CN116083289A - 一株枯草芽孢杆菌菌株4-4及其应用、产品和方法 - Google Patents

一株枯草芽孢杆菌菌株4-4及其应用、产品和方法 Download PDF

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Abstract

本发明“一株枯草芽孢杆菌菌株4‑4及其应用、产品和方法”属于微生物技术领域。本发明提供一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株4‑4，其保藏编号为CCTCC No：M 2022546。本发明还提供所述枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株4‑4在防治青枯病或抑菌方面的用途。本发明还提供基于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株4‑4的菌剂、抑菌产品、防治青枯病方法和抑菌方法。经实验证实，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株4‑4可有效使得青枯病发病烟株的病情指数维持在较低水平，同时对多种植物病原菌有抑制拮抗作用。

Description

一株枯草芽孢杆菌菌株4-4及其应用、产品和方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株枯草芽孢杆菌菌株4-4及其应用、产品和方法。
背景技术
青枯病由罗尔斯通氏菌(Ralstonia)侵染引起，是作物重要的土传病害。罗尔斯通氏菌寄主范围广泛，能侵染400多种作物，在香蕉、番茄、马铃薯、烟草上为害较重。烟草青枯病主要由假茄科罗尔斯通氏菌(R.pseudosolanacearum)侵染引起，该病在我国长江流域及其以南各烟区普遍发生。卢灿华、刘俊莹、马俊红等于2019年发表的“云南省烟草青枯病病原多样性初探”([C].中国植物病理学会2019年学术年会论文集,2019:381.)一文已探明，该病在云南省文山、保山、临沧、红河等12个州市的43个区(县)有发生。虽然烟草青枯病为害较重，但因抗病资源匮乏，加之无化学防治的特效药，该病一直是制约烟草产量和品质提升的重要因素。
生物防治因其对环境友好而受到广泛关注。例如，我国已针烟草青枯病开发注册9种生防菌，主要为3种荧光假单胞菌、2种解淀粉枯草芽孢杆菌、3种多粘类枯草芽孢杆菌和1种枯草芽孢杆菌，多数菌剂具有拮抗罗尔斯通氏菌的能力。国内已报道的烟草青枯病生防芽孢菌的相关专利主要包括：解淀粉枯草芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)TBA03(CN111117936A)、多粘类枯草芽孢杆菌NX1-4-4(CN107365729A)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)生防菌株Trb3(CN102747013A)。上述研究表明烟草青枯病的生防菌剂目前以芽孢菌居多，主要原因是芽孢菌具有较强的抗逆性而易于菌剂创制和延长货架期。但因不同生防菌的区域适应性差异较大、跨区域运输成本高、芽孢菌产品剂种类少等原因，不能满足烟草青枯病在我国南方、西南植烟区常年发生而急需绿色烟叶生产的需求。
发明内容
基于本领域现有技术存在的上述不足，本发明提供了一种能够防治烟草青枯病的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株4-4及其应用、产品和方法。
本发明的技术方案如下：
一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株4-4，其特征在于，其保藏编号为CCTCC No：M 2022546。
保藏编号为CCTCC No：M 2022546的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株4-4在防治青枯病或抑菌方面的应用。
所述青枯病指烟草青枯病，由假茄科罗尔斯通氏菌(Ralstonia solanacearum)或假茄科罗尔斯通氏菌(Ralstonia pseudosolanacearum)或蒲桃罗尔斯通氏菌(Ralstoniasyzygii)侵染引发的疾病；
优选地，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株4-4通过拮抗或抑制茄科罗尔斯通氏菌(Ralstonia solanacearum)或假茄科罗尔斯通氏菌(Ralstoniapseudosolanacearum)或蒲桃罗尔斯通氏菌(Ralstonia syzygii)来防治青枯病；
优选地，所述抑菌的菌选自由假茄科罗尔斯通氏菌(Ralstoniapseudosolanacearum)、少根根霉菌(Rhizopus arrhizus)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、瓜亡革菌(Thanatephoruscucumeris)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、链格孢菌(Alternaria alternata)、烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)组成的组。
一种菌剂，其特征在于，包括：保藏编号为CCTCC No：M 2022546的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株4-4。
所述的菌剂，还包括：辅料；优选地
所述菌剂的剂型选自：发酵液、粉剂、悬乳剂。
一种防治青枯病的方法，其特征在于，保藏编号为CCTCC No：M 2022546的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株4-4防治青枯病。
