CN105505836A - 一株枯草芽孢杆菌、防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂的制备方法及其使用方法 - Google Patents

一株枯草芽孢杆菌、防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂的制备方法及其使用方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株枯草芽孢杆菌、防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂的制备方法及其使用方法，属于农业和生物技术领域。本发明的菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus？subtilis)PB12保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2015年03月11日，保藏编号为CGMCC？No.10603。本发明的拌种剂利用成膜剂和菌株制成。本发明的颗粒剂是有复合基质和菌株制成。本发明使用方法：对播种前的种块拌种处理，或者拌种和播种时将枯草芽孢杆菌微生物颗粒剂作为底肥随种块下地；以及出苗后灌根处理。本发明用于防治马铃薯疮痂病。

Description

一株枯草芽孢杆菌、防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂的制备方法及其使用方法
技术领域
本发明属于农业和生物技术领域，具体涉及防治马铃薯疮痂病的菌株，以及微生物菌剂的制备方法及微生物菌剂的使用方法。
背景技术
近年来，随着马铃薯种植面积的不断扩大，马铃薯疮痂病发生和危害程度也逐年加重。连年种植条件下，土传病菌得已存活、繁殖、侵染、危害。马铃薯疮痂病是土传病害危害最重的一种病害，在采用多种化学药剂防治的基础上，近年有发病严重的趋势。疮痂病发生后，病斑虽然仅限于皮层，但病薯不耐贮藏，外观难看，对马铃薯的品质影响很大，造成商品价值下降，经济损失严重，一般可减产10％～30％，部分地块甚至减产40％以上。由于其具有随水及其它方式传染的特征，防治不当或不及时将会造成更大的灾难性损失。
马铃薯疮痂病为细菌性病害，病原菌是链霉菌，在适宜土壤中可永久存活。病菌侵入植株后，地上部分看不到症状，但薯块表面会出现疮痂。土壤干燥、通气性好、中性或碱性的地块易发病，发病后病菌能在土中长期残存。田间主要侵染薯块，块茎表面先产生褐色小点，扩大后形成褐色至棕褐色、圆形或不规则形的大斑块。病斑表面细胞大量木栓化，表现为粗糙的锈色疮痂状。后期病斑或呈裂出状、高出叶表面1～2mm的凸起疮痂，或呈内延和下陷、深入1～7mm的凹陷疮痂。凹陷病斑多为暗褐或近黑色，病斑处组织似稻草黄褐色且略显半透明状。总体上，病斑限于皮层而不殃及皮下的薯肉，有别于粉痂病。
土壤自身带菌和种薯带菌传入土壤，继而繁殖。在防治得当的情况下当年当季不会形成危害；在防治不当的情况下，当年当季就会形成危害。马铃薯收获后，通过病残体及土壤存活，有的细菌通过不断繁殖存活长达十年难以根除。
细菌在PH值为6-7时是存活繁殖最好的环境，而马铃薯适宜高产的PH值为5.5-7.0。因为使用化肥追求高产，连年种植条件下土壤碱性增大，有利于细菌繁殖，同时也使得与之有拮抗关系的有益菌减少。
发明内容
本发明要解决现有枯草芽孢杆菌防治马铃薯疮痂病存在的菌剂以土壤灌溉的形式使用而带来的不仅用量大且耗费人工的技术问题；而提供了一株枯草芽孢杆菌、防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂的制备方法及其使用方法。
本发明中枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)PB12，由呼兰区白奎镇庆平屯马铃薯田间感病区域的土壤中分离得到，对马铃薯土传病菌具有较强的拮抗作用。保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2015年3月11日，保藏编号为CGMCCNo.10603。
本发明枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)PB12革兰氏染色阳性，杆状，两端钝平，多数菌体串联成串，呈不规则形状。产芽孢，30℃培养24h芽孢形成率达80％以上，芽孢端生，椭圆形，不膨大，培养至48h，芽孢全部脱落。在NYDA固体培养基上的菌落呈乳白色，褶皱，边缘不整齐，菌落中心凸起呈脊状，易挑起。
本发明枯草芽孢杆菌PB12在50℃可以生长，pH5.7可以生长，7％NaCl可以生长，厌氧条件下不生长。发酵葡萄糖产酸不产气，接触酶反应阳性，淀粉水解呈阳性，VP试验呈阳性，利用柠檬酸盐反应呈阳性，明胶液化反应呈阳性，石蕊牛奶还原胨化反应呈阳性，硝酸盐反应呈阳性，甲基红反应呈阳性。
本发明枯草芽孢杆菌PB12可在NYD培养基上生长，最适生长温度为30℃，最适pH为7.2～7.5，转速150r/min。NYD培养基由牛肉浸膏8g、酵母膏5g、葡萄糖10g、琼脂15g和蒸馏水1000mL组成。
本发明中枯草芽孢杆菌PB12由呼兰区白奎镇庆平屯马铃薯田间感病区域的土壤中分离得到。分离方法按以下步骤进行：一、以马铃薯疮痂病菌为靶标，取马铃薯田间感病区域土壤10克，放于100mL带玻璃珠和无菌水的三角瓶中，震摇20分钟，使土样和水充分混合，将细胞分散。二、利用梯度稀释法稀释至103、104、105三个梯度，将该批次的浓缩液进行梯度稀释涂布于NYDA培养基上，置于32℃培养箱内培养18h，挑选不同菌落形态的菌株进行标号并分离培养；分离出的单个菌落接入装有NYD培养基(5mL)的试管中，于32℃，150r/min培养18h。选择拮抗作用强、抑菌谱广的生防菌株进行纯化、保存。即为本实施方式的枯草芽孢杆菌PB12。
