CN112315985B - 一种厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂及其制备和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂及其制备和应用。所述厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂，包括重量份数的以下组分：有效成分15～25份，基础组方3～15份，粉状载体65～87份；所述有效成分为厚垣普可尼亚菌冻干菌粉，所述的厚垣普可尼亚菌的保藏号为CGMCC No.19635。所述基础组方包括分散剂、湿润剂和紫外保护剂。本发明提供的真菌可湿性粉剂，根据可湿性粉剂的多条国标调整了基础组方，优化了湿润时间和孢子悬浮率等多种基本性能，使此真菌可湿性粉剂性能更好，具有良好的应用开发前景。

Description

一种厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂及其制备和应用
技术领域
本发明属于微生物学技术领域，具体涉及一种昆虫病原真菌的粉剂及其制备方法和应用。
背景技术
动物外寄生虫病是严重危害畜牧业发展的一大类疾病。长期以来，对家畜外寄生虫的防治主要依靠化学药物，并发挥了巨大的作用，但是随着化学驱虫药产生的抗药性、药物残留及环境污染等问题日益严重，已经引起人们的广泛认识，因此利用昆虫病原真菌对动物外寄生虫的生物拮抗作用来防治动物外寄生虫的技术在当前备受关注。
蜱虫是一种脊椎动物的体外寄生虫，是一些人兽共患病的传播媒介和贮存宿主，可传播包括螺旋体、立克次体、病毒、细菌等的感染。防治蜱虫的方法可以是物理防护或用化学药剂，现使用的化学药剂包括百草油、藻酸丙二醇酯、马拉硫磷、杀螟硫磷等，但化学药剂的长时间使用会导致对生态环境的不良影响、以及使蜱虫产生抗药性等问题。
厚垣普可尼亚菌(Pochonia chlamydosporia)属于真菌界，子囊菌门，子囊菌亚门，粪壳菌纲，肉座菌目，麦角菌科，普可尼亚属。厚垣孢普可尼亚菌是兼性寄生菌，在没有线虫寄主的情况下，可以在根际周围及土壤中营腐生生活。国内目前主要利用该菌防治农林作物昆虫病。但根据报道和先前研究表明，同种菌种不同菌株之间，其形态特性、产孢情况和杀虫效力等亦存在着一定的差异。所以目前在昆虫病原真菌制剂临床研究应用中所面临的重要问题是如何制备一种能应用于生产实际的昆虫病原真菌生物制剂，充分利用其作为昆虫生防菌的巨大潜力。
发明内容
为解决上述现有技术的问题，本发明提出了一种厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂，是一种昆虫病原真菌-可湿性粉剂。
本发明的又一目的是提出所述的厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂的制备方法。
本发明的再一目的是提出所述的厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂的应用。
实现本发明上述目的的技术方案为：
一种厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂，包括重量份数的以下组分：有效成分15～25份，基础组方3～15份，粉状载体65～87份；
所述有效成分为厚垣普可尼亚菌冻干菌粉，所述的厚垣普可尼亚菌的保藏号为CGMCC No.19635。
所述基础组方包括分散剂、湿润剂和紫外保护剂。
进一步，所述的厚垣普可尼亚菌为ARSEF 3539菌株，其保藏号为：CGMCCNo.19635。保藏时间为2020年4月20日。地址：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。
其中，基础组方的重量份数包括但不限于3份、4份、5份、6份、7份、8份、9份、10份、11份、12份、13份、14份或15份；
