CN116836878B - 一种荧光假单胞菌和含有荧光假单胞菌的菌剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种荧光假单胞菌和含有荧光假单胞菌的菌剂及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及农业生物技术领域，本发明提供了一种荧光假单胞菌和含有荧光假单胞菌的菌剂及其制备方法和应用。所述荧光假单胞菌的保藏名称为PseudomonasfluorescensJ8，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCCNO：M2022533。本发明将荧光假单胞菌用于防治早疫病，其抑制率达87.01％，使作物生物量提高136.47％。同时本发明利用荧光假单胞菌和枯草芽孢杆菌的代谢补偿作用，通过联合共培养提高复合菌剂在植物表面的定殖能力和防病促生能力。复合菌剂显著提高茄科作物抗病性能，提高病害胁迫环境下茄科作物生物量，对提高茄科作物经济效益有重要的指导意义。

Description

一种荧光假单胞菌和含有荧光假单胞菌的菌剂及其制备方法 和应用
技术领域
本发明涉及农业生物技术领域，尤其涉及一种荧光假单胞菌和含有荧光假单胞菌的菌剂及其制备方法和应用。
背景技术
早疫病又称“轮纹病”或“夏疫病”，是由链格孢菌(Alternaria solani)所导致的一种危害较严重的真菌性病害，常常侵染番茄、茄子、辣椒和马铃薯等茄科作物。早疫病可在短时间内导致作物完全落叶，该病常年造成作物减产20～30％，严重时可到达50％以上，甚至绝产。虽然使用化学农药产品防治番茄早疫病见效快、成本低，但也造成环境污染等很多问题。使用环境友好、卫生安全的植物保护方法和生物防治方法已经成为防治番茄早疫病的必然趋势。
随着生物农药在农业防治上的成功应用，许多科学家开始利用拮抗性微生物，并且发现了许多具有拮抗作用的细菌和真菌。拮抗微生物主要通过生态位点竞争、产生抑菌物质等抑制病原菌生长以实现抗病效果。现有报道中防治链格孢菌的微生物中，细菌包括解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和荧光假单胞菌等，真菌包括汉逊酵母、毕赤酵母和木霉菌属等。假单胞菌是一种植物根际益生菌，能够在植物根部定殖并拮抗病原菌，其生物防治能力取决于其次级代谢产物，如2，4-二乙酰基间苯三酚(2,4-DAPG)和挥发性化合物(如氰化氢)，这些物质会导致病原微生物的细胞膜塌陷、液泡化甚至细胞解体。此外，假单胞菌产生的铁载体可以加快其利用环境中铁离子的效率从而抑制病原真菌生长。现有研究荧光假单胞菌分泌异羟肟酸盐型铁载体能力可达58～99.96μg/mL，对链格孢菌抑制率达35.4～80％。芽孢杆菌也可以产生抑菌物质，包括表面活性素、伊枯草菌素和丰霉素等改变细胞膜渗透性从而杀死病原真菌。现有研究表明枯草芽孢杆菌对链格孢菌的抑制率可达42.6～67％。微生物产生的表面活性素类物质不仅具有抗菌作用，还可以协助植物有益微生物在植物表面定殖。芽孢杆菌、赖氨酸杆菌和假单胞菌是常见的产表面活性素的植物有益细菌。其中芽胞杆菌属产表面活性素的能力最强，大多数芽孢杆菌表面活性素的产量达2～7mg/L。一些有益菌还具备促生作用，枯草芽孢杆菌和荧光假单胞菌等可以提高植物的系统抗性并分泌生长素，如吲哚-3-乙酸(IAA)促进植物生长。这些有益微生物具有抑制早疫病菌繁殖和改善植物生长的巨大潜力。
