂NNO 4%、抗坏血酸0.5%，滑石粉82.5%。

   3、本实施例所制备的可湿性粉剂的性能指标测定

检测结果表明，产品性能指标较好，玫烟色棒束孢孢子萌发率≥90；润湿性<2min；质量悬浮率为73.78；孢子的悬浮率为94.56，水分含量为3.07；细度（过325目标准筛）≥98%；pH值为6.4。所配制的可湿性粉剂的性能指标符合农药制剂商品要求。

实施例12 玫烟色棒束孢可湿性粉剂的制备

1、制备方法同实施例6。

2、本实施例所制备的可湿性粉剂包括以下质量百分比的组成成分：玫烟色棒束孢分生孢子粉10%，AEO-9 5%，分散剂NNO 3%，抗坏血酸0.1%，硅藻土 81.9%。

3、本实施例所制备的可湿性粉剂的性能指标测定

检测结果表明，产品性能指标较好，玫烟色棒束孢孢子萌发率≥90；润湿性<2min；质量悬浮率为77.65；孢子的悬浮率为95.55，水分含量为3.51；细度（过325目标准筛）≥98；pH值为6.8。所配制的可湿性粉剂的性能指标符合农药制剂商品要求。

实施例13 玫烟色棒束孢可湿性粉剂的制备

1、制备方法同实施例6。

2、本实施例所制备的可湿性粉剂包括以下质量百分比的组成成分：玫烟色棒束孢分生孢子粉10%，AEO-9 4%，分散剂NNO 3%，荧光素钠0.3%，滑石粉82.7%。 

3、本实施例所制备的可湿性粉剂的性能指标测定

检测结果表明，产品性能指标较好，玫烟色棒束孢孢子萌发率≥90；润湿性<2min；质量悬浮率为78.83；孢子的悬浮率为96.12，水分含量为3.2；细度（过325目标准筛）≥98；pH值为6.3。所配制的可湿性粉剂的性能指标符合农药制剂商品要求。

实施例14 玫烟色棒束孢可湿性粉剂的制备

1、制备方法同实施例6。

2、本实施例所制备的可湿性粉剂包括以下质量百分比的组成成分：玫烟色棒束孢分生孢子粉10%，AEO-9 3%，扩散剂NNO 3%，荧光素钠0.3%，滑石粉83.7%。

3、本实施例所制备的可湿性粉剂的性能指标测定

检测结果表明，产品性能指标较好，玫烟色棒束孢孢子萌发率≥90；润湿性<2min；质量悬浮率为72.3；孢子的悬浮率为92.5，水分含量为3.6；细度（过325目标准筛）≥98；pH值为6.2。所配制的可湿性粉剂的性能指标符合农药制剂商品要求。

实施例15 玫烟色棒束孢可湿性粉剂的药效评价

1、供试材料

    （1）供试昆虫：小菜蛾Plutella xylostella (L.) 2龄幼虫。

（2）供试药剂：实施例6制备的可湿性粉剂。

发明人经过室内毒力测定实验，结果显示，上述实施例6～14所制备的玫烟色棒束孢可湿性粉剂均对小菜蛾具有非常好的防治效果，当可湿性粉剂浓度为1×10⁷个孢子/mL时，从接菌后的第二天小菜蛾就开始死亡，第6天小菜蛾的校正死亡率均在80.6%～94.6%之间。

由于数据庞大，本发明仅提供实施例6制备的可湿性粉剂防治小菜蛾的数据，足以说明本发明提供的玫烟色棒束孢可湿性粉剂对小菜蛾等害虫具有很好的防治效果。

（3）对照药剂：苏云金杆菌可湿性粉剂，购自扬州绿源生物化工有限公司生产。

    （4）供试作物：芥蓝（B. alboglabra Bailey）。

2、玫烟色棒束孢可湿性粉剂对小菜蛾的室内毒力测定

    （1）测定方法

玫烟色棒束孢可湿性粉剂用无菌水稀释成1×10⁷（相当于稀释1000倍）、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³个孢子/mL 5个浓度。

    玫烟色棒束孢可湿性粉剂对小菜蛾的室内毒力测定方法：采用浸虫法进行生物测定。选取个体大小、活力一致的小菜蛾2龄幼虫，用软毛笔将供试幼虫挑入上述可湿性粉剂各稀释液中，浸渍10s后挑出，将幼虫置于灭菌的滤纸上吸干多余水分后，移至叶片上，放入底部衬有湿润滤纸的培养皿（直径为9cm）内，培养皿用保鲜膜封口保湿，在薄膜上扎孔通气，置于人工智能箱中，24℃，相对湿度（RH）90%，光照周期为光照：黑暗=14：10。24小时后开始观察，视皿内叶片被取食情况更换新鲜甘蓝叶片，每天记录感病症状和死亡虫数，连续观察6天，并将死虫挑到皿底放有湿滤纸的培养皿内，24℃保湿培养，观察虫尸上菌丝生长情况，以区分是否为玫烟色棒束孢致死虫。每处理20头幼虫，重复5次，共100头幼虫。以可湿性粉剂基础配方（不包含玫烟色棒束孢孢子粉的可湿性粉剂）为空白对照（CK₀）。以16000IU/mg苏云金杆菌可湿性粉剂对照（CK₁）。