采用菌浓度为107-109CFU/mL的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株4-4的发酵稀释液对发病植株进行灌根处理；
优选地，所述发病植株指：由茄科罗尔斯通氏菌(Ralstonia solanacearum)或假茄科罗尔斯通氏菌(Ralstonia pseudosolanacearum)或蒲桃罗尔斯通氏菌(Ralstoniasyzygii)侵染引发青枯病的烟草植株。
一种抑菌制品，包括：抑菌活性成分，其特征在于，所述抑菌活性成分包括：保藏编号为CCTCC No：M 2022546的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株4-4。
所述的一种抑菌制品，还包括：辅料；
优选地，所述抑菌制品的剂型选自：发酵液、粉剂、悬乳剂；
优选地，所述抑菌的菌选自由假茄科罗尔斯通氏菌(Ralstoniapseudosolanacearum)、少根根霉菌(Rhizopus arrhizus)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、瓜亡革菌(Thanatephoruscucumeris)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、链格孢菌(Alternaria alternata)、烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)组成的组。
一种抑菌方法，其特征在于，采用保藏编号为CCTCC No：M 2022546的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株4-4抑菌。
优选地，所述抑菌的菌选自由假茄科罗尔斯通氏菌(Ralstoniapseudosolanacearum)、少根根霉菌(Rhizopus arrhizus)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、瓜亡革菌(Thanatephoruscucumeris)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、链格孢菌(Alternaria alternata)、烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)组成的组；
优选地，菌株4-4的抑菌浓度为108CFU/mL。
本发明的有益效果如下：
本发明筛选获得一株菌株4-4，经分子鉴定，其在分类学上属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。本发明通过实验证实该菌株4-4对青枯病病原菌：罗尔斯通氏菌以及多种烟草主要病原菌(包括但不限于少根根霉菌、尖孢镰刀菌、核盘菌、瓜亡革菌、灰葡萄孢菌、链格孢菌、烟草疫霉)方面具有显著的拮抗或抑制作用，同时验证了该菌株4-4对罗尔斯通氏菌引发的青枯病的病情指数的抑制作用，本发明提供的菌株4-4具有优良的青枯病防效，并基于其在多种烟草病原菌方面的抑制拮抗作用可预期其在多种烟草疾病方面具有防治效果，是一株有效、防治范围广的生防菌，可广泛应用于植物疫病的预防或治疗。
本发明的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株4-4的保藏信息如下：
保藏编号：CCTCC NO:M 2022546；
分类命名：Bacillus subtilis 4-4；
保藏日期：2022年5月10日；
保藏单位：中国典型培养物保藏中心；
保藏地址：中国、武汉、武汉大学。
附图说明
图1为本发明实验例1的菌株4-4培养48h的菌落形态图。
图2为本发明实验例2的菌株4-4与罗尔斯通氏菌QBRS-1对峙培养菌落形态对比图
图3为本发明实验例2的菌株4-4与烟草主要病原真菌对峙培养菌落形态对比图
图4为本发明实验例3的枯草芽孢杆菌4-4及近缘芽孢菌基于全基因组构建的系统发育树图。
图5为本发明实验例5的粉剂4-4防治烟草青枯病的效果。
具体实施方式
下面结合具体实施例、实验例和附图对本发明的技术方案做进一步详细说明，但本发明并不局限于以下技术方案。
生物材料的来源
一、实验例4和实验例5使用的烟草材料为公知公用的烟草品种红花大金元，由申请人实验室保存，也可商购获得。
二、实验例4使用的罗尔斯通氏菌列示如下：
蒲桃罗尔斯通氏菌(Ralstonia syzygii)LLRS-1为“Can-Hua Lu,Jun-Ying Li,Meng-Ge Mi,et al.Complete Genome Sequence of Ralstonia syzygiisubsp.indonesiensis Strain LLRS-1,Isolated from Wilted Tobacco inChina.Phytopathology,2021,111:12:2392-2395)”一文中记载的LLRS-1菌株。
茄科罗尔斯通氏菌(Ralstonia solanacearum)FQY_4为“Cao Yi,Tian Baoyu,LiuYanxia,et al.Genome Sequencing of Ralstonia solanacearum FQY_4,Isolated froma Bacterial Wilt Nursery Used for Breeding Crop Resistance.GenomeAnnouncements,2013,1(3):e00125-13.”一文中记载的FQY_4菌株。