但是现有对防治链格孢菌的生防菌存在防治效果较低(42.6～80％)，在田间存在时间较短，难以定殖等问题。且菌剂在实际使用过程中，还需物理化学法对菌剂进行预处理，增加成本和操作难度，难以产业化应用。此外，现有对拮抗性微生物的性能探究多关注于其对病原菌的抑制能力，而对拮抗微生物如何影响植物微生态，是否具有促生作用研究较少。因此，为提高对链格孢菌的防治效果，提高作物产量，提供一种防治茄科作物早疫病的防病促生菌剂显得尤为重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种防治茄科作物早疫病的防病促生菌剂，解决现有技术中对防治链格孢菌的生防菌存在防治效果较低，在田间存在时间较短，难以定殖等技术问题。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种荧光假单胞菌，所述荧光假单胞菌的保藏名称为Pseudomonasfluorescens J8，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M2022533。
本发明还提供了一种荧光假单胞菌在防治茄科作物早疫病中的应用。
本发明还提供了一种包含所述荧光假单胞菌的防治茄科作物早疫病的菌剂，所述菌剂中的有效活菌数≥1.0×107CFU/mL。
作为优选，所述菌剂中还包括枯草芽孢杆菌J3。
作为优选，所述枯草芽孢杆菌J3的保藏名称为枯草芽孢杆菌J3，拉丁名称为Bacillus subtilis J3，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M2022532。
作为优选，所述菌剂中同时包含荧光假单胞菌J8和枯草芽孢杆菌J3时，荧光假单胞菌J8和枯草芽孢杆菌J3的有效活菌数的比例为1～9:1～9。
本发明还提供了所述菌剂的制备方法，将荧光假单胞菌J8接种至牛肉膏蛋白胨培养基，在转速为160～180rpm温度为28～32℃的摇床中培养22～26h，得到种子液；后将种子液接种于牛肉膏蛋白胨培养基，在转速为160～180rpm温度为28～32℃的摇床中培养22～26h进行种子扩大培养，控制有效活菌总数≥1.0×107CFU/mL。
本发明还提供了所述菌剂在防治茄科作物早疫病中的应用。
本发明还提供了所述菌剂的使用方法，使用所述菌剂对茄科作物进行灌根处理。
作为优选，所述菌剂与栽培基质的质量比为0.5～10％。
本发明提供了一种荧光假单胞菌和含有荧光假单胞菌的菌剂及其制备方法和应用。所述荧光假单胞菌的保藏名称为Pseudomonasfluorescens J8，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2022533。本发明荧光假单胞菌可通过产生铁载体、生长素、2,4-二乙酰基间苯三酚等益生物质提高茄科作物抗病性能。将荧光假单胞菌和枯草芽孢杆菌进行复配，复合菌剂对早疫病的抑制率可达83.29～94.10％。复合菌剂的开发对提高茄科作物经济效益有重要的指导意义。
与现有技术相比，本申请具有以下效果：
(1)功能丰富，性能稳定：本发明中荧光假单胞菌具有防治链格孢菌侵染植物的优异性能，复合菌剂包含枯草芽孢杆菌和荧光假单胞菌，枯草芽孢杆菌可分泌表面活性素促进荧光假单胞菌在植物表面定殖，使得有益菌能快速成为植物根际或表面优势菌种，菌种之间协同效益明显，有效避免了单一菌种性能不稳定的缺陷。
(2)改善生态，防病促生：本发明菌剂应用于植物时，可以诱发植物系统抗性增强对早疫病的防御功能，产生铁载体和生长素等促生长物质，改善植物微生态达到防病促生的效果，可在植物病原真菌的防治中推广应用。
附图说明
图1为枯草芽孢杆菌和荧光假单胞菌不同体积比(v/v)对链格孢菌抑制效果图。
图2为对照组(链格孢菌根际侵染)和实验组(荧光假单胞菌菌剂根灌后链格孢菌根际侵染)番茄发病率图。
图3为对照组(链格孢菌根际侵染)和实验组(复合菌剂根灌后链格孢菌根际侵染)番茄发病率图。
图4为对照组(链格孢菌根际侵染)和实验组(复合菌剂根灌后链格孢菌根际侵染)烟草发病率图。
保藏说明