本发明中防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂由两种，一种是拌种剂，另外一种是颗粒剂。
本发明中防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂拌种剂的制备方法是按下述步骤进行的：
步骤一、挑取如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)PB12单菌落接入5mlNYD液体试管中，过夜培养后，再以1％的接种量接种于含100mlNYD培养基的三角瓶中，于35℃，150r/min振荡器中培养24h，获得菌悬液(活菌数为1.5×109cfu/mL)；
步骤二、称取67g成膜剂用加热至80℃的500g蒸馏水边搅拌边溶解，充分溶解后再加入500g蒸馏水，而后加入步骤一获得的菌悬液使活菌浓度为5亿//mL；即得到拌种剂。
步骤二中所述成膜剂是聚乙烯醇、黄原胶与水配制的溶液；聚乙烯醇的质量百分比含量是8％～12％，黄原胶的质量百分比含量是0.1％～0.3％。
本发明中防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂颗粒剂的制备方法是按下述步骤进行的：
步骤(1)、挑取如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)PB12单菌落接入5mlNYD液体试管中，过夜培养后，再以1％的接种量接种于含100mlNYD培养基的三角瓶中，于35℃，150/min振荡器中培养24h，获得菌悬液(活菌数为1.5×109cfu/mL)；
步骤(2)、然后喷加步骤(1)获得的菌悬液至复合基质中，经圆盘造粒获得防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂颗粒剂，颗粒剂的活菌数≧3～5亿//克，复合基质中含有腐植酸。
步骤(2)所述的复合基质按重量百分比是由90％褐煤、5％腐植酸和5％羧甲基纤维素制成的。所述褐煤的粒径1.5～4.75mm。
本发明防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂的使用方法是由下述步骤完成的：种薯切块播种，播种时将上述方法制备的防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂颗粒剂按4公斤/亩用量与化肥一同施入土壤中。
本发明防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂的使用方法还可由下述步骤完成的：将种薯切块用上述方法制备的拌种剂拌种，拌种剂与种薯的质量比是1:50，阴干后播种，播种时将上述方法制备的防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂颗粒剂按4公斤/亩用量与化肥一同施入土壤中。
本发明防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂的使用方法还可由下述步骤完成的：将种薯切块用上述方法制备的拌种剂拌种，拌种剂与种薯的质量比是1:50，阴干后播种，播种时将上述方法制备的防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂颗粒剂按4公斤/亩用量与化肥一同施入土壤中，待出苗后15天用PB12菌液(4×107cfu/ml)灌根，7d后再次灌根，每株灌100ml/次；其中，所述PB12菌液制备方法如下：挑取如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)PB12单菌落接入5mlNYD液体试管中，过夜培养后，再以1％的接种量接种于含100mlNYD培养基的三角瓶中，于35℃，150r/min振荡器中培养24h，稀释至4×107cfu/ml，获得PB12菌液菌悬液。
本发明对播种前的种块拌种处理，抑制种源病菌，杀灭种薯携带的菌源，杜绝外部传染，防止土传菌源侵入种薯，使病原进一步繁殖造成潜在危害；同时播种时将枯草芽孢杆菌微生物颗粒剂作为底肥随种块下地，拮抗土壤中的病原菌。不仅控制了种传和土传病害的发生，同时具有增产提质作用。
本发明微生物菌剂具有无药害、无残留、不抑制生长以及用量少的特点，这为用药方案多样化和生态环境的保护提供了可能。
本发明所用的枯草芽孢杆菌PB12(保藏号为CGMCCNo.10603)是筛选分离于黑龙江省哈尔滨市呼兰区的马铃薯田间感病区域土壤中，该菌株对马铃薯土传病菌(丝核病、晚疫病、疮痂病)具有较强的拮抗作用，是一株抑菌谱广、抑菌效果明显的优良生防菌株。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式中枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)PB12，由呼兰区白奎镇庆平屯马铃薯田间感病区域的土壤中分离得到，对马铃薯土传病菌具有较强的拮抗作用。保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2015年3月11日，保藏编号为CGMCCNo.10603。
具体实施方式二：本实施方式中防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂由两种，一种是拌种剂；防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂拌种剂的制备方法是按下述步骤进行的：
步骤一、挑取如具体实施方式一所述的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)PB12单菌落接入5mlNYD液体试管中，过夜培养后，再以1％的接种量接种于含100mlNYD培养基的三角瓶中，于35℃，150r/min振荡器中培养24h，获得菌悬液；