粉状载体的重量份数包括但不限于65份、67份、69份、71份、73份、75份、77份、79份、81份、83份、85份或87份。
进一步地，所述厚垣普可尼亚菌冻干菌粉中活菌数为5×106～7×107个/g；冻干菌粉中的冻干保护剂为脱脂奶粉。
本发明的一种优选技术方案为，所述厚垣普可尼亚菌冻干菌粉中活菌数为5×107～7×107个/g。
优选地，所述真菌可湿性粉剂的细度为98％过200目筛。该真菌可湿性粉剂的细度可以更利于喷洒及湿润。真菌可湿性粉剂的活菌数可以为但不限于5×106个/g、6×106个/g、7×106个/g、8×106个/g、9×106个/g、10×106个/g。优选的真菌可湿性粉剂活菌数，使其保证一定数量的活菌数，可以有效地保证厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂的杀动物外寄生虫的使用效果。所述真菌可湿性粉剂的pH范围为6.5-7.5。
其中，所述分散剂为亚甲基二萘磺酸二钠；湿润剂为SDS(十二烷基硫酸钠)；紫外保护剂为荧光素钠、脱脂乳、抗环血酸钠、荧光素钠中的一种或多种。
本发明的一种优选技术方案为，所述分散剂、湿润剂和紫外保护剂的质量比例为1：(2～4)：(2～4)；和/或
所述紫外保护剂为荧光素钠。
更优选地，所述厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂，包括重量份数的以下组分：有效成分18～22份，基础组方3～10份，粉状载体70～80份；和/或
所述粉状载体为硅藻土。
所述硅藻土的粒径为0.1～0.25mm，具体的可以为但不限于0.1mm、0.13mm、0.15mm、0.18mm、0.2mm、0.23mm或0.25mm。优化硅藻土的粒径范围，可以使分生孢子在粉状载体中的分散效果更好。
所述的厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂的制备方法，包括以下步骤：
(a)液固双相发酵生产厚垣普可尼亚菌分生孢子悬液；
(b)将分生孢子悬液与冻干保护剂混合，冻干20～30h制备为冻干菌粉；
(c)按重量份配比，将冻干菌粉、基础组方和粉状载体混合均匀，得到厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂。
进一步地，所述步骤(a)包括操作:
将厚垣普可尼亚菌菌株，接种于PDA固体培养基上，于22～28℃温度下培养；
将长满菌丝的PDA固体培养基上的孢子冲洗下来，加入到SDY液体培养基中，在25～30℃条件下培养6～9天，然后收集菌液；
将所述菌液按20mL：80～150g玉米粒的比例倒入玉米粒培养基中，在22～18℃条件下培养；
在孢子培养至第4周时，用孢子洗脱液将孢子洗脱下来，用灭菌生理盐水稀释成(0.1～2.0)×107个/mL的分生孢子悬液。
本制备方法的一种优选技术方案为，用灭菌生理盐水稀释成(0.8～1.5)×107个/mL的分生孢子悬液。
其中，所述玉米粒培养基通过以下方法制得：取80～150g玉米粒放入菌种袋中，加入80～150mL水，浸泡20～30h，高温高压灭菌。可选地，所述高温高压灭菌的条件是121℃高温高压灭菌20min。
其中，所述步骤(b)包括操作:配置冻干保护剂8～15％的溶液，与所述分生孢子悬液按1(0.5～2)体积比混合，在﹣70～-85℃低温中预冻2～5h，再将温度降至﹣45～-55℃，真空冷冻干燥18～24h。
本发明所述的厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂在在触杀动物外寄生虫中的应用，所述动物外寄生虫为蜱虫，优选所述蜱虫为麻点璃眼蜱。
本发明的有益效果在于：
(1)本发明提供的真菌可湿性粉剂，根据可湿性粉剂的多条国标调整了基础组方，优化了湿润时间和孢子悬浮率等多种基本性能，使此真菌可湿性粉剂性能更好，具有良好的应用开发前景。