荧光假单胞菌J8，拉丁文为Pseudomonasfluorescens，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2022年4月29日，保藏编号为：CCTCC NO：M 2022533。
枯草芽孢杆菌J3，拉丁名称为Bacillussubtilis，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏日期为2022年4月29日，保藏编号为：CCTCCNO：M 2022532。
具体实施方式
本发明提供了一种荧光假单胞菌，所述荧光假单胞菌的保藏名称为Pseudomonasfluorescens J8，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M2022533。
本发明还提供了荧光假单胞菌在防治茄科作物早疫病中的应用。
本发明还提供了一种包含所述荧光假单胞菌的防治茄科作物早疫病的菌剂，所述菌剂中的有效活菌数≥1.0×107CFU/mL，有效活菌总数进一步优选为1.0×107～1.0×108CFU/mL。
在本发明中，所述菌剂中还包括枯草芽孢杆菌J3。
在本发明中，所述枯草芽孢杆菌J3的保藏名称为枯草芽孢杆菌J3，拉丁名称为Bacillussubtilis J3，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M2022532。
在本发明中，所述菌剂中同时包含荧光假单胞菌J8和枯草芽孢杆菌J3时，荧光假单胞菌J8和枯草芽孢杆菌J3的有效活菌数的比例优选为1～9:1～9。
本发明还提供了所述菌剂的制备方法，将荧光假单胞菌J8接种至牛肉膏蛋白胨培养基，在转速为160～180rpm温度为28～32℃的摇床中培养22～26h，得到种子液；后将种子液接种于牛肉膏蛋白胨培养基，在转速为160～180rpm温度为28～32℃的摇床中培养22～26h进行种子扩大培养，控制有效活菌总数≥1.0×107CFU/mL。
在本发明中，进一步优选为将荧光假单胞菌J8接种至牛肉膏蛋白胨培养基，在转速为170rpm温度为30℃的摇床中培养24h，得到种子液；后将种子液接种于牛肉膏蛋白胨培养基，在转速为170rpm温度为30℃的摇床中培养24h进行种子扩大培养，控制有效活菌总数为1.0×107～1.0×108CFU/mL。
本发明还提供了所述菌剂在防治茄科作物早疫病中的应用。
本发明还提供了所述菌剂的使用方法，使用所述菌剂对茄科作物进行灌根处理。
在本发明中，所述菌剂与栽培基质的质量比优选为0.5～10％，进一步优选为1～8％，进一步优选为3～6％。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种防治茄科作物早疫病的防病促生细菌筛选方法
(1)细菌的分离纯化
用无菌刷收集附着在健康番茄植株根表的薄层土壤，过2mm无菌筛网后立即置于无菌离心管中液氮处理并保存。在50mL锥形瓶中，将2g根际土壤样品与18mL的0.01M无菌磷酸盐缓冲液混合，在转速为170rpm温度为30℃的摇床中培养24h。使用无菌生理盐水将悬浊液稀到10-5～10-9，吸取1mL稀释后的土壤悬浊液涂在牛肉膏蛋白胨固体培养基上，将平板翻转，置于30℃的恒温培养箱中培养24h。在各培养基中，用消毒的接种圈随机勾取单个细菌，每一份土壤样品选取20个单菌落，在牛肉膏蛋白胨固体培养基上进行划线纯化。使用无菌接种环挑取单菌落于含有5mL牛肉膏蛋白胨培养基的试管中，在转速为170rpm温度为30℃的摇床中培养24h。吸取500μL菌液与500μL的60％甘油混匀于1.5mL EP管中，保存于-80℃冰箱。
(2)细菌产铁载体能力测定