    挑取已死亡并且身上长有玫烟色菌丝的幼虫，置于0.1%氯化汞溶液中浸泡1～2min，然后用无菌水冲洗3次，转接在SDAY培养基平板上，24℃培养3天后，培养基平板上的虫体长出菌丝，最后制片观察挑取得到的菌丝是否为玫烟色棒束孢。统计玫烟色棒束孢致死虫数。

    所有数据的分析均采用DPS软件完成。

    死亡率（%）=死亡虫数/每一浓度处理试虫总数×100

校正死亡率（%）=（处理死亡率-对照死亡率）/（1-对照死亡率）×100

（2）室内毒力测定结果

    接种3d后，挑取死亡并且身上长出淡玫烟色菌丝的幼虫，置于0.1%氯化汞溶液中浸泡1～2min，无菌水冲洗3次后，转接在SDAY培养基平板上，24℃培养8天，培养基平板上的虫体长出菌丝。经制片观察确认，从小菜蛾幼虫上挑取得到的菌丝为玫烟色棒束孢。玫烟色棒束孢致死虫数统计结果如表9所示。

    表9 10%玫烟色棒束孢可湿性粉剂对小菜蛾的毒力测定结果

如表9所示，玫烟色棒束孢可湿性粉剂对小菜蛾有很强的致死作用，在所测的浓度范围（1×10³～1×10⁷个孢子/mL）内，当可湿性粉剂浓度为1×10⁶个孢子/mL时小菜蛾的校正死亡率为85.9%，浓度增加到1×10⁷个孢子/mL时小菜蛾的校正死亡率为94.6%。从接菌后的第二天就开始大量死亡，第6天的校正死亡率分别为14.1%、29.3%、59.8%、85、9%、94.6%，经测定该菌对小菜蛾的致死中浓度为4.36×10⁴个孢子/mL，与对照药剂16000 IU/mg苏云金杆菌相比，防效较好，该玫烟色棒束孢可湿性粉剂对小菜蛾有较强的毒力，作为一种微生物杀虫剂，在小菜蛾生物防治中具有广阔的应用前景。

3、玫烟色棒束孢可湿性粉剂对小菜蛾的室内盆栽毒力测定

（1）测定方法

玫烟色棒束孢可湿性粉剂用无菌水稀释成1×10⁷（相当于稀释1000倍）、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴、1×10³个孢子/mL 5个浓度。

用小型营养钵种植甘蓝35盆，每盆1株，生长60天后，大约7～8片真叶期时，挑取室内饲养的小菜蛾2龄幼虫接在甘蓝叶片上，每盆30头，用喷雾法将上述不同浓度的可湿性粉剂稀释液用小型喷雾器均匀喷洒在甘蓝苗上，喷雾16000 IU/mg苏云金杆菌可湿性粉剂1500倍稀释液作为对照（CK₁），并以可湿性粉剂基础配方（不包含玫烟色棒束孢孢子粉的可湿性粉剂）为空白对照（CK₀）。每处理5个重复，喷雾后分别饲养于养虫笼内，每天记录感病症状和死亡虫数，连续观察6天，并将死虫挑到皿底放有湿滤纸的培养皿内，24℃保湿培养，观察虫尸上菌丝生长情况，以确认虫尸上的菌丝是否为玫烟色棒束孢。

    挑取已死亡并且身上长有玫烟色菌丝的幼虫，置于0.1%氯化汞溶液中浸泡1～2min，然后用无菌水冲洗3次，转接在SDAY培养基平板上，24℃培养3天后，培养基平板上的虫体长出菌丝，最后制片观察挑取得到的菌丝是否为玫烟色棒束孢。统计玫烟色棒束孢致死虫数。

    所有数据的分析均采用DPS软件完成。

    死亡率（%）=死亡虫数/每一浓度处理试虫总数×100

校正死亡率（%）=（处理死亡率-对照死亡率）/（1-对照死亡率）×100

（2）室内盆栽毒力测定结果

    接种3天后，挑取死亡并且身上长出淡玫烟色菌丝的幼虫，置于0.1%氯化汞溶液中浸泡1～2min，无菌水冲洗3次后，转接在SDAY培养基平板上，24℃培养8天，培养基平板上的虫体长出菌丝。经制片观察确认，从小菜蛾幼虫上挑取得到的菌丝为玫烟色棒束孢。玫烟色棒束孢致死虫数统计结果如表10所示。

    表10 10%玫烟色棒束孢可湿性粉剂对小菜蛾的室内盆栽药效结果

玫烟色棒束孢可湿性粉剂对小菜蛾有很强的致死作用（如表10所示），在所测的浓度范围（1×10³～1×10⁷个孢子/mL）内，当菌液浓度为1×10⁶个孢子/mL时小菜蛾的校正死亡率为85.8%，浓度增加到1×10⁷个孢子/mL时小菜蛾的校正死亡率为91.3%。从接菌后的第二天就开始死亡，第6天的校正死亡率分别为30.1%、45.2%、63.4%、85.8%、91.3%，经测定该菌对小菜蛾的致死中浓度为2.42×10⁵个孢子/mL，与对照药剂苏云金杆菌相比，防效较好，该玫烟色棒束孢可湿性粉剂对小菜蛾有较强的毒力，作为一种微生物杀虫剂，在小菜蛾生物防治中具有广阔的应用前景。