PB12菌液活菌数测定：将发酵培养好的PB12菌液进行梯度稀释，采用平板计数法进行活菌数的测定，测定结果为1.5×109cfu/mL。
步骤二、称取67g成膜剂，用加热至80℃的500g蒸馏水边搅拌边溶解，充分溶解后再加入500g蒸馏水，而后加入步骤一获得的菌悬液使活菌浓度为5亿//mL；即得到拌种剂。
步骤二中所述成膜剂是聚乙烯醇、黄原胶与水配制的溶液；聚乙烯醇的质量百分比含量是10％，黄原胶的质量百分比含量是0.2％。
具体实施方式三：本实施方式中防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂为防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂颗粒剂；具体的制备方法是按下述步骤进行的：
步骤(1)、挑取如具体实施方式一所述的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)PB12单菌落接入5mlNYD液体试管中，过夜培养后，再以1％的接种量接种于含100mlNYD培养基的三角瓶中，于35℃，150r/min振荡器中培养24h，获得菌悬液(活菌数为1.5×109cfu/mL)；
步骤(2)、以腐植酸为基质，然后喷加步骤(1)获得的菌悬液至复合基质中经圆盘造粒获得防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂颗粒剂，活菌数≧3-5亿//克。
步骤(2)所述的复合基质按重量百分比是由90％褐煤、5％腐植酸和5％羧甲基纤维素制成的，制备方法按现有公开的方法制备，复合基质的粒径为3.0mm。
具体实施方式四：本实施方式中防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂的使用方法是由下述步骤完成的：种薯切块播种，播种时将具体实施方式三方法制备的防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂颗粒剂按4公斤/亩用量与化肥一同施入土壤中。
具体实施方式五：本实施方式中防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂的使用方法还可由下述步骤完成的：
将种薯切块用具体实施方式二方法制备的拌种剂拌种，拌种剂与种薯的质量比是1:50，阴干后播种，播种时将具体实施方式三方法制备的防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂颗粒剂按4公斤/亩用量与化肥一同施入土壤中。
具体实施方式六：本实施方式中防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂的使用方法还可由下述步骤完成的：
将种薯切块用具体实施方式二方法制备的拌种剂拌种，拌种剂与种薯的质量比是1:50，阴干后播种，播种时将具体实施方式三方法制备的防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂颗粒剂按4公斤/亩用量与化肥一同施入土壤中，待出苗后15天用PB12菌液
(4×107cfu/ml)灌根，7d后再次灌根，每株灌100ml/次；
其中，所述PB12菌液制备方法如下：挑取如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)PB12单菌落接入5mlNYD液体试管中，过夜培养后，再以1％的接种量接种于含100mlNYD培养基的三角瓶中，于35℃，150r/min振荡器中培养24h，稀释(请补充)，获得PB12菌液菌悬液。
采用下述试验验证本发明效果：
共设4个处理，每处理面积为20m2，每个处理设3次重复，共计240m2。
处理1(常规生产(对照))：常规种薯切块播种，常规施用化肥。
处理2(颗粒剂处理)：常规种薯切块播种，播种时将PB12颗粒剂按4公斤/亩用量与化肥一同施入土壤。(参见具体实施方式四)
处理3(拌种剂+颗粒剂)：拌种前将种薯切块用PB12拌种剂拌种，阴干后播种，同时将PB12颗粒剂按4公斤/亩用量与化肥一同施入土壤。(参见具体实施方式五)
处理4(拌种剂+颗粒剂+菌剂灌根处理)：播种时同处理3，出苗后15天用PB12菌液(4×107cfu/ml)灌根，每株灌100ml，7d后再次灌根。(参见具体实施方式六)
结果：
出苗率调查
本次试验种薯普遍感染疮痂病。栽种前用PB12拌种剂充分拌种，阴干后栽种。
在马铃薯苗期调查每个处理各小区的出苗率统计结果如下(表1)。
表1马铃薯出苗率调查
从表1结果可知，对种薯用PB12拌种剂进行拌种处理及施加PB12颗粒肥均可提高马铃薯的出苗率达2.5％～11.2％。
2生长期指标调查
在马铃薯生长期调查马铃薯生长情况，每小区以“之”字线法随机取样6株测定马铃薯株高和主茎数。株高及主茎数数据统计结果如下(表2)。
表2马铃薯幼苗株高和主茎数调查结果
从表2统计结果可知，PB12拌种剂进行拌种处理及施加PB12颗粒肥各处理均可增加马铃薯幼苗株高和主茎数，可见PB12拌种剂和PB12颗粒肥对马铃薯幼苗生长安全且有一定促进作用。
3田间病害调查
在马铃薯出苗后15天用PB12菌液(4×107cfu/ml)对处理4小区进行灌根处理，每株灌100ml，7d后再次灌根，10月9日收获时对各处理小区的成薯随机取50个成薯调查疮痂病的发生情况，统计疮痂病发病率和防治率(表3)。
表3马铃薯疮痂病发病率及防治率
处理2、3、4组发病率与对照相比均明显降低，差异显著，即通过PB12菌拌种和施用PB12颗粒肥可降低疮痂病的发生，处理3对疮痂病的防治率达54.42％。
4田间测产
收获时测产，每个区收获的马铃薯分为大、中、小，然后称量，进行比较，产量的统计结果如下(表4)。