将菌种活化，从-80℃冰箱中取出保存的甘油菌种，取500μL甘油菌种至含有49.5mL牛肉膏蛋白胨培养基的锥形瓶中，在转速为170rpm温度为30℃的摇床中培养24h。然后将10μL培养了过夜的细菌悬浮液加入到96孔板中，该96孔板分别包含190μL的限铁和富铁的MKB培养基。将加样后的96孔板放置在转速为170rpm温度为30℃的摇床中培养24h。在6000rpm的条件下，用酶标板式离心机离心5min，获得无菌上清液。将CAS检测液按照1:1的比例加入到无菌上清液中，静置反应2h后，使用酶标仪测定OD630，所得结果为A；以没有培养过微生物的无菌培养基作为对照，与CAS检测液按照1:1的比例混合均匀，静置反应2h，同样用酶标仪测定OD630，得到的值为Ar。铁载体相对含量(SU)的计算公式为：SU＝1-A/Ar。使用CAS定量检测法对菌株产铁载体能力进行鉴定，菌株J8产铁载体能力最强，SU为0.642，其次是J3(0.481)，选取这两株菌作为潜在的生防细菌进行后续拮抗实验。
(3)细菌产生长素(IAA)能力测定
将菌种活化，从-80℃冰箱中取出保存于甘油管的菌种，取500μL的菌种至含有49.5mL牛肉膏蛋白胨培养基的锥形瓶中，放置在转速为170rpm温度为30℃的摇床中培养24h。使用6000r/min离心该菌悬液10min，并根据Glickmann等(Glickmann E,Dessaux Y.Acritical examination of the specificity of the salkowski reagent for indoliccompounds produced by phytopathogenic bacteria[J].Applied and EnvironmentalMicrobiology,1995,61(2):793-796.)所述的方法获得上清液后测定OD530 nm值。此外，使用分析纯IAA绘制吸光度-浓度标准曲线，以此来计算待测样品中的IAA含量。菌株J8生长素产量可达25.89mg/L，菌株J3产IAA的能力为19.55mg/L。
(4)荧光假单胞菌J8在BCA中发挥重要生物防治作用，已有研究表明由假单胞菌分泌的抗生素类抑菌物质，2,4-二乙酰基间苯三酚(DAPG)对植物病原真菌具有广谱抑菌作用。将菌株J3与J8协同培养进一步提高复合菌剂产2,4-二乙酰基间苯三酚的能力。
(5)细菌对链格孢菌拮抗能力测定
将菌种活化，取出保存于-80℃冰箱的甘油菌种，取500μL甘油菌种至含有49.5mL牛肉膏蛋白胨培养基的锥形瓶中，在转速为170rpm温度为30℃的摇床中培养24h。将供试病原菌接种在马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基中央，在30℃恒温培养箱中培养48h。将无菌的滤纸片浸泡在含有待测菌株的液体培养基中，静置一段时间，将浸泡的滤纸片分别贴在离病原菌2.5cm的位置，四个方向各放一片。在30℃恒温培养箱中培养48h，观察并测量抑菌圈直径，用无菌牛肉膏蛋白胨液体培养基滴加到培养基上的孔中作为对照。实验分为两组，实验组和对照组，每组重复三次。测量每一小组的抑菌圈直径，计算每组的抑菌圈直径的平均数进行比较。菌株J8对链格孢菌抑制率最高，达87.01％，J3对链格孢菌的抑制率达82.29％。
实施例2
防治茄科作物早疫病的防病促生菌剂的制作：将荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens J8)接种至牛肉膏蛋白胨培养基中，在转速为170rpm温度为30℃的摇床中培养24h，得到种子液后接种于牛肉膏蛋白胨培养基中进行种子扩大培养，在转速为170rpm温度为30℃的摇床中培养24h，控制有效活菌总数为1.0×107CFU/mL。铁载体相对含量(SU)可达0.60，产生长素能力达25.89mg/L，产二乙酰基间苯三酚能力达28.74mg/L，对茄科作物早疫病病原菌(链格孢菌)的抑制率为87.01％。