(2)本发明提供的真菌可湿性粉剂，除了添加了可湿性粉剂基础组方(分散剂和湿润剂)以外，考虑到真菌孢子室外使用受紫外线影响的因素，还添加了紫外保护剂，提高了真菌可湿性粉剂对外界环境的抵抗力。
可湿性粉剂中，分散剂亚甲基二萘磺酸二钠使厚垣普可尼亚菌孢子的分散效果更好，悬浮稳定性更高。湿润剂十二烷基硫酸钠使厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂的湿润时间更短。紫外保护剂荧光素钠使厚垣普可尼亚菌分生孢子室外作用更加稳定，尽可能少的受阳光紫外线影响。粉状载体选用硅藻土，也可以使分生孢子的分散效果更好。
另外，厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂在4℃条件下保存，可以长期保存，是一种可以应用于生产实际的杀外寄生虫的真菌生物制剂。
附图说明
图1为厚垣普可尼亚菌冻干菌粉。
图2为厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂。
图3为厚垣普可尼亚菌对麻点璃眼蜱的杀灭作用照片，A：被作用麻点璃眼蜱腹侧观；B：被作用麻点璃眼蜱背侧观；C：麻点璃眼蜱腹侧观；D：麻点璃眼蜱背侧观。
具体实施方式
除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
除特殊说明外，本发明所用的仪器、试剂和耗材均购自市场。
实施例中所使用的亚甲基二萘磺酸二钠，相对分子质量为472.4418；SDS相对分子质量为288.38；荧光素钠相对分子质量为376.27。所用厚垣普可尼亚菌为ARSEF 3539菌株，保藏号为：CGMCC No.19635。
实施例1厚垣普可尼亚菌液固双相发酵及孢子最适洗脱时间的确定
(1)培养基、孢子洗脱液的制备：
1.1)玉米粒培养基的制备：将完整玉米粒清洗干净，烘干，取100g放入菌种袋中，制备30袋，再分别向其中加入100mL蒸馏水，浸泡24h，121℃高温高压灭菌20min后备用；
1.2)PDA固体培养基的制备：将新鲜马铃薯去皮，洗净后切成1厘米见方的小块，称取200g加入容器中，并加入500mL蒸馏水，中火煮沸后转入小火，持续约40min，再补充蒸馏水至初始刻度线处；将煮好的马铃薯用350目纱布过滤，取滤液并加入10g无水葡萄糖和8g琼脂，定容至500mL，121℃高温高压灭菌20min后倒平板备用；
1.3)孢子洗脱液的制备：将5mL吐温-80加入到1000mL蒸馏水中，加热并搅拌混合均匀，分装后于121℃高温高压灭菌20min后备用；
(2)接种培养基：在无菌条件下，将厚垣普可尼亚菌菌株，接种于PDA固体培养基上，置于25℃恒温培养箱中培养。在已长满菌丝的PDA固体培养基上用孢子洗脱液少量多次的将孢子冲洗下来，然后按体积比2％的接种量(孢子悬液按体积比，粉剂配制按质量比)加入到已高温高压灭菌的SDY液体培养基中，放入恒温摇床中，以28℃、150r/min的条件培养7d，然后收集菌液；另取出已经高温高压灭菌的玉米粒培养基，其中每袋含玉米粒100g，向每袋内倒入20mL的液体发酵菌液，封口并使菌液充分与玉米粒混匀，于25℃恒温培养箱中培养；
(3)取液固双相培养的玉米粒，每隔7天用孢子洗脱液少量多次地将孢子洗脱下来，然后用血细胞计数板计数。测得各周分生孢子量。从而选出第4周是厚垣普可尼亚菌液固双相发酵最适的孢子洗脱时间。结果见表1。
表1厚垣普可尼亚菌液固双相发酵各周产孢量
Figure BDA0002763313130000071
实施例2厚垣普可尼亚菌菌株的冻干孢子粉的制备
步骤(1)和步骤(2)和实施例1相同。步骤(3)如下：
(3)收集孢子悬液及制备冻干菌粉：在孢子培养至第4周时，用孢子洗脱液少量多次的将孢子洗脱下来，并用血细胞计数板计数，最后再用灭菌生理盐水稀释成1×107个/mL的孢子悬液，用冻干保护剂(10％脱脂奶粉)与孢子悬液按1：1混合装入冻干盒中，然后放入﹣80℃低温冰箱中预冻至少2h，打开真空冷冻干燥机，再打开冷阱开关，待温度降至﹣50℃时，真空冷冻干燥20h。
