CN110734883A

CN110734883A - 一株拮抗马铃薯疮痂链霉菌的枯草芽孢杆菌

Info

Publication number: CN110734883A
Application number: CN201911173079.7A
Authority: CN
Inventors: 张娟; 李江华; 周英俊; 陈坚; 堵国成; 杨佩珊
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2019-11-26
Filing date: 2019-11-26
Publication date: 2020-01-31
Anticipated expiration: 2039-11-26
Also published as: CN110734883B

Abstract

本发明公开了一株拮抗马铃薯疮痂链霉菌的枯草芽孢杆菌，属于农业环境微生物技术领域。本发明的生防枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis YPS‑7，该菌株已于2019年9月2日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2019678；该生防菌可对马铃薯疮痂链霉菌具有高效的拮抗活性，在马铃薯疮痂病的防治中具有良好的应用前景。

Description

一株拮抗马铃薯疮痂链霉菌的枯草芽孢杆菌

技术领域

本发明涉及一株拮抗马铃薯疮痂链霉菌的枯草芽孢杆菌，属于农业环境微生物技术领域。

背景技术

马铃薯疮痂病是一种可由多种植物病原链霉菌(Steptomyces spp.)引起的经济性病害，其主要致病菌是疮痂链霉菌(Streptomyces scabies)，感病薯块表面形成不同程度的痂状病斑，严重影响薯块的经济价值，种薯感病后除直接造成经济损失外，还可加速病害的传播，该病已成为制约马铃薯生产的重要因素之一。

马铃薯疮痂病是一种难防的世界性土传病害，目前对该病害还缺乏特别有效的防治方法，生产中针对该病害的主要防治方法有选用抗病品种、化学药剂防治和生物制剂防治等。其中，选用抗病品种方法具有筛选难度大、适用地区受限的缺点；而化学药剂防治方法不仅污染环境，还会使土壤的微生物生态系统失衡，不利于可持续发展。

因此，有必要寻找一种有效的防治马铃薯疮痂病方法。

发明内容

针对马铃薯疮痂病难以防治的问题，本发明提供了一种生物防治马铃薯疮痂病的方法，获得一株高效拮抗马铃薯疮痂链霉菌(Streptomyces scabies)的生防枯草芽孢杆菌菌株。

本发明的第一个目的是提供一株拮抗马铃薯疮痂链霉菌的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YPS-7，已于2019年9月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2019678。

本发明的第二个目的是提供含有上述枯草芽孢杆菌YPS-7的微生物制剂。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物制剂中含有活菌数≥10⁶CFU/g的枯草芽孢杆菌YPS-7干菌体。

在本发明的一种实施方式中，所述微生物制剂中含有活菌数≥10⁶CFU/mL的枯草芽孢杆菌YPS-7湿菌体。

本发明的第三个目的是提供一种拮抗马铃薯疮痂链霉菌的方法，是将上述枯草芽孢杆菌YPS-7或微生物菌剂接种至经过疮痂链霉菌(Streptomyces scabies)侵染的活体马铃薯块茎内。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌或微生物菌剂中，枯草芽孢杆菌YPS-7活菌数不少于10⁶cfu/mL。

在本发明的一种实施方式中，所述枯草芽孢杆菌或微生物菌剂中，枯草芽孢杆菌YPS-7活菌数不少于10⁶cfu/g。

本发明的第四个目的是提供上述枯草芽孢杆菌枯草芽孢杆菌YPS-7在抑制植物病变领域中的应用。

在本发明的一种实施方式中，所述植物是马铃薯。

本发明的第五个目的是提供上述枯草芽孢杆菌在食品领域中的应用。

本发明的有益效果：

本发明提供的Bacillus subtilis YPS-7，本身分离自土壤，是土壤习居菌，采用改良牛津杯法测定抑菌圈直径，发现Bacillus subtilis YPS-7对疮痂链霉菌的抑菌圈直径达29mm，拮抗能力强，防治效果良好。本发明的另一个优点为，采用16s rDNA测序分析结合特异性PCR技术对枯草芽孢杆菌群进行鉴定，避免了培养方法和生理生化鉴定的繁琐。

附图说明

图1为初筛拮抗菌对疮痂链霉菌的抑菌效果图。

图2为复筛拮抗菌对疮痂链霉菌的抑菌效果图(注：孔径直径为8mm，底部平板直径为85mm)。

图3为本发明筛选方法筛选出的Bacillus subtilis YPS-7在LB固体培养基的菌落形态。

图4为本发明筛选方法筛选出的Bacillus subtilis YPS-7的特异性引物PCR扩增结果。

图5为本发明的生防菌剂Bacillus subtilis YPS-7的活体防病效果结果。

生物材料保藏

一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，分类命名为Bacillus subtilis YPS-7，已于2019年9月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2019678，保藏地址为中国武汉，武汉大学。