茄科罗尔斯通氏菌(Ralstonia solanacearum)CQPS-1为“Liu Y,Tang Y,Qin X,et al.Genome Sequencing of Ralstonia solanacearum CQPS-1,a Phylotype I StrainCollected from a Highland Area with Continuous Cropping ofTobacco.Front.Microbiology,2017,8:974.”一文记载的CQPS-1菌株。
假茄科罗尔斯通氏菌(Ralstonia pseudosolanacearum)BSRS-1、QBRS-1、PEJG01均为申请人实验室保存的菌株，申请人承诺自本发明申请日起20年内免费向公众发放用于验证本发明的效果。
三、实验例2和实验例5使用的罗尔斯通氏菌是QBRS-1，为申请人实验室保存，申请人承诺自本发明申请日起20年内免费向公众发放用于验证本发明的效果。
四、实验例2使用的烟草主要病原菌：
烟草菌核病病原菌核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)HP-1为“Lu C.-H.,LiuJ.-Y.,Lin Z.-L.,et al.First Report of Sclerotinia Blight Caused bySclerotinia sclerotiorum on Oriental Tobacco in the Yunnan Province ofChina.Plant Disease,2020,104(6):1867.”一文记载的HP-1。
烟草灰霉病病原菌灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)HM-1为“卢灿华,蔺忠龙,甄安忠,等.香料烟灰霉病和菌核病病原鉴定及室内药剂筛选[J].中国烟草科学,2020,41(6):68-75.”一文记载的HM-1。
烤烟霉变病病原菌少根根霉菌(Rhizopus arrhizus)DL8“卢灿华,苏家恩,盖晓彤,等.烤烟霉变病原菌鉴定及其生防菌筛选[J].中国烟草科学,2022,43(2):45-51.”一文记载的DL8。
烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)0号生理小种菌株19HJ130和1号生理小种菌株19HJ80、链格孢菌(Alternaria alternata)cx-1、瓜亡革菌(Thanatephoruscucumeris)LCTS-6、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)xw03分别对应发明专利ZL202011257063.7记载的黑胫病菌(0号小种)、黑胫病菌(1号小种)、赤星病菌(Alternariaalternata)、靶斑病菌(Thanatephorus cucumeris)、根腐病菌(Fusarium oxysporum)，均为申请人实验室保存的菌株，申请人承诺自本发明申请日起20年内免费向公众发放用于验证本发明的效果。
本发明实验例采用的培养基及培养育苗方法
一、采用的培养基
LB液体培养基包含1％(w/v，下同)胰蛋白胨、0.5％酵母浸出物、1％氯化钠和0.5％蔗糖；
CG培养基包含0.1％酸水解酪蛋白、0.5％葡萄糖和2％蛋白胨；
CGA含0.1％酸水解酪蛋白、0.5％葡萄糖和2％蛋白胨、1.5％琼脂；
寡营养培养基CN含0.1％酪蛋白氨基酸、0.1％营养肉汤、1.5％琼脂；
TZC培养基含1％蛋白胨、1％葡萄糖、0.1％酪素水解物、1.5％琼脂及0.005％的氯化三苯基四氮唑(TTC)；
PDA培养基含20％马铃薯、2％葡萄糖、1.5％琼脂。
二、漂浮育苗
以感病烟草品种红花大金元为生测对象，漂浮育苗培育烟苗至4～5叶期。
三、病原菌培养
从-80℃超低温冰箱活化罗尔斯通氏菌RS于TZC培养基[1％蛋白胨、1％葡萄糖、0.1％酪素水解物、1.5％琼脂及0.005％的氯化三苯基四氮唑(TTC)]表面，置于28℃恒温培养箱培养36～48h；
挑取具有较宽白边、流动性较强、中间呈粉红色或浅红色稀液状的典型菌落，接种于盛有100mL CG液体培养基(1％蛋白胨、1％葡萄糖、0.1％酪素水解物)的三角瓶内，置于28℃225r/min恒温振荡培养24h；
取100μL稀释至10-7，取100μL 10-5、10-6、10-7稀释液涂布TZC平板，并于48h后观察菌落形态及计数菌落数，计算培养的菌液含有的菌体量。
第1组实施例、本发明的菌株4-4
本组实施例提供一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株4-4，其特征在于，其保藏编号为CCTCC No：M 2022546。
任何利用、使用、销售、许诺销售、生产、制备、培养、扩繁、克隆、发酵保藏编号为CCTCC No：M 2022546的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株4-4的行为均落入本发明的保护范围。
本领域技术人员根据本发明的教导和启发，出于实际生产需要，结合微生物工艺领域常用技术手段选择合适的辅料加以调配，将本发明保藏编号为CCTCC No：M 2022546的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株4-4制成各种符合各类符合工艺生产要求的剂型产品，例如，粉剂、片剂、液体剂等。
本文中，发明内容、具体实施方式部分记载的生防菌、枯草芽孢杆菌4-4、4-4、菌株4-4、4-4菌株、枯草芽孢杆菌均指：本发明的保藏编号为CCTCC No：M 2022546的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株4-4。
第2组实施例、本发明的菌株4-4的应用
本组实施例提供保藏编号为CCTCC No：M 2022546的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)菌株4-4在防治青枯病或抑菌方面的应用。