表4丝核病区产量统计结果
经PB12菌拌种和施用PB12颗粒肥均可提高小区马铃薯产量，增产率达15.2～24.5％。

Claims (9)

1.一株枯草芽孢杆菌，其特征在于该菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)PB12保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址是北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2015年03月11日，保藏编号为CGMCCNo.10603。
2.防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂的制备方法，其特征在于防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂是一种拌种剂；具体的制备方法是按下述步骤进行的：
步骤一、挑取如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)PB12单菌落接入5mlNYD液体试管中，过夜培养后，再以1％的接种量接种于含100mlNYD培养基的三角瓶中，于35℃，150r/min振荡器中培养24h，获得菌悬液；
步骤二、称取67g成膜剂用加热至80℃的500g蒸馏水边搅拌边溶解，充分溶解后再加入500g蒸馏水，而后加入步骤一获得的菌悬液使活菌浓度为5亿//mL；即得到拌种剂。
3.根据权利要求1所述的防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂的制备方法，其特征在于所述成膜剂是聚乙烯醇、黄原胶与水配制的溶液；聚乙烯醇的质量百分比含量是8％～12％，黄原胶的质量百分比含量是0.1％～0.3％。
4.防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂的制备方法，其特征在于防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂为防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂颗粒剂；具体的制备方法是按下述步骤进行的：
步骤(1)、挑取如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)PB12单菌落接入5mlNYD液体试管中，过夜培养后，再以1％的接种量接种于含100mlNYD培养基的三角瓶中，于35℃，150r/min振荡器中培养24h，获得菌悬液；
步骤(2)、然后喷加步骤(1)获得的菌悬液至复合基质中，经圆盘造粒获得防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂颗粒剂，颗粒剂的活菌数≧3～5亿//克，复合基质中含有腐植酸。
5.根据权利要求4所述的防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂的制备方法，其特征在于步骤(2)所述的复合基质按重量百分比是由90％褐煤、5％腐植酸和5％焦糖色素制成的。
6.根据权利要求5所述的防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂的制备方法，其特征在于褐煤的粒径1.5～4.75mm。
7.防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂的使用方法，其特征在于防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂的使用方法是由下述步骤完成的：种薯切块播种，播种时将权利要求4方法制备的防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂颗粒剂按4公斤/亩用量与化肥一同施入土壤中。
8.防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂的使用方法，其特征在于防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂的使用方法是由下述步骤完成的：
将种薯切块用权利要求2或3方法制备的拌种剂拌种，拌种剂与种薯的质量比是1:50，阴干后播种，播种时将权利要求4方法制备的防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂颗粒剂按4公斤/亩用量与化肥一同施入土壤中。
9.防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂的使用方法，其特征在于防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂的使用方法是由下述步骤完成的：
将种薯切块用权利要求2或3方法制备的拌种剂拌种，拌种剂与种薯的质量比是1:50，阴干后播种，播种时将权利要求4方法制备的防治马铃薯疮痂病的枯草芽孢杆菌微生物菌剂颗粒剂按4公斤/亩用量与化肥一同施入土壤中，待出苗后15天用PB12菌液灌根，7d后再次灌根，每株灌100ml/次；
其中，所述PB12菌液制备方法如下：挑取如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)PB12单菌落接入5mlNYD液体试管中，过夜培养后，再以1％的接种量接种于含100mlNYD培养基的三角瓶中，于35℃，150r/min振荡器中培养24h，稀释至4×107cfu/ml，获得PB12菌液菌悬液。
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