冻干菌粉照片如图1所示，厚垣普可尼亚菌冻干菌粉保存在冻干盒内，为疏松的海绵状物质，活菌数为5×107～7×107个/g。
实施例3厚垣普可尼亚菌冻干菌粉的复苏效果观察
实验组：实施例2制备的Pochonia chlamydosporia菌株孢子冻干菌粉。
对照组：自然状态下未经冻干的Pochonia chlamydosporia菌株孢子组。
PDA固体培养基的制备：将新鲜马铃薯去皮，洗净后切成1厘米见方的小块，称取200g加入容器中，并加入500mL蒸馏水，中火煮沸后转入小火，持续约40min，再补充蒸馏水至初始刻度线处；将煮好的马铃薯用350目纱布过滤，取滤液并加入10g无水葡萄糖和8g琼脂，定容至500mL，121℃高温高压灭菌20min后倒平板备用。
实验方法：在无菌条件下，用无菌生理盐水溶解冻干后的菌株孢子粉，计数，稀释制成1×107个/mL的孢子悬液，吸取100μL接种到直径为90mm的PDA固体培养基平皿中，共接种3个，作为实验组；将同一批培养洗脱的未冻干的分生孢子，以同样的方法接种另外3个培养基，作为对照组。然后放于25℃恒温培养箱中，每天定时观察并记录各组孢子的平均萌发个数，计算萌发率。结果见表2。
表2冻干组与未冻干组孢子萌发率的比较
Figure BDA0002763313130000081
试验结果表明，本冻干孢子粉具有很好的萌发率。
实施例4紫外保护剂筛选
可湿性粉剂常用紫外保护剂有3种，脱脂乳、抗坏血酸钠、荧光素钠。从中选出最适的紫外保护剂并选出最适的紫外保护剂浓度。
实验过程为：试验共设3个实验组和一个对照组(每组内有3个重复)。实验组可湿性粉剂的配方都为菌粉20份、湿润剂1份、分散剂3份、紫外保护剂5份、硅藻土71份。对照组可湿性粉剂中的紫外保护剂由硅藻土代替。再将可湿性粉剂中孢子稀释成100个/10微升。涂布到PDA固体培养基中，并暴露在紫外灯下照射20S、40S、60S。(离紫外灯的距离相同)放置到25℃恒温培养箱中培养3d。观察孢子萌发数。从而选出最适的紫外保护剂。
结果见表3。
表3三种常见紫外保护剂对厚垣普可尼亚菌的保护效果
Figure BDA0002763313130000091
通过本实施例的试验比较，确定最优的紫外保护剂为荧光素钠。
实施例5
一种杀动物外寄生虫真菌可湿性粉剂，与实施例4的区别在于，紫外保护剂荧光素钠的重量计数为4份。
实施例6
一种杀动物外寄生虫真菌可湿性粉剂，与实施例4的区别在于，紫外保护剂荧光素钠的重量计数为3份。
实施例7
一种杀动物外寄生虫真菌可湿性粉剂，与实施例4的区别在于，紫外保护剂荧光素钠的重量计数为2份。
实施例8
一种杀动物外寄生虫真菌可湿性粉剂，与实施例4的区别在于，紫外保护剂荧光素钠的重量计数为1份。
实施例4-8的杀动物外寄生虫的真菌可湿性粉剂中的厚垣普可尼亚菌菌粉为实施例2的冻干菌粉。
进一步比较实施例4-8的真菌可湿性粉剂在紫外光照射后的萌发数，优选紫外保护剂用量为3份。
实施例9湿润剂在可湿性粉剂中所占比例的优化
本次优化是以可湿性粉剂国标(GB/T5451-2001可湿性粉剂湿润性测定方法)为标准。测定了厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂的湿润时间。
实验过程如下：国标GB/T5451-2001中列举了三种标准硬水的配置方法，本次实验使用了制备方法二。配制标准硬水(简称标硬)：取无水CaCl2 0.304g和带结晶水的MgCl20.139g，于1000mL烧杯中，加600mL水溶解后，倒入1000mL容量瓶中，用300mL水分次冲洗烧杯，冲洗液一并倒入容量瓶中，用水将容量瓶定容，摇匀。
取标硬100mL±1mL，注入250mL烧杯中，将此杯置于25℃±1℃的恒温水浴锅中，使其液面与水浴的水平面平齐，待标硬至25℃±1℃时，称取5g±0.1g的试样(实施例2的冻干菌粉20份、湿润剂SDS 1-5份、分散剂3份、紫外保护剂3份、硅藻土补足至100份。选择有代表性的均匀粉末，而且不允许成团、结块)，置于表面皿上，将全部试样从与烧杯口齐平的位置一次性均匀地倾倒在该烧杯的液面上，但不要过分的扰动液面。加试样时立即用秒表计时，直至试样全部润湿为止(留在液面上的细粉末可忽略不计)。记下湿润时间(精确至秒)。重复5次，取平均值。作为该样品的湿润时间。结果见表4。