在一些实施例中，所述青枯病指烟草青枯病，由假茄科罗尔斯通氏菌(Ralstoniasolanacearum)或假茄科罗尔斯通氏菌(Ralstonia pseudosolanacearum)或蒲桃罗尔斯通氏菌(Ralstonia syzygii)侵染引发的疾病。
在另一些实施例中，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株4-4通过拮抗或抑制茄科罗尔斯通氏菌(Ralstonia solanacearum)或假茄科罗尔斯通氏菌(Ralstoniapseudosolanacearum)或蒲桃罗尔斯通氏菌(Ralstonia syzygii)来防治青枯病。
在具体的实施例中，所述抑菌的菌选自由假茄科罗尔斯通氏菌(Ralstoniapseudosolanacearum)、少根根霉菌(Rhizopus arrhizus)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、瓜亡革菌(Thanatephoruscucumeris)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、链格孢菌(Alternaria alternata)、烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)组成的组。
本领域技术人员基于本发明的记载，有动机使用本发明的保藏编号为CCTCC No：M2022546的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株4-4去防治除青枯病以外的其他植物疫病或症状，例如，少根根霉菌引发的植物组织腐烂、尖孢镰刀菌引发的植物枯萎病、核盘菌引发的菌核病、瓜亡革菌引发的茎腐病、灰葡萄孢菌引发的灰霉病、链格孢菌引发的叶枯病、烟草疫霉引发的果腐病等，基于菌株4-4在多种烟草病原菌方面的抑制拮抗作用可预期其在多种烟草疾病方面具有与青枯病防治类似的防治效果。出于篇幅限制，本文不再一一罗列多种植物疾病的防治数据。
任何利用、使用、销售、许诺销售、生产、制备、培养、扩繁、克隆、发酵保藏编号为CCTCC No：M 2022546的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株4-4并将其用于防治青枯病、植物组织腐烂、植物枯萎病、菌核病、茎腐病、灰霉病、叶枯病、果腐病的行为均落入本发明的保护范围。
第3组实施例、本发明的菌剂
本组实施例提供一种菌剂。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述菌剂包括：保藏编号为CCTCC No：M 2022546的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株4-4。
在进一步的实施例中，所述菌剂还包括：辅料。
在更具体的实施例中，所述药用辅料选自：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。
在具体的实施例中，剂型为粉剂。
本发明的菌剂剂型不限于粉剂，本领域技术人员根据本发明的教导和启发，出于实际生产需要，结合微生物工艺领域常用技术手段(例如，《制剂技术百科全书》、《药物制剂技术》等)，选择合适的辅料加以调配，将本发明保藏编号为CCTCC No：M 2022546的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株4-4制成各种符合各类符合工艺生产要求的其他剂型产品，例如，片剂、液体剂、喷雾剂、颗粒剂等。
第4组实施例、本发明防治青枯病的方法
本组实施例提供一种防治青枯病的方法。本组所有的实施例都具备如下共同特征：保藏编号为CCTCC No：M 2022546的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株4-4防治青枯病。
在优选的实施例中，采用菌浓度为107-108CFU/mL的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)菌株4-4的发酵稀释液对发病植株进行灌根处理。
在具体的实施例中，所述发病植株指：由茄科罗尔斯通氏菌(Ralstoniasolanacearum)或假茄科罗尔斯通氏菌(Ralstonia pseudosolanacearum)或蒲桃罗尔斯通氏菌(Ralstonia syzygii)侵染引发青枯病的烟草植株。
第5组实施例、本发明的抑菌制品
本组实施例提供一种抑菌制品。本组所有的实施例都具备如下共同特征：所述抑菌制品包括：抑菌活性成分；所述抑菌活性成分包括：保藏编号为CCTCC No：M 2022546的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株4-4。
在进一步的实施例中，所述的一种抑菌制品还包括：辅料；
在更具体的实施例中，所述药用辅料选自：溶剂、抛射剂、增溶剂、助溶剂、乳化剂、着色剂、黏合剂、崩解剂、填充剂、润滑剂、润湿剂、渗透压调节剂、稳定剂、助流剂、矫味剂、防腐剂、助悬剂、包衣材料、芳香剂、抗黏合剂、整合剂、渗透促进剂、pH值调节剂、缓冲剂、增塑剂、表面活性剂、发泡剂、消泡剂、增稠剂、包合剂、保湿剂、吸收剂、稀释剂、絮凝剂、反絮凝剂、助滤剂、释放阻滞剂等。
优选地，所述抑菌制品的剂型选自：发酵液、粉剂、悬乳剂；
本领域技术人员根据本发明的教导和启发，出于实际生产需要，结合微生物工艺领域常用技术手段(例如，《制剂技术百科全书》、《药物制剂技术》等)，选择合适的辅料加以调配，将本发明保藏编号为CCTCC No：M 2022546的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株4-4制成各种符合各类工艺生产要求的其他剂型产品，例如，片剂、液体剂、喷雾剂、颗粒剂等。