具体实施方式

以下是本发明的具体实施例，对本发明的技术方案做详细描述，但是并非用于限制本发明的保护范围。

实施例1疮痂链霉菌拮抗菌的筛选

(1)马铃薯疮痂病病原菌疮痂链霉菌孢子悬浮液的制备

采用YME培养基(配方：酵母粉4g，麦芽糖提取物10g，葡萄糖4g，琼脂15g，蒸馏水定容至1L，pH 7.2，121℃下湿热灭菌15min)对菌株进行活化培养5天，取10mL无菌水倾入长满病原菌的平板，玻璃棒轻刮孢子，脱脂棉除去菌丝团，滤液离心，弃上清，无菌水悬浮沉淀，使孢子浓度为10⁵-10⁷CFU/mL；

(2)拮抗菌的分离

从黑龙江省克山县马铃薯种植区疮痂病发病地块中取土样，称取1g，加入含有玻璃珠的200mL三角瓶中，加蒸馏水50mL，150r/min振荡1h。取悬浮培养液稀释成10^-1，10^-2，10^-3后，取100μL涂布到LB固体平板上，37℃倒置静止培养24h。利用QPix 420仪器挑取平板上单菌落至96深孔板，置于37℃，220r/min的多孔板摇床上培养24h。转接到新的LB固体平板进行划线培养，对获得的单克隆菌株第二次划线培养，获得纯种菌株。将获得纯培养菌株编号并溶解至30％的甘油中保藏；

(3)拮抗菌的初筛

菌株的抑菌效果测试采用抑菌圈法。将疮痂链霉菌制作成菌悬液，取100μL涂布到YME固体平板上，取上述待测试纯种菌株冻存液划线到涂有疮痂链霉菌的YME平板上，28℃倒置静止培养2-3天，从600株待测菌株中初筛得到30株对疮痂病链霉菌生长有拮抗作用明显的菌株。抑菌效果如图1所示，对疮痂病链霉菌生长有拮抗作用的菌株在其周围会形成透明的区域，即为透明圈，根据所产生的抑菌圈大小来判断抑菌效果。把具有抑菌圈的细菌在营养培养基(配方：蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，琼脂15g，蒸馏水定容至1L，pH7.0，121℃下湿热灭菌15min)平板上进行划线纯化，28℃培养箱内培养48小时后，观察菌落的形态、颜色和大小性状，对具有性状不一样的菌落，分别按同样的方法再次进行划线纯化，直至每个平板上的菌落呈现相同的颜色，大小和形状，即为纯化好的细菌；

(4)拮抗菌的复筛

改良牛津杯法，即将素琼脂(2％琼脂)倒入平板中待其凝固，然后将平板分成4个扇形区域，用镊子把已灭菌的牛津杯放入到四个扇形区域中央，倒入YME培养基，待培养基凝固，平板中加入0.1mL疮痂链霉菌菌液，用已灭菌的玻璃株将菌液均匀打散，取出牛津杯，在原牛津杯所在的孔中加入80μL待测拮抗菌，放置于28℃进行培养24h，观察抑菌圈大小，在牛津杯中接种80mL LB液体培养基为对照，筛选拮抗活性较好的细菌，抑菌圈直径为29mm，结果见图2。拮抗菌命名为7-2。

实施例2Bacillus subtilis YPS-7的鉴定

枯草芽孢杆菌群(Bacillus subtilis group)是枯草芽孢杆菌及其近缘种的总称，其包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)等，这些芽孢杆菌的16srDNA相似度都在99％以上。

通过基因比较发现，在Bacillus subtilis中，基因yyaR位于tetB-tetL的下游，而基因yyaO位于tetB(L)的上游；在Bacillus amyloliquefaciens中，yyaR位于tetB-tetL的上游。据此设计两对引物YyaO-F/TetBR和YyaR-F/TetB-R用于PCR扩增，其中正向引物YyaO-F和YyaR-F分别源自yyaO和yyaR两个基因的3′末端，反向引物TetB-R源自基因tetB的5′末端。即以YyaO-F/TetB-R作为引物时，Bacillus subtilis能够扩增，而Bacillusamyloliquefaciens不能扩增。β-甘露聚糖酶(β-mannanase，EC 3.2.1.78)是一种半纤维素水解酶，能够水解半纤维素主要组成成分甘露聚糖类多糖主链的1,4-β-甘露糖苷键。枯草芽孢杆菌群中的Bacillus subtilis、Bacillus licheniformis都能够产生β-甘露聚酶。根据两者编码基因的不同设计特异性引物进行PCR扩增，可用以区别Bacillus subtilis和Bacillus licheniformis。