表4：湿润时间比较
Figure BDA0002763313130000101
通过本实施例的试验，优选湿润剂SDS的比例为3％。
实施例10分散剂在可湿性粉剂中所占比例的优化
本次优化是以可湿性粉剂国标(GB/T14825-2006悬浮率测定方法)为标准。测定了厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂的悬浮率。
实验过程如下：配制标准硬水，取无水CaCl2 0.304g和带结晶水的MgCl2 0.139g，于1000mL烧杯中，加600mL水溶解后，倒入1000mL容量瓶中，用300mL水分次冲洗烧杯，冲洗液一并倒入容量瓶中，用水将容量瓶定容，摇匀。
用标准硬水将待测试样(实施例2的冻干菌粉20份、湿润剂SDS 3份、分散剂亚甲基二萘磺酸二钠1-5份、紫外保护剂荧光素钠3份、硅藻土补足至100份)配置成适当浓度的悬浮液。在规定的条件下，于量筒中静置一定时间，测定底部十分之一悬浮液中有效成分所占比例，计算其悬浮率。
结果见表5。
表5厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂分散剂比例对悬浮率影响
Figure BDA0002763313130000111
通过本实施例的试验，优选分散剂亚甲基二萘磺酸二钠的比例为3％。
实施例11厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂细度及pH的测定
结合之前的实验，确定厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂的重量计数为冻干菌粉20份、分散剂1份、紫外保护剂3份、湿润剂3份，再由73份粉状载体补足至100份。参考GB/T1601-1993可湿性粉剂值测定方法及GB/T16150-1995可湿性粉剂细度测定方法，完成pH及细度的测定。
结果见表6、表7。
表6厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂pH值的测定
Figure BDA0002763313130000112
表7厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂细度的测定
Figure BDA0002763313130000113
实施例12
一种杀动物外寄生虫的真菌可湿性粉剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)液固双相发酵大批量生产厚垣普可尼亚菌分生孢子悬液，并稀释成合适浓度；
(2)分生孢子悬液与冻干保护剂按合适比例混合，冻干24h制备冻干菌粉(同实施例2操作)；
(3)按重量份配比，将冻干菌粉、基础组方和粉状载体按20:7:73的比例混合均匀，其中基础组方中分散剂亚甲基二萘磺酸二钠、湿润剂SDS和紫外保护剂荧光素钠的比例为1:3:3，最终得到厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂。
厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂的照片参见图2，为淡绿色粉状制剂。
对比例1
一种杀动物外寄生虫的真菌可湿性粉剂冻干菌粉的制备，与实施例1的区别在于，所用固体发酵培养基变为大米。第4周产孢量平均为5.7×107个/g，低于用玉米粒培养基得到的菌数。
对比例2
一种杀动物外寄生虫的真菌可湿性粉剂冻干菌粉的制备，与实施例1的区别在于，所用固体发酵培养基变为小麦。第4周产孢量平均为3.7×107个/g，低于用玉米粒培养基得到的活菌数。
对比例3