优选地，所述抑菌的菌选自：假茄科罗尔斯通氏菌(Ralstoniapseudosolanacearum)、少根根霉菌(Rhizopus arrhizus)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、瓜亡革菌(Thanatephoruscucumeris)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、链格孢菌(Alternaria alternata)、烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)中的一种、两种、……、七种或八种。
第6组实施例、本发明的抑菌方法
本组实施例提供一种抑菌方法。本组所有的实施例都具备如下共同特征：采用保藏编号为CCTCC No：M 2022546的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株4-4抑菌。
优选地，所述抑菌的菌选自由假茄科罗尔斯通氏菌(Ralstoniapseudosolanacearum)、少根根霉菌(Rhizopus arrhizus)、尖孢镰刀菌(Fusariumoxysporum)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、瓜亡革菌(Thanatephoruscucumeris)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、链格孢菌(Alternaria alternata)、烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)组成的组；
优选地，菌株4-4的抑菌浓度为108CFU/mL。
实验例1、菌株获取
一、诱集、分离与培养
(1)将土壤样品去除杂质和较大的块状物后，装入直径120mm的玻璃培养皿中，土层厚度约为1.5cm，用蒸馏水采用滴定瓶将土壤润湿；
(2)制备微生物诱集装置：首先在直径50mm、孔径为0.45μm的微孔滤膜边缘涂布胶水，将不锈钢平底垫圈置于微孔滤膜上；然后向垫圈内腔加入3mL固体培养基(1.2％结冷胶和1.0％维生素)；再用胶水涂布金属垫圈上表面，盖上另一孔径为0.45μm微孔滤膜；
将微生物诱集装置置于(1)中湿润的土壤上，轻轻压实装置，确保微孔滤膜与土壤充分接触，再用剩余土壤将装置完全覆盖，并用蒸馏水采用滴定瓶再次润湿土壤；
盖好培养皿，用封口膜将培养装置封好，并置于30℃培养箱培养7d，期间观察土壤湿度，若土壤湿度低则用无菌水补足；
从培养箱中取出经过诱集的培养装置，将固体培养基捣碎，加入3mL无菌水放置10min后，梯度稀释至10-4；
取10-4、10-5菌液涂布于寡营养培养基CN(含0.1％酪蛋白氨基酸，0.1％营养肉汤，1.5％琼脂)，每个梯度涂布5皿，于超净工作台吹干，并置于30℃培养箱中培养7d；
二、实验结果
通过上述实验，从CN培养皿上挑取再次划线于CN培养基，获得纯菌4-4；挑取菌株4-4的单一菌落接种于盛有2.5mL LB液体培养基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母浸出物、1％氯化钠和0.5％蔗糖)的试管，置于28℃225r/min恒温振荡培养48h，其菌落形态如图1所示。
实验例2、菌株4-4抑制烟草主要病害病原菌生长的能力
1、拮抗罗尔斯通氏菌：将CG培养基(0.1％酸水解酪蛋白、0.5％葡萄糖和2％蛋白胨)培养24h的罗尔斯通氏菌QBRS-1(109CFU/mL)梯度稀释至10-4；取100μL稀释液置于CGA(0.1％酸水解酪蛋白、0.5％葡萄糖和2％蛋白胨、1.5％琼脂)培养基表面，用涂布株涂布均匀，置于超净工作吹干；用无菌牙签挑取待测细菌4-4的单菌落接种(4-4接种的菌浓度是108CFU/mL)于筛选培养基表面距培养皿中心2.50cm的距离处，每皿对称接种4点，晾干后正置于28℃培养箱培养48h，测量菌株的抑菌圈和抑菌带(图2)。
2、拮抗病原真菌：分别以烟草菌核病病原菌核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)HP-1、烟草灰霉病病原菌灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)HM-1、烤烟霉变病病原菌少根根霉菌(Rhizopus arrhizus)DL8、烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)0号生理小种菌株19HJ130和1号生理小种菌株19HJ80、链格孢菌(Alternaria alternata)cx-1、瓜亡革菌(Thanatephorus cucumeris)LCTS-6、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)xw03为指示菌，检测菌株4-4对上述病原菌的抑菌能力。实验采用平板对峙法，用直径0.8cm的打孔器将指示菌菌块贴接于PDA培养基(马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15g，加蒸馏水至1000mL，pH 7.2)平皿中心，在距菌饼中心3.5cm的两侧对称划线接种内生细菌4-4(4-4接种的菌浓度是108CFU/mL)，以只接病原真菌菌丝块的处理为对照(图3)。28℃恒温培养，待对照长满全皿时，检查对峙培养结果，记录抑菌带的宽度，根据两菌菌落发展速度、菌落之间有无抑制带、菌落边缘的菌丝是否发生稀疏和萎缩的现象等来判断分离的内生细菌对病原菌有无拮抗作用，每个处理3次重复。
