CN111172064B - 一株侧孢芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一株侧孢芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物发酵工程技术领域，具体涉及一株侧孢芽孢杆菌及其应用专利申请。侧孢芽孢杆菌YSC5，于2019年12月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物心，保藏编号为CGMCC 19086。本申请中，发明人在现有出发菌株侧孢芽孢杆菌YSC3菌株基础上，通过紫外诱变和N+离子注入诱变技术的组合应用及定性筛选育种，最终获得了一株具有较好生长活力的侧孢芽孢杆菌（Bacillus laterosporus）YSC5菌株。初步实验结果表明，YSC5菌株最高发酵活力可达190亿/mL以上，表现出较好生长效果，可为侧孢芽孢杆菌微生物制剂产品的制备奠定良好的技术基础。

Description

一株侧孢芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明属于生物发酵工程技术领域，具体涉及一株侧孢芽孢杆菌及其应用专利申请。
背景技术
芽孢杆菌的芽孢因其良好的耐温性、耐贮藏等特性，是微生态制剂中的常用菌种，已广泛应用于水产养殖、农业、医药卫生等行业。
常用的芽孢杆菌微生物制剂菌种主要有：侧孢芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、纳豆芽孢杆菌等。其中侧孢芽孢杆菌因其具有解磷、解钾、固氮等多种生物学功能，并且具有产生杀虫蛋白、抑菌等功能，因此受到了一定重视。
基于侧孢芽孢杆菌的多样性功能，现有技术中，利用该菌开发制备了多种侧孢芽孢杆菌制剂，并且在医疗保健物、生物防控、环境保护等领域表现出一定技术效果。但受限于现有侧孢芽孢杆菌发酵产量偏低等技术问题，实际的以侧孢芽孢杆菌为主的微生物制剂产品类型仍然较为有限，进而限制了此类微生物制剂产品在实际生产中的推广应用，因而极有必要筛选具有更好生长效果的侧孢芽孢杆菌菌株以及对该菌株的发酵工艺进行进一步优化，从而为相关微生物制剂产品的生产应用奠定技术基础。
发明内容
基于现有侧孢芽孢杆菌，通过对其诱变、筛选，本申请目的在于提供一株具有更好生长活力的侧孢芽孢杆菌菌株，从而为相关微生物制剂产品的生产、制备奠定一定技术基础。
本申请所采取的技术方案详述如下。
一株侧孢芽孢杆菌，其名称为：侧孢芽孢杆菌（Bacillus laterosporus）YSC5，该菌株已于 2019 年 12 月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为 CGMCC19086；
该菌株是通过对原始出发菌株侧孢芽孢杆菌YSC3进行多次紫外诱变和N+离子注入诱变育种选育获得的。
利用所述侧孢芽孢杆菌所制备发酵产物，通过如下步骤制备获得：
（1）菌株活化和制备种子液
将所保存的侧孢芽孢杆菌YSC5菌株在LB平板培养基中，37℃活化培养24~48h后，搜集菌苔转接于LB液体培养基中进一步扩增后，转接于种子罐的种子培养基中，37℃、180-300rpm发酵 12~18h左右作为种子液；
所述种子培养基为：葡萄糖2%，玉米粉5%，豆饼粉5%，磷酸二氢钾0.2%，氯化锰0.01%，pH7.0；
（2）制备发酵液
按照5%体积比接种量，将步骤（1）中所制备种子液转接于发酵培养基中，在发酵罐内，30~38℃、180-200rpm发酵至24~36h制备发酵液（一般37℃、180-200rpm发酵至 24h 左右至芽孢形成率在80%以上，同时发酵液的pH明显升高时即放罐）；
为便于后续制备微生物制剂成品，可将发酵醪液进一步转入乳化罐中，采用离心式喷雾干燥塔进行喷雾干燥处理（具体喷雾干燥处理参数可参考为：进风温度控制在150-170℃，排风温度控制在60-65℃，负压100-300pa），进一步制备成粉末状原粉，并与其他辅料或有效成分复配后作为侧孢芽孢杆菌成品制剂；
所述发酵培养基，为液态，以质量比计，具体成分包括：葡萄糖0.5~2%，玉米粉 4~6%，豆饼粉5~8%，磷酸二氢钾0.1~0.5%，氯化锰0.01~0.03%，pH 6.4~7.3。