一种杀动物外寄生虫的真菌可湿性粉剂冻干菌粉的制备，与实施例1的区别在于，所用固体发酵培养基变为燕麦。第4周产孢量平均为0.5×107个/g，低于用玉米粒培养基得到的活菌数。
对比例4
一种杀动物外寄生虫的真菌可湿性粉剂冻干菌粉的制备，与实施例1的区别在于，所用固体发酵培养基变为麸皮。第4周产孢量平均为0.08×107个/g，低于用玉米粒培养基得到的活菌数。
对比例5
一种杀动物外寄生虫的真菌可湿性粉剂冻干菌粉的制备，与实施例1的区别在于，所用液体培养基变为玉米粉液体培养基。液体发酵阶段所得活菌数平均为1.3×106个/mL。低于SDY培养基活菌数。
对比例6
一种杀动物外寄生虫的真菌可湿性粉剂冻干菌粉的制备，与实施例1的区别在于，所用液体培养基变为马铃薯葡萄糖液体培养基。液体发酵阶段所得活菌数平均为2.7×106个/mL。低于SDY培养基活菌数。
对比例7
一种杀动物外寄生虫的真菌可湿性粉剂冻干菌粉的制备，与实施例1的区别在于，所用液体培养基变为沙式葡萄糖液体培养基。液体发酵阶段所得活菌数平均为2.6×106个/mL。低于SDY培养基活菌数。
对比例8
一种杀动物外寄生虫的真菌可湿性粉剂冻干菌粉的制备，与实施例1的区别在于，所用液体培养基变为枸橼酸液体培养基。液体发酵阶段所得活菌数平均为0.9×106个/mL。低于SDY培养基活菌数。
对比例9
一种杀动物外寄生虫的真菌可湿性粉剂冻干菌粉的制备，与实施例1的区别在于，所用液体培养基变为大豆蛋白胨液体培养基。液体发酵阶段所得活菌数平均为1.1×106个/mL。低于SDY培养基活菌数。
对比例10
一种杀动物外寄生虫的真菌可湿性粉剂冻干菌粉的制备，与实施例1的区别在于，所用液体培养条件变为25℃、220r/min培养14d。所得产物活菌数并不显著多于实施例2培养条件。
实验例1厚垣普可尼亚菌分生孢子悬液最适杀虫浓度的确定
实验组：厚垣普可尼亚菌分生孢子4种浓度悬浮液对麻点璃眼蜱的杀灭作用。
对照组：等量无菌生理盐水组。
实验方法：以麻点璃眼蜱为实验对象，配制4种浓度的厚垣普可尼亚菌分生孢子悬液(107、106、105、104)和空白对照组。将麻点璃眼蜱分别放入到不同浓度的分生孢子悬液及生理盐水中停留5S。将接触过待试液体的麻点璃眼蜱放入培养皿中(每组10个重复)，重复三次，放入25℃恒温培养箱中培养7d。每天观察虫体死亡率。结果见表8。
表8 4种不同浓度分生孢子悬液对麻点璃眼蜱的杀灭作用
Figure BDA0002763313130000141
实验例2厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂最适杀虫浓度的确定
厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂的配制：结合实施例1-12的描述，配制出有代表性、组方比例合适的可湿性粉剂。
以麻点璃眼蜱为实验对象，配制4种浓度的厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂：活菌数107、106、105、104(同实施例2，其中步骤(3)用灭菌生理盐水稀释为低浓度)；对照组(去除有效成分的可湿性粉剂)。将麻点璃眼蜱分别放入到不同待试液体中停留5S。将接触过待试液体的麻点璃眼蜱放入培养皿中(每组10个重复)，重复试验三次，放入25℃恒温培养箱中培养7d。每天观察虫体死亡率。实验结果见表9和图3。
表9 4种浓度厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂对麻点璃眼蜱的杀灭作用
Figure BDA0002763313130000151
试验结果表明，在可湿性粉剂的厚垣普可尼亚菌中活菌数为1×106～1×107个/g范围内，可实现对蜱虫70％以上的杀灭。
虽然，以上通过实施例对本发明进行了说明，但本领域技术人员应了解，在不偏离本发明精神和实质的前提下，对本发明所做的改进、替换和变型，均应属于本发明的保护范围内。

Claims (11)