试验结果：从表2和图2、3可见，菌株4-4对供试的8种重要烟草病害病原菌的生长均有抑菌能力，其中菌株4-4抑制链格孢菌(A.alternata)cx-1生长的能力最强；菌株4-4对少根根霉菌(R.arrhizus)DL8生长的抑制能力次之；菌株4-4对烟草疫霉(P.nicotianae)0号生理小种菌株19HJ130和瓜亡革菌(T.cucumeris)LCTS-6也有较强的抑制能力。此外，菌株4-4对尖孢镰刀菌(F.oxysporum)xw03、核盘菌(S.sclerotiorum)HP-1、灰葡萄孢菌(B.cinerea)HM-1、烟草疫霉(P.nicotianae)1号小种菌株19HJ80、假茄科罗尔斯通氏菌(R.pseudosolanacearum)QBRS-1生长也有一定抑制能力。上述结果说明菌株4-4对烟草主要病害病原菌均具有拮抗作用，可用于上述病害的生物防治。
表1.菌株4-4拮抗烟草主要病害病原菌的能力测定
Figure BDA0003949639290000121
实验例3、菌株鉴定与保藏
一、菌株鉴定
常规细菌鉴定参照文献《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等编著.科学出版社.2001年)。
采用Biolog GEN III板分析菌株4-4的化合物代谢特征。
分子鉴定方法如下：细菌基因组DNA的提取试剂盒，方法参见试剂盒说明书。用通用引物F27/R1492进行PCR扩增16S rDNA序列，常规条件扩增，扩增产物经胶回收后，连接于载体pEAZY-T5 Zero载体，热激转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，挑取菌落以M13F/M13R为引物进行菌落PCR鉴定。阳性克隆送上海英骏生物技术有限公司进行序列测定。运用Ezbiocloud数据库(https://www.ezbiocloud.net/)，分析与菌株4-4相近的模式种，初步确认菌株的属一级分类地位。
进一步地，运用基因组测序技术获取菌株的全基因组。运用TYPE数据库进行比对，计算菌株4-4与亲缘关系最近的种的DNA分子杂交值(dDDH)，最终确定菌株的分子分类地位，如图4和表2所示。
综合形态学和分子生物学特征，确定生防菌的分类地位。
二、实验结果记录如下：
1、培养特征：菌株4-4于28℃在NA平板培养基上培养，培养初期菌落淡乳白色，脓状，圆形，边缘整齐；培养后期菌落乳白色，扁平状，中心无凸起，边缘不整齐，表面干燥，表面有褶皱；在液体培养基中静止培养，表面形成生物膜。上述形态特征与《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等编著.科学出版社.2001年)中描述的芽孢杆菌属形态特征基本一致，初步判断4-4菌株为芽孢杆菌。
2、形态特征：菌株4-4于28℃培养，在显微镜下，芽孢中生或端生，椭圆形，不膨大，具芽孢。能运动，鞭毛周生。菌体平均大小为0.52～0.76μm×2.0～2.8μm，革兰氏染色为阳性。
3、适应性特征：菌株4-4可在含有0～8g/L NaCl，pH 5.0～9.0的培养基中生长，生长温度范围为4～60℃，最适宜生长温度为28～35℃，最适宜pH值为7.0～7.2。菌株4-4在含有醋竹桃霉素、利福霉素SV、林肯霉素,洁霉素、盐酸胍、硫酸四癸钠、万古霉素、溴酸钠、1％乳酸钠、四唑紫、四唑蓝、萘啶酮酸、氯化锂、亚碲酸钾、氨曲南、丁酸钠的条件下生长。
4、化合物代谢特征：菌株4-4能利用的碳源包括D-海藻糖、D-葡糖酸、丙酮酸甲酯、β-甲酰-D-葡糖苷、粘酸；粘液酸、D-纤维二糖、D-葡糖醛酸、D-水杨苷、龙胆二糖、果胶、L-天冬氨酸、糖质酸、L-谷氨酸、D-果糖、甘油、L-乳酸、D-半乳糖醛酸、葡糖醛酰胺、蜜二糖、L-鼠李糖、柠檬酸、乙酰乙酸、D-麦芽糖、L-组胺、蔗糖、D-甘露醇、α-D-葡糖、L-半乳糖醛酸内酯、L-丙氨酸、甲酸、糊精、D-果糖-6-磷酸、L-苹果酸，不能利用的碳源有D-丝氨酸、D-苹果酸、α-D-乳糖、D-山梨醇、D-阿拉伯醇、α-酮-丁酸、N-乙酰-D-半乳糖胺、丙酸、氨基乙酰-L-脯氨酸、p-羟基-苯乙酸、奎宁酸、明胶、N-乙酰神经氨酸、α-羟基-丁酸、β-羟基-D,L丁酸、3-甲酰葡糖、水苏糖、L-焦谷氨酸、α-酮-戊二酸、N-乙酰-β-D-甘露糖胺、L-丝氨酸、D-半乳糖、D-乳酸甲酯、γ-氨基-丁酸、溴-丁二酸、D-天冬氨酸、D-果糖、L-果糖、D-葡糖-6-磷酸、吐温40、乙酸、D-甘露糖、D-松二糖、肌苷、蜜三糖、L-精氨酸、N-乙酰-D-葡糖胺；能在含有pH5、pH 6、氨曲南、四唑紫、1％ NaCl、4％ NaCl、8％ NaCl、氯化锂、四唑蓝、溴酸钠、丁酸钠、萘啶酮酸、1％乳酸钠、亚碲酸钾的条件下生长，不能在含有D-丝氨酸、硫酸四癸钠、利福霉素SV、盐酸胍、醋竹桃霉素、二甲胺四环素、万古霉素、梭链孢酸、林肯霉素的条件下生长。
5、菌株4-4的分子鉴定：
16S rDNA序列分析表明菌株4-4与枯草芽孢杆菌(B.subtilis)NCIB 3610T相似性最高，为99.93％；与特基拉枯草芽孢杆菌(B.tequilensis)KCTC 13622T、卡夫里亚莱斯氏枯草芽孢杆菌(B.cabrialesii)TE3T、贫瘠水枯草芽孢杆菌(B.inaquosorum)KCTC 13429T、堆肥枯草芽孢杆菌(B.stercoris)JCM 30051T的16S rDNA序列相似性均为99.86％。上述结果表明菌株4-4属于芽孢菌属细菌，且与枯草芽孢杆菌的亲缘关系最近。基因组测序获得菌株4-4的基因组草图，经Type(Strain)Genome Server(https://tygs.dsmz.de/)数据库分析，结果表明菌株4-4与枯草芽孢杆菌(B.subtilis)ATCC 6051T和NCIB 3610T相似性最高，分别为89.3％和89.1(dDDH4)，大于新种的鉴定阈值70.0％，说明菌株4-4为枯草芽孢杆菌；菌株4-4与堆肥枯草芽孢杆菌(B.stercoris)D7XPN1T的dDDH4值为62.1％；菌株4-4与其他枯草芽孢杆菌标准菌株的dDDH4值≤50.5％。