所述侧孢芽孢杆菌或者利用所述侧孢芽孢杆菌所制备发酵产物在作物栽培中应用，作为有益微生物菌肥应用，可明显改善作物表型或者促进产量提高，具体例如用于小白菜。
本申请中，发明人在现有出发菌株侧孢芽孢杆菌YSC3菌株（早期由发明人从工厂附近农田土壤中分离筛选获得，该菌株菌落呈圆形，微隆起，边缘整齐，表面光滑、湿润、色暗）基础上，通过紫外诱变和N+离子注入诱变技术的组合应用及定性筛选育种，最终获得了一株具有较好生长活力的侧孢芽孢杆菌（Bacillus laterosporus）YSC5菌株。初步实验结果表明，YSC5菌株最高发酵活力可达190亿/mL以上，表现出较好生长效果，可为侧孢芽孢杆菌微生物制剂产品的制备奠定良好的技术基础。
附图说明
图1为侧孢芽孢杆菌发酵生长曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中所涉及部分实验背景情况简要说明如下。
培养基：
营养琼脂培养基（Nutrient Agar.NA）：蛋白胨10.00 g，牛肉提取物3.00 g，氯化钠5.00 g，琼脂15.0 0g，蒸馏水1.00 L，pH 7.0；
牛肉浸汁培养基（Bee4.3 extract Agar）：取去脂肪的瘦肉500.00 g，切碎，于烧杯中加蒸馏水1.00 L，置4 ℃冰箱中过夜，用棉花过滤，将滤液于水浴中煮沸1 h，使蛋白质凝固，过滤，在滤液中加入10.00 g蛋白胨和5.00 g氯化钠，调pH 7.4，并将液体补足1.00L，琼脂15.00 g，分装后灭菌，备用；
侧孢芽孢杆菌活力测定方法
采用稀释倒平板法，按10倍稀释法制成不同浓度稀释液，从稀释液中分别吸取一定体积置于无菌培养皿中，每一稀释度做3次重复；
随后将事先融化并冷却至50℃左右的营养琼脂培养基，向每个培养皿中倒入约12mL，摇匀，待凝固后，倒置培养24 h，进行菌落计数；
对培养后的每个稀释度取5～10个菌落的菌体，涂片染色，进行显微镜识别；
选择适宜的稀释度、菌落在30～300个之间的平板进行计数；
结果计算方法：
Figure 813253DEST_PATH_IMAGE001
。
实施例1
本实施例就本申请所提供的侧孢芽孢杆菌YSC5菌株诱变筛选获得过程简要介绍如下。
本申请所提供的侧孢芽孢杆菌YSC5主要是通过对现有出发菌株侧孢芽孢杆菌YSC3的紫外线诱变和N+离子注入诱变筛选获得的，具体诱变、筛选过程简要说明如下。
（1）紫外线诱变
首先是对出发菌株侧孢芽孢杆菌YSC3进行紫外线诱变育种，其主要过程为：
取活化培养后生长至对数生长期的YSC3菌悬液4ml，采用15 W紫外线灯在28 cm距离处照射，照射过程中，随着紫外线照射时间的延长，菌株存活率逐渐降低。辐射诱变过程中，以辐照40s时长作为紫外线诱变剂量（测定结果表明，当照射时间超过40s时，存活率低于10 %，因此选择此时长作为最佳时长）。
经过多轮辐照、初筛、复筛等诱变筛选后，获得一株具有较高活力突变菌株，将其命名为YSC3-243。测定结果表明，其发酵活力106 亿/mL。
（2）N+离子注入诱变
以紫外诱变获得的YSC3-243菌株作为N+离子注入诱变的出发菌株，具体诱变、筛选过程为：
对活化后的出发菌株YSC3-243进行N+离子注入诱变处理，具体参数为：
注入离子能量为30 kev，单次脉冲时间为6s，间隔时间为60s，真空度为5～6×10-3Kpa；
将处理的菌液经稀释后接种在培养基上，37℃培养2天；
最终筛选确定5株菌落形态好、生长速度快的新菌株，分别命名为：YSC4-121、YSC4-186、YSC4-195、YSC4-258、YSC4-291。
对这5株菌株的生长性能（即生长活力作为主要指标）进行评价，具体过程为：
将选出的 5 株菌进行摇瓶发酵培养48h，培养基配方为：葡萄糖2%，玉米粉 5%，豆饼粉7%，磷酸二氢钾0.1%，氯化锰0.01%，pH7.0；培养结束后测发酵液中侧孢芽孢杆菌的活力，具体培养结果如下表所示。
表1，5株侧孢芽孢杆菌摇瓶实验结果
Figure 877024DEST_PATH_IMAGE002
。
进一步进行初筛、复筛、并连续转接10代，以对菌株生长活力进行评价。
其中YSC4-195菌株连续传代10次的菌株活力结果如下表2所示。
表2，侧孢芽孢杆菌YSC4-195菌株生长活力稳定性评价
Figure 810345DEST_PATH_IMAGE003
。