Bacillus subtilis特异性引物为：

Bsu-man-1F 5'CAGGCTCACACTTTGTCTTG 3'，

Bsu-man-1R 5'TGAACACAGTCCTGGGTTAG3'。

Bacillus licheniformis特异性引物为：

Bli-man-1F 5'AGCCATGGATATTAAATAAC 3'，

Bli-man-1R 5'TATTCCCTTACAATAAGACG3'。

首先将菌株7-2划线培养后观察菌落形态，7-2在LB固体发酵培养基上生长良好，菌落湿润，乳白色，不透明，圆形，表面光滑，延长培养时间表面有褶皱，菌落形态见图3；同时挑取单菌落放入装有LB液体培养基的三角瓶中，然后将三角瓶放入摇床中37℃，220rpm培养12h。以7-2菌液为模板，分别采用16s rDNA引物，27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′；扩增条件：95℃3min；95℃30s，55℃30s，72℃90s，35个循环；72℃10min。PCR产物通过PCR产物纯化试剂盒进行纯化并送至上海生工进行测序，得到的16s rDNA序列利用NCBI Blast数据库进行同源性分析。经16s rDNA基因序列分析和同源性比较，其与GenBank中Bacillus subtilis OTG009(GenBank登录号：MN305772.1)同源性高达100％，16s rDNA序列见SEQ ID NO.1；进一步通过yyaR、yyaO和tetB-tetL基因顺序的差异设计特异引物，通过特异PCR对Bacillus subtilis和Bacillus licheniformis进行区分，YyaO引物为YyaO-F：5′-GGAACCAGTCCACAGGGTTGTGG-3′，TetB R：5′-CCATATAGAGCTGTTCCAATGGAGAAG-3′；YyaR引物为YyaR-F：5′-CGATTGAGTGGGCRAAGGAGAATCATTTWTGYGGT-3′,TetB R：5′-CCATATAGAGCTGTTCCAATGGAGAAG-3′。

扩增条件：95℃3min；95℃30s，50℃30s，72℃40s，30个循环；72℃5min。PCR扩增结果显示，经过YyaO/TetB R扩增出600bp大小条带，而YyaR/TetB R未能扩增出条带；进一步通过特异PCR技术对Bacillus subtilis和Bacillus licheniformis进行区分，Bacillussubtilis特异性引物为，Bsu-man-1F 5'CAGGCTCACACTTTGTCTTG 3'，Bsu-man-1R 5'TGAACACAGTCCTGGGTTAG3'；Bacillus licheniformis特异性引物为，Bli-man-1F 5'AGCCATGGATATTAAATAAC 3'，Bli-man-1R 5'TATTCCCTTACAATAAGACG3'，扩增条件：95℃3min；95℃30s，50℃30s，72℃60s，30个循环；72℃5min，PCR扩增结果显示(见图4)，经过Bsu-man-1F/Bsu-man-1R扩增出1300bp大小条带，而Bli-man-1F/Bli-man-1R未能扩增出条带。

综上所述，鉴定其为枯草芽孢杆菌，命名为Bacillus subtilis YPS-7，该菌株已于2019年9月2日保藏于中国湖北省武汉市洪山区武汉大学中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M2019678。

实施例3Bacillus subtilis YPS-7在拮抗马铃薯疮痂链霉菌中的具体应用

选择外感整齐，大小均一、无干枯、无损伤、无病害的果实进行活体防治效果验证。马铃薯先用清水洗去尘土等杂质，75％酒精表面消毒后清水冲洗干净，晾干。0.5％次氯酸钠浸泡10min后，无菌水冲洗干净，晾干后在赤道位置打孔，对照和处理组同时接种50μL10⁷cfu/mL的病原菌孢子悬浮液，30℃培养箱培养24h。然后，对照组接种50μL的营养培养基(蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，蒸馏水定容至1L，pH 7.0，121℃下湿热灭菌15min)，处理组接种50μL活菌数为10⁶cfu/mL菌剂。马铃薯置于30℃培养箱继续培养14d，观察发病情况。结果如图5所示，对照组马铃薯块茎严重腐烂且有斑点出现，接种活菌数为10⁶cfu/mL菌剂的处理组马铃薯块茎无损伤现象。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一株拮抗马铃薯疮痂链霉菌的枯草芽孢杆菌