值得注意的是，菌株4-4与小单孢菌属Micromonospora provocatoris MT25T的dDDH4值为81.6％，大于新种鉴定的阈值70％；但其G+C组成差异达28.2％，两者不属于同一属细菌。基于菌株4-4及其近缘的枯草芽孢杆菌基因组构建系统发育树，结果表明菌株4-4与枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的两株已测序的标准菌株ATCC6051T和NCIB 3610T聚为一支(图4)。上述结果说明菌株4-4为枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。
表2.4-4与芽孢菌的基因组相似性比较分析
Figure BDA0003949639290000151
三、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株4-4的保藏
通过上述鉴定结果，确认菌株4-4为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的一个株系，命名为4-4，并将该菌株送保藏，其保藏信息如下：
保藏编号：CCTCC NO:M 2022546；
分类命名：Bacillus subtilis 4-4；
保藏日期：2022年5月10日；
保藏单位：中国典型培养物保藏中心；
保藏地址：中国、武汉、武汉大学。
实验例4、菌株在烟草青枯病防治中的应用
试验设置：于温控28～30℃温室大棚进行，试验设置罗尔斯通氏菌处理组、对照组(灌根等体积LB培养基+自来水)，每处理3次重复，每重复10株烟株；
供试菌株培养：室内筛选获得的生防菌4-4用LB液体培养基(1％胰蛋白胨、0.5％酵母浸出物、1％氯化钠和0.5％蔗糖)培养，在225r/min 30℃摇培48h，即获得菌剂4-4；试验选择实验室保存的来自云南省玉溪市(LLRS-1)、文山州(QBRS-1)、临沧市(BSRS-1)、普洱市(PEJG01)、福建省(FQY_4)和重庆市(CQPS-1)的6株罗尔斯通氏菌为病原菌，病原罗尔斯通氏菌用CG液体培养基(0.1％酸水解酪蛋白、0.5％葡萄糖和2％蛋白胨)培养，在225r/min30℃摇培24h；
烟苗移栽：采用漂浮育苗方式培育的烟苗，烟苗为二次剪叶的烟苗，约培育50d，移栽时将红壤与有机质按3:1混匀后移栽烟苗；
接种：移栽后将250mL生防菌发酵液稀释25倍，每株烟灌根200mL稀释液(稀释液中的4-4菌浓度为107CFU/mL)，以等体积LB稀释液处理对照组；次日将CG培养基摇陪24h的罗尔斯通氏菌稀释100倍，每株烟接种100mL罗尔斯通氏菌稀释液(接种浓度约为107CFU/mL)。
调查统计：接种后每7d调查一次病情指数，共调查3-6次。烟草青枯病的发病率、病情指数和防治效果按下式计算：发病率＝发病植株/调查植株总数
×100％；病情指数＝[Σ(病情级数×此级菌株数)/(最高级数×总株数)]×100；防治效果＝(对照病情指数－处理病情指数)/对照病情指数×100％。病情指数按照中华人民共和国烟草行业标准烟草病害分级及调查方法调查(GB/T23222-2008)，病害分级如下：全株无病为0级，病侧二分之一以下叶片凋萎为1级，病侧二分之一至三分之二叶片凋萎为3级，病侧三分之二以上叶片凋萎为5级，病株叶片全部凋萎为7级，病株基本枯死为9级。
试验结果：结果表明经菌剂4-4处理的烟株在观察期内病情指数均低于对照组，且菌剂4-4对不同地理来源的供试罗尔斯通氏菌均有防治效果，防效在7.22～82.11％。菌剂4-4对来自玉溪(LLRS-1)的罗尔斯通氏菌引发的青枯病防治效果最好，达82.11％。菌剂4-4对来自云南省玉溪市(LLRS-1)、普洱市(PEJG01)、文山州(QBRS-1)、福建省(FQY_4)和重庆市(CQPS-1)的5株罗尔斯通氏菌引发的青枯病的防效优于对照药剂噻菌铜。上述结果说明菌剂4-4对不同地理来源的罗尔斯通氏菌引发的青枯病均具有一定防治效果，但防效差异大(表3)。
表3.菌剂4-4对不同罗尔斯通氏菌引发的青枯病的防治效果
Figure BDA0003949639290000171
Figure BDA0003949639290000181
实验例5、生防菌剂4-4对烟草青枯病的温室防效评价
实验例5除以下试验及结果不同外，其余操作步骤与实验例4相同。
1、种子液培养：分别挑取一环生防菌接种于含有500mL种子培养液(蛋白胨10.0g/L、牛肉浸膏3.0g/L、氯化钠5.0g/L、琼脂15.0g/L，pH 7.0)的500mL离心管内，置于28℃恒温摇床培养15h。
2、发酵：将生防菌的种子液按1：100比例转接至含有150L发酵培养基中发酵(葡萄糖20g/L，豆粕粉25g/L，酵母膏4g/L，磷酸氢二钾1.5g/L，pH 7.3)。发酵工艺参数如下：(1)灭菌：空消条件为：0.15MPa，123℃，1h；实消条件为：0.15MPa，123℃，35min；(2)接种：灭菌完成培养液温度下降至37℃时开始接种，接种比例为菌种/培养液1:100；(3)发酵：转速:保持120r/min至发酵结束；通气量：保持15m3/h时保持至发酵结束；整个过程保持罐压在0.05Mpa；因设备原因允许通气量在短时间内浮动。温度：整个发酵过程保持温度在37℃，上下可浮动0.5℃。发酵时间：运行发酵24h。
3、制粉：将发酵液(约6.7亿CFU/mL)进行离心，收集离心菌体作为原料按1:1的质量比与硅藻土混合并添加占混合物料总质量5‰的蔗糖作为营养物质，将混合物料置于阴凉干燥通风处晾干，当水分含量达10％左右，进行粉碎后制得4-4粉剂(3.2亿CFU/g)。