结果表明，YSC4-195菌株的生长活力较为稳定，发酵48h后，菌体数量稳定在190亿/mL左右（原始出发菌株侧孢芽孢杆菌YSC3，相同条件下发酵活力仅有78亿/mL左右），因此，发明人对该菌株进行了生物保藏，并将该菌株重新命名为：侧孢芽孢杆菌（Bacillus laterosporus）YSC5，该菌株已于 2019 年 12 月5 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为 CGMCC 19086。
该菌株的部分表型特征如下：在营养肉汤琼脂培养基上，48h菌落呈圆形，微隆起，边缘整齐，表面光滑、湿润、色暗；镜检菌形杆状、革兰氏染色阳性、芽孢侧生、椭圆形、孢囊膨大。
实施例2
在实施例1筛选所得菌株基础上，发明人对其所适配发酵工艺进行了进一步优化，以进一步提高该菌株的生长发酵能力。具体过程简介如下。
（1）菌株活化和制备种子液
将所保存的侧孢芽孢杆菌YSC5菌株在LB平板培养基中，37℃活化培养2d后，搜集菌苔转接于LB液体培养基中进一步扩增后，转接于种子罐的种子培养基中，37℃、200rpm发酵 18h左右作为种子液；
所述种子培养基为：葡萄糖2%，玉米粉5%，豆饼粉5%，磷酸二氢钾0.2%，氯化锰0.01%，pH7.0；
（2）制备发酵液
按照5%体积比接种量，将步骤（1）中所制备种子液转接于发酵培养基中，在发酵罐内，37℃、180rpm发酵至芽孢形成率在80%以上（同时发酵液的pH会明显升高）时放罐，即为发酵液；
所述发酵培养基，为液态，以质量比计，具体成分包括：葡萄糖1.5%，玉米粉6%，豆饼粉7%，磷酸二氢钾0.2%，氯化锰0.02%，pH7.0。
对5批次发酵生产试验结果统计列表如下表3所示。
表3，侧孢芽孢杆菌YSC5在20m3发酵罐5批次发酵生产实验结果
Figure 137946DEST_PATH_IMAGE004
。
从上表结果可以看出，发酵活力较为稳定，平均发酵活力稳定在190亿/mL以上。
进一步地，在某批次发酵过程中，每隔 4h 取一次发酵液，在600nm条件下测定吸光度即OD值，绘出 OD 值的变化曲线如图 1所示。可以看出，该菌株生长迅速，发酵周期缩短至 24h 左右。
（3）制备侧孢芽孢杆菌产品
在上述实验基础上，参考上述操作，发明人以37℃、180rpm发酵24h发酵液为例，采用离心式喷雾干燥塔进行了喷雾干燥处理，以进一步制备成粉末状原粉，喷雾干燥处理参数为：进风温度控制在160℃，排风温度控制在65℃，负压200pa。
作为对照，采用相同发酵工艺，发明人以原始出发菌株侧孢芽孢杆菌YSC3为例，同样制备了粉末状原粉。
制备过程中，发明人对不同批次所制备最终产品的综合收率进行了测定，结果如下表4、表5所示。
表4，侧孢芽孢杆菌菌株YSC3在20m3发酵罐发酵及收率情况表
Figure 928047DEST_PATH_IMAGE005
表5，侧孢芽孢杆菌菌株YSC5在20m3发酵罐发酵及收率情况表
Figure 416797DEST_PATH_IMAGE006
表中，收率计算公式为：
Figure 560334DEST_PATH_IMAGE007
。
从上表结果可以看出，原始出发菌株YSC3综合收率为82.3%，而本申请诱变筛选后YSC5菌株综合收率可达95%，即，较好的生长发酵活力确保了较高收率，可为侧孢芽孢杆菌微生物制剂产品的制备奠定良好的技术基础。
实施例3
在实施例2基础上，以小白菜为例，发明人进一步将所制备粉末状原粉作为微生物肥料进行了大田实验，具体情况简要介绍如下。
实验时间及地点：
试验于2019年8月安排在三门峡市湖滨区交口乡交口村的大田内；
供试土壤为褐土，土壤肥力中等，耕层土壤基础养分含量为：有机质13.25g/kg，全氮0.91g/kg，速效磷（P2O5）16.4mg/kg，速效钾（K2O）116.7mg/kg；
供试作物为小白菜；
供试“侧孢芽孢杆菌制剂”（干燥后原粉加滑石粉稀释调整有效活菌数200亿/g左右），
实验设计：
本试验设四个处理，随机区组排列，重复三次，每个实验小区面积30m2；
处理1：常规施肥+亩用供试肥料1kg拌40kg有机肥底施（供试肥料为有效活菌数200亿/g的“侧孢芽孢杆菌制剂”，用量1Kg每亩；有机肥为牛粪，下同）；
处理2：常规施肥+亩用供试肥料基质1kg拌40kg有机肥底施（供试肥料基质为将“侧孢芽孢杆菌制剂”灭活后产品，用量1Kg每亩）；