<160> 15

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1389

<212> DNA

<213> Bacillus subtilis

<400> 1

acagatggga gcttgctccc tgatgttagc ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc 60

tgcctgtaag actgggataa ctccgggaaa ccggggctaa taccggatgg ttgtttgaac 120

cgcatggttc aaacataaaa ggtggcttcg gctaccactt acagatggac ccgcggcgca 180

ttagctagtt ggtgaggtaa cggctcacca aggcaacgat gcgtagccga cctgagaggg 240

tgatcggcca cactgggact gagacacggc ccagactcct acgggaggca gcagtaggga 300

atcttccgca atggacgaaa gtctgacgga gcaacgccgc gtgagtgatg aaggttttcg 360

gatcgtaaag ctctgttgtt agggaagaac aagtaccgtt cgaatagggc ggtaccttga 420

cggtacctaa ccagaaagcc acggctaact acgtgccagc agccgcggta atacgtaggt 480

ggcaagcgtt gtccggaatt attgggcgta aagggctcgc aggcggtttc ttaagtctga 540

tgtgaaagcc cccggctcaa ccggggaggg tcattggaaa ctggggaact tgagtgcaga 600

agaggagagt ggaattccac gtgtagcggt gaaatgcgta gagatgtgga ggaacaccag 660

tggcgaaggc gactctctgg tctgtaactg acgctgagga gcgaaagcgt ggggagcgaa 720

caggattaga taccctggta gtccacgccg taaacgatga gtgctaagtg ttagggggtt 780

tccgcccctt agtgctgcag ctaacgcatt aagcactccg cctggggagt acggtcgcaa 840

gactgaaact caaaggaatt gacgggggcc cgcacaagcg gtggagcatg tggtttaatt 900

cgaagcaacg cgaagaacct taccaggtct tgacatcctc tgacaatcct agagatagga 960

cgtccccttc gggggcagag tgacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag 1020

atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttgatct tagttgccag cattcagttg 1080

ggcactctaa ggtgactgcc ggtgacaaac cggaggaagg tggggatgac gtcaaatcat 1140

catgcccctt atgacctggg ctacacacgt gctacaatgg acagaacaaa gggcagcgaa 1200

accgcgaggt taagccaatc ccacaaatct gttctcagtt cggatcgcag tctgcaactc 1260

gactgcgtga agctggaatc gctagtaatc gcggatcagc atgccgcggt gaatacgttc 1320

ccgggccttg tacacaccgc ccgtcacacc acgagagttt gtaacacccg aagtcggtga 1380

ggtaacctt 1389

<210> 2

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 2

caggctcaca ctttgtcttg 20

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 3

tgaacacagt cctgggttag 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 4

agccatggat attaaataac 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 5

tattccctta caataagacg 20

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<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 6

agagtttgat cctggctcag 20

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<212> DNA

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<400> 7

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<211> 23

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 8

ggaaccagtc cacagggttg tgg 23

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 9

ccatatagag ctgttccaat ggagaag 27

<210> 10

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 10

cgattgagtg ggcraaggag aatcatttwt gyggt 35

<210> 11

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 11

ccatatagag ctgttccaat ggagaag 27

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 12

caggctcaca ctttgtcttg 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 13

tgaacacagt cctgggttag 20

<210> 14

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 14

agccatggat attaaataac 20

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工合成

<400> 15

tattccctta caataagacg 20

Claims

1.一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)YPS-7，已于2019年9月2日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M2019678。

2.含有权利要求1所述枯草芽孢杆菌YPS-7的微生物制剂。

3.如权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于，含有活菌数≥10⁶CFU/g的枯草芽孢杆菌YPS-7干菌体。

4.如权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于，含有活菌数≥10⁶CFU/mL的枯草芽孢杆菌YPS-7湿菌体。

5.一种拮抗马铃薯疮痂链霉菌的方法，其特征在于，是将权利要求1所述的枯草芽孢杆菌YPS-7或权利要求2-4任一所述的微生物菌剂接种至经过疮痂链霉菌(Streptomycesscabies)侵染的活体马铃薯块茎内。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，接种的枯草芽孢杆菌YPS-7活菌数不少于10⁶cfu/mL。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，接种的枯草芽孢杆菌YPS-7活菌数不少于10⁶cfu/g。

8.权利要求1所述枯草芽孢杆菌YPS-7在抑制植物病变领域中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述植物是马铃薯。

10.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌在食品领域中的应用。