防治茄科作物早疫病的防病促生菌剂的制作：复合菌剂包括枯草芽孢杆菌和荧光假单胞菌，菌体积比为9：1，8：2，7：3，6：4，5：5，4：6，3：7，2：8，1：9，有效活菌数为1.0×107～1.0×108CFU/mL产铁载体能力(SU)可达0.48～0.73(如表1所示)，产生长素能力达19.55～28.71mg/L(如表2所示)，产二乙酰基间苯三酚能力达28.74～51.23mg/L(如表3所示)，复合菌剂对链格孢菌的抑制率达79.08～94.10％(如表4和图1所示)。
表1不同比例枯草芽孢杆菌和荧光假单胞菌复配后产铁载体能力
菌株体积比(J3/J8) 铁载体相对含量(SU)
9:1 0.48±0.06d
8:2 0.49±0.11d
7:3 0.51±0.07d
6:4 0.55±0.01cd
5:5 0.62±0.04bc
4:6 0.73±0.01a
3:7 0.67±0.02ab
2:8 0.64±0.02bc
1:9 0.65±0.03bc
表2不同比例枯草芽孢杆菌和荧光假单胞菌复配后产生长素能力
菌株体积比(J3/J8) IAA产量(mg/L)
9:1 19.55±1.36i
8:2 21.59±0.92h
7:3 22.94±1.22g
6:4 24.43±0.87f
5:5 27.15±0.64e
4:6 28.71±1.09a
3:7 27.24±0.62b
2:8 26.66±0.65c
1:9 26.15±1.32d
表3不同比例枯草芽孢杆菌和荧光假单胞菌复配后产二乙酰基间苯三酚能力
菌株体积比(J3/J8) 2,4-二乙酰基间苯三酚产量(mg/L)
10:0 0.11±0.005c
4:6 51.23±1.36a
0:10 28.74±0.53b
表4不同比例枯草芽孢杆菌和荧光假单胞菌复配后对链格孢菌的抑制率
菌株体积比(J3/J8) 抑制率(％)
9:1 79.08±3.61f
8:2 82.51±0.56e
7:3 83.29±0.24e
6:4 84.29±0.24e
5:5 84.01±1.26de
4:6 94.10±1.01a
3:7 90.67±0.46b
2:8 87.30±0.22c
1:9 86.09±0.32cd
实施例3
将本发明的防治茄科作物早疫病的荧光假单胞菌防病促生菌剂应用于番茄的早疫病防治，具体包括以下步骤：
实验组将有效活菌数为1.0×107CFU/mL的荧光假单胞菌菌剂以2％的比例根灌于番茄盆栽中，7天后在番茄根部接种链格孢菌，对照组为根灌相同体积的无菌液体培养基，7天后在番茄根部接种链格孢菌，45天后调查发病率，结果如图2所示。
图2结果表明，使用荧光假单胞菌进行防治使得治番茄的早疫病的发病率比对照组低59.74％。表明荧光假单胞菌菌剂应用于番茄可以防止早疫病侵染。
实施例4
将本发明的防治茄科作物早疫病的防病促生复合菌剂应用于番茄的早疫病防治，具体包括以下步骤：
实验组为枯草芽孢杆菌和荧光假单胞菌体积比为2:3，有效活菌数为1.0×107CFU/mL的复合菌剂，按照复合菌剂与盆栽土壤质量比为2％的比例根灌上述复合菌剂，7天后在番茄根部接种链格孢菌，对照组为根灌相同体积的无菌液体培养基，7天后在番茄根部接种链格孢菌，45天后调查发病率，结果如图3所示。
图3结果表明，使用复合菌剂防治组番茄的早疫病的发病率比对照组低92.15％。表明防病促生复合菌剂应用于番茄可以防止早疫病侵染。
实施例5
将本发明的防治茄科作物早疫病的防病促生复合菌剂应用于烟草早疫病防治，具体包括以下步骤：