1.一种厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂，其特征在于，包括重量份数的以下组分：有效成分15～25份，基础组方3～15份，粉状载体65～87份；
所述有效成分为厚垣普可尼亚菌冻干菌粉，所述的厚垣普可尼亚菌的保藏号为CGMCCNo.19635；
所述基础组方包括分散剂、湿润剂和紫外保护剂。
2.根据权利要求1所述的厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂，其特征在于，所述厚垣普可尼亚菌冻干菌粉中活菌数为5×106～7×107个/g；冻干菌粉中的冻干保护剂为脱脂奶粉。
3.根据权利要求1所述的厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂，其特征在于，所述厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂的细度为98％过200目筛。
4.根据权利要求1所述的厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂，其特征在于，所述分散剂为亚甲基二萘磺酸二钠，湿润剂为SDS，紫外保护剂为荧光素钠、脱脂乳、抗环血酸钠、荧光素钠中的一种或多种。
5.根据权利要求1所述的厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂，其特征在于，所述分散剂、湿润剂和紫外保护剂的质量比例为1：(2～4)：(2～4)；和/或
所述紫外保护剂为荧光素钠。
6.根据权利要求1～5任一项所述的厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂，其特征在于，所述厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂，包括重量份数的以下组分：有效成分18～22份，基础组方3～10份，粉状载体70～80份；和/或
所述粉状载体为硅藻土。
7.权利要求1～6任一项所述的厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(a)液固双相发酵生产厚垣普可尼亚菌分生孢子悬液；
(b)将分生孢子悬液与冻干保护剂混合，冻干20～30h制备为冻干菌粉；
(c)按重量份配比，将冻干菌粉、基础组方和粉状载体混合均匀，得到厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(a)包括操作:
将厚垣普可尼亚菌菌株，接种于PDA固体培养基上，于22～28℃温度下培养；
将长满菌丝的PDA固体培养基上的孢子冲洗下来，加入到SDY液体培养基中，在25～30℃条件下培养6～9天，然后收集菌液；
将所述菌液按20mL：80～150g玉米粒的比例倒入玉米粒培养基中，在22～18℃条件下培养；
在孢子培养至第4周时，用孢子洗脱液将孢子洗脱下来，用灭菌生理盐水稀释成(0.1～2.0)×107个/mL的分生孢子悬液。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述玉米粒培养基通过以下方法制得：取80～150g玉米粒放入菌种袋中，加入80～150mL水，浸泡20～30h，高温高压灭菌。
10.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(b)包括操作:配置冻干保护剂8～15％的溶液，与所述分生孢子悬液按1：(0.5～2)体积比混合，在-70～-85℃低温中预冻2～5h，再将温度降至-45～-55℃，真空冷冻干燥18～24h。
11.权利要求1～6任一项所述的厚垣普可尼亚菌可湿性粉剂在触杀动物外寄生虫中的应用，其特征在于，所述动物外寄生虫为麻点璃眼蜱。
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