4、玫烟色棒束孢可湿性粉剂防治小菜蛾的田间试验

（1）试验方法

共15个小区，每个小区面积16平方米，随机区组排列。玫烟色棒束孢可湿性粉剂稀释1000倍、2000倍、5000倍三个浓度，，记为1000X、2000X、5000X，以16000IU/mg苏云金杆菌可湿性粉剂1500倍稀释液为药剂对照（CK₁），以清水处理为空白对照（CK₀），每个处理重复3次。用市售的背负式手动喷雾器分小区均匀喷雾。每公顷用药液量900kg，每小区用水1.45kg。

    试验采用5点法进行调查，每小区5点取样，每点2株定点调查，药前调查虫口基数，药后1、3、7天调查小菜蛾幼虫残虫数，计算虫口减退率和防治效果（防效），并进行差异显著性分析，所有数据的分析均采用DPS软件完成，用邓肯氏新复极差法对防效进行统计分析，以确定其显著性。

    虫口减退率（%）=（药前活虫数-药后活虫数）/药前活虫数×100

    防治效果（%）=（PT-CK）/（100-CK）×100

    式中，CK：空白对照区虫口减退率，PT：药剂处理区虫口减退率。

（2）田间试验结果

田间试验统计结果如表11所示。

    表11 10%玫烟色棒束孢可湿性粉剂防治小菜蛾田间药效试验结果

玫烟色棒束孢可湿性粉剂对小菜蛾的田间药效试验结果如表11所示，玫烟色棒束孢可湿性粉剂对小菜蛾有较好的防治效果，其使用剂量为稀释1000倍时，药后第1天、3天和7天的防效分别为49.09%、66.18%、88.37%；其使用剂量为稀释2000倍时，药后第1天、3天和7天的防效分别为41.98%、57.82%、79.36%；其使用剂量为稀释5000倍时，药后第1天、3天和7天的防效分别为29%、45.29%、72.37%，均比对照药剂防治效果好。在使用剂量为稀释1000～5000倍时对十字花科蔬菜害虫小菜蛾具有较好的防效和持久性。

据试验期间田间观察，各处理区供试作物生长正常，未发现任何不良影响。试验期间据田间调查，各处理区有菜青虫、飞虱混合危害，施药后菜青虫及飞虱的数量下降。说明供试药剂对菜青虫和飞虱具有兼职作用。试验期间据田间调查，对其他非靶标生物无不良影响。作为一种对环境安全的微生物农药，玫烟色棒束孢可湿性粉剂具有极大的开发利用前景。

Claims (7)

1. 一种玫烟色棒束孢可湿性粉剂，其特征在于，包括如下质量百分比的组分：玫烟色棒束孢分生孢子粉5%～20%、润湿剂3%～5%、分散剂3%～5%、紫外保护剂0.1%～0.5%，余量为载体；

所述玫烟色棒束孢为玫烟色棒束孢菌株SCAU-IFCF02，于2013年11月7日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2013526；

所述的润湿剂为辛烷基苯酚聚氧乙烯醚-10或脂肪醇聚氧乙烯醚；

所述的分散剂为亚甲基二萘磺酸钠；

所述的紫外保护剂为抗坏血酸或荧光素钠；

所述的载体为滑石粉或硅藻土。

2.根据权利要求1所述的玫烟色棒束孢可湿性粉剂，其特征在于，包括如下质量百分比的组分：玫烟色棒束孢分生孢子粉8%～15%、润湿剂3.5%～4.5%、分散剂3.5%～4.5%、紫外保护剂0.2%～0.4%，余量为载体。

3.根据权利要求1所述的玫烟色棒束孢可湿性粉剂，其特征在于，包括如下质量百分比的组分：玫烟色棒束孢分生孢子粉10%、 润湿剂3%、分散剂3%、紫外保护剂0.1%，余量为载体。

4.根据权利要求1所述的玫烟色棒束孢可湿性粉剂，其特征在于，所述玫烟色棒束孢分生孢子粉的孢子含量为124亿/g。

5.权利要求1～4任一所述的玫烟色棒束孢可湿性粉剂在制备防治十字花科蔬菜害虫药剂方面的应用。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述害虫为小菜蛾、红火蚁或烟粉虱。

7.权利要求1～4任一所述的玫烟色棒束孢可湿性粉剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1.一级固体培养，将玫烟色棒束孢菌株SCAU-IFCF02涂布于SDAY固体培养基培养；

S2.二级液体振荡培养，用含有0.03% Tween-80的无菌水洗下上述固体培养基上的孢子，过滤制成1×10⁷个孢子/mL的悬浮液，将悬浮液接种于萨氏培养液振荡培养；

S3.三级产孢培养。