4、防治：每棵烟苗施用2.5g菌剂，兑水50mL，得到的菌浓度为0.16亿CFU/mL的菌粉悬浮液进行灌根，每重复15株，设置3次重复，设置清水为对照；次日接种罗尔斯通氏菌QBRS-1，每株0.1OD；每周调查一次病害等级，计算病情指数。
试验结果：如图5，随着接种天数的增加，对照组病情逐渐加重，而菌剂4-4处理的烟株在接种后24d时未发病，而对照组则为473.00±48.72。以病情指数曲线下面积计算，菌剂4-4处理组的防效为100.00％，具有较好防效。

Claims (10)

1.一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株4-4，其特征在于，其保藏编号为CCTCCNo：M 2022546。
2.保藏编号为CCTCC No：M 2022546的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株4-4在防治青枯病或抑菌方面的应用。
3.根据权利要求2所述的保藏编号为CCTCC No：M 2022546的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)菌株4-4在防治青枯病或抑菌方面的应用，其特征在于，所述青枯病指烟草青枯病，由假茄科罗尔斯通氏菌(Ralstonia solanacearum)或假茄科罗尔斯通氏菌(Ralstoniapseudosolanacearum)或蒲桃罗尔斯通氏菌(Ralstonia syzygii)侵染引发的疾病；
和/或，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株4-4通过拮抗或抑制茄科罗尔斯通氏菌(Ralstonia solanacearum)或假茄科罗尔斯通氏菌(Ralstonia pseudosolanacearum)或蒲桃罗尔斯通氏菌(Ralstonia syzygii)来防治青枯病；
和/或，所述抑菌的菌选自由假茄科罗尔斯通氏菌(Ralstonia pseudosolanacearum)、少根根霉菌(Rhizopus arrhizus)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、瓜亡革菌(Thanatephorus cucumeris)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、链格孢菌(Alternaria alternata)、烟草疫霉(Phytophthoranicotianae)组成的组。
4.一种菌剂，其特征在于，包括：保藏编号为CCTCC No：M 2022546的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株4-4。
5.根据权利要求4所述的菌剂，其特征在于，还包括：辅料；和/或
所述菌剂的剂型选自：发酵液、粉剂、悬乳剂。
6.一种防治青枯病的方法，其特征在于，保藏编号为CCTCC No：M 2022546的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株4-4防治青枯病。
7.根据权利要求8所述的一种防治青枯病的方法，其特征在于，采用菌浓度为107-109CFU/mL的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株4-4的发酵稀释液对发病植株进行灌根处理；
和/或，所述发病植株指：由茄科罗尔斯通氏菌(Ralstonia solanacearum)或假茄科罗尔斯通氏菌(Ralstonia pseudosolanacearum)或蒲桃罗尔斯通氏菌(Ralstonia syzygii)侵染引发青枯病的烟草植株。
8.一种抑菌制品，包括：抑菌活性成分，其特征在于，所述抑菌活性成分包括：保藏编号为CCTCC No：M 2022546的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株4-4。
9.根据权利要求8所述的一种抑菌制品，其特征在于，还包括：辅料；
和/或，所述抑菌制品的剂型选自：发酵液、粉剂、悬乳剂；
和/或，所述抑菌的菌选自由假茄科罗尔斯通氏菌(Ralstonia pseudosolanacearum)、少根根霉菌(Rhizopus arrhizus)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、瓜亡革菌(Thanatephorus cucumeris)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、链格孢菌(Alternaria alternata)、烟草疫霉(Phytophthoranicotianae)组成的组。
10.一种抑菌方法，其特征在于，采用保藏编号为CCTCC No：M 2022546的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株4-4抑菌。
和/或，所述抑菌的菌选自由假茄科罗尔斯通氏菌(Ralstonia pseudosolanacearum)、少根根霉菌(Rhizopus arrhizus)、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、瓜亡革菌(Thanatephorus cucumeris)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)、链格孢菌(Alternaria alternata)、烟草疫霉(Phytophthoranicotianae)组成的组；
和/或，菌株4-4的抑菌浓度为108CFU/mL。
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