实验组为枯草芽孢杆菌和荧光假单胞菌体积比为2:3，有效活菌数为1.0×108CFU/mL的复合菌剂，按照复合菌剂与盆栽土壤质量比为2％的比例根灌上述复合菌剂，7天后在烟草根部接种链格孢菌，对照组为根灌相同体积的无菌液体培养基，7天后在烟草根部接种链格孢菌，45天后调查发病率，结果如图4所示。
图4结果表明，使用复合菌剂防治的实验组中烟草的早疫病的发病率比对照组低87.23％。表明防病促生复合菌剂应用于烟草可以防止早疫病侵染。
实施例6
以实施例4制得的防治茄科作物早疫病的防病促生复合菌剂继续应用于番茄早疫病防治试验，实验组为枯草芽孢杆菌和荧光假单胞菌体积比为9：1，8：2，7：3，6：4，5：5，4：6，3：7，2：8，1：9，有效活菌数为1.0×107～1.0×108CFU/mL的复合菌剂，按照复合菌剂与盆栽土壤质量比为2％的比例根灌上述复合菌剂，7天后在番茄根部接种链格孢菌，对照组为根灌相同体积的无菌液体培养基，7天后在番茄根部接种链格孢菌，45天后调查发病率，结果表明，与对照组相比，枯草芽孢杆菌和荧光假单胞菌体积比为9：1，8：2，7：3，6：4，5：5，4：6，3：7，2：8，1：9的防病促生复合菌剂均能实现防止早疫病侵染。
由以上实施例可知，本发明提供了一种荧光假单胞菌和含有荧光假单胞菌的菌剂及其制备方法和应用。所述荧光假单胞菌的保藏名称为Pseudomonasfluorescens J8，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2022533。本发明将荧光假单胞菌用于防治早疫病，其抑制率达87.01％。同时本发明利用荧光假单胞菌和枯草芽孢杆菌的代谢补偿作用，通过联合共培养提高复合菌剂在植物表面的定殖能力和防病促生能力。复合菌剂显著提高茄科作物抗病性能，提高病害胁迫环境下茄科作物生物量，对提高茄科作物经济效益有重要的指导意义。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一种荧光假单胞菌，其特征在于，所述荧光假单胞菌的保藏名称为Pseudomonas fluorescens J8，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M 2022533。
2.权利要求1所述的荧光假单胞菌在防治茄科作物早疫病中的应用。
3.一种包含权利要求1所述荧光假单胞菌的防治茄科作物早疫病的菌剂，其特征在于，所述菌剂中的有效活菌数≥1.0×107CFU/mL。
4.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂中还包括枯草芽孢杆菌J3；
所述枯草芽孢杆菌J3的保藏名称为枯草芽孢杆菌J3，拉丁名称为Bacillus subtilisJ3，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO：M2022532；
所述菌剂中同时包含荧光假单胞菌J8和枯草芽孢杆菌J3时，枯草芽孢杆菌J3和荧光假单胞菌J8的有效活菌数的比例为1～4:6～9。
5.权利要求3所述菌剂的制备方法，其特征在于，将荧光假单胞菌J8接种至牛肉膏蛋白胨培养基，在转速为160～180rpm温度为28～32℃的摇床中培养22～26h，得到种子液；后将种子液接种于牛肉膏蛋白胨培养基，在转速为160～180rpm温度为28～32℃的摇床中培养22～26h进行种子扩大培养，控制有效活菌总数≥1.0×107CFU/mL。
6.权利要求3所述的菌剂或权利要求5制备的菌剂在防治茄科作物早疫病中的应用。
7.权利要求3所述的菌剂或权利要求5制备的菌剂的使用方法，其特征在于，使用所述菌剂对茄科作物进行灌根处理。
8.根据权利要求7所述的使用方法，其特征在于，所述菌剂与栽培基质的质量比为0.5～10％。
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