处理3：常规施肥+亩用1kg细沙拌40kg有机肥底施；
处理4：常规施肥；
常规施肥为：亩底施复合肥（氮磷钾=20-15-5）40kg；
实验过程：
按试验方案，8月初整地前将供试肥料、基质、细沙及有机肥施入各处理地块，随后播种、间苗、定苗，密度约7万株/亩；
10月上旬一次性收获并同时进行田间调查与考种。收获时分小区单收单称记载实际产量。试验除按方案要求施肥外，其它管理措施同一般菜田生产。
实验结果：
（1）底施“侧孢芽孢杆菌制剂”对小白菜生物学性状的影响
部分生物学性状统计结果如下表所示：
表6 田间调查与考种统计表
Figure 880457DEST_PATH_IMAGE008
（注：表中数据为四个处理三次重复的平均数）
从上表统计结果可以看出：处理1与处理2、处理3、处理4相比，株高分别增加1.8cm、2.6 cm、2.7cm，单株叶片数增加0.8片、1.2片、1.3片，单株重增加1.3g、1.8、1.9g，这说明在常规施肥的基础上，小白菜底施“侧孢芽孢杆菌制剂”能明显改善株高、单株叶片数和单株重等生物学表型特性。
（2）底施“侧孢芽孢杆菌制剂”对小白菜产量的影响
具体产量结果统计如下表7所示。
表7，产量结果统计表
Figure 966093DEST_PATH_IMAGE009
。
进一步对上表数据进行方差分析和汇总如下表8、表9所示：
表8 方差分析表
Figure 942140DEST_PATH_IMAGE010
表9 多重比较表
Figure 14001DEST_PATH_IMAGE011
。
由表7可看出：处理1较处理2平均亩增产252.0kg，增产率为7.4%；处理2与处理3相比，平均亩增产82.3kg，增产率为2.5%；处理3与处理4相比平均亩增产17.8 kg，增产率为0.5%。对各处理产量结果进行方差分析（见表8），处理间产量差异达极显著水平。采用PLSD法进行多重比较（见表9），处理1与处理2、处理3、处理4之间产量差异均达极显著水平，处理2与处理3、处理4之间产量差异不显著，处理3与处理4之间产量差异不显著。
综合上述结果可以看出：在当地常规施肥的基础上，亩用供试侧孢芽孢杆菌肥料1kg拌40kg有机肥底施与亩底施等量基质相比，可明显增加小白菜的株高、单株叶片数和单株重，平均亩增产252.0kg，增产率为7.4%，产量差异达极显著水平。
当然，还需说明的是，该微生物菌株的发酵产品也适用于辣椒、黄瓜、白菜、西瓜等蔬菜类作物和小麦、玉米、水稻等大田作物，并且部分作物的初步实验结果也表现出较好的改善生物表型和提高产量预期效果。
总之，将本申请所提功能性菌剂制备，按1kg/亩用量与肥料混合后底施施用，或者单独作为生物菌肥按每亩25-30g使用量冲施、喷施等应用时，均能具备一定应用效果。

Claims (5)

1.一株侧孢芽孢杆菌，其特征在于，其名称为：侧孢芽孢杆菌（Bacillus laterosporus）YSC5，该菌株已于 2019 年 12 月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为 CGMCC 19086。
2.利用权利要求1所述侧孢芽孢杆菌所制备发酵产物，其特征在于，通过如下步骤制备获得：
（1）菌株活化和制备种子液
所保存的侧孢芽孢杆菌YSC5菌株活化培养后，制备种子液；
（2）制备发酵液
按照5%体积比接种量，将步骤（1）中所制备种子液转接于发酵培养基中，30~38℃、180-200rpm发酵至24~36h制备发酵液；
所述发酵培养基，为液态，pH 6.4~7.3，以质量百分比计，具体成分包括：葡萄糖0.5~2%，玉米粉 4~6%，豆饼粉5~8%，磷酸二氢钾0.1~0.5%，氯化锰0.01~0.03%。
3.如权利要求2所述利用侧孢芽孢杆菌所制备发酵产物，其特征在于，进一步将步骤（2）所制备发酵液采用离心式喷雾干燥塔进行喷雾干燥处理，具体喷雾干燥处理参数为：进风温度控制在150-170℃，排风温度控制在60-65℃，负压100-300pa。
4.权利要求1所述侧孢芽孢杆菌在作物栽培中应用，其特征在于，将其制备成有益微生物菌肥，用于小白菜的栽培。
5.权利要求2~3任一项所述侧孢芽孢杆菌发酵产物在作物栽培中应用，其特征在于，用于小白菜的栽培。
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