KR102148396B1 - 바실러스 벨레젠시스 ce 100의 특성과 그 배양여과액이 감귤 검은점무늬병 조절에 미치는 영향 - Google Patents

바실러스 벨레젠시스 ce 100의 특성과 그 배양여과액이 감귤 검은점무늬병 조절에 미치는 영향 Download PDF

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Abstract

본 발명은 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주 및 상기 균주의 배양방법에 관한 것이다. 본 발명의 바실러스 균주를 이용하는 경우 다양한 식물병원균에 대한 방제에 유용하게 사용할 수 있다. 본 발명의 균주는 본 발명의 배양방법으로 배양하는 경우 비멸균 환경에서도 배양이 가능하여 산업적 이용에 용이하다.

Description

바실러스 벨레젠시스 CE 100의 특성과 그 배양여과액이 감귤 검은점무늬병 조절에 미치는 영향{Characteristics of Bacillus Velezensis CE 100 and Effect of Its Culture Filtrate on Control of Citrus Melanoses}
본 발명은 식물 병원균에 대한 방제 활성을 갖는 신규 바실러스 벨레젠시스 CE 100균주, 상기 균주의 배양 방법에 관한 것이다.
박테리아 진균 바이러스 및 선충류에 의해 발생하는 식물 질병은 작물 생산량을 감소시키는 주요한 요인이다. 상기 병원체에 의한 피해로부터 작물을 보호하기 위해 재배법(cultural practices) 및 농약 살포(pesticide application) 등을 포함하는 다양한 방법이 사용되었다. 상기 방법 중 농약은 일반적으로 가장 효과적이고 단시간에 작물을 보호하기 위한 방법으로 간주된다. 그러나 작물에 대한 빈번한 합성 진균제(fungicide)사용은 환경에 해로운 영향을 미치고 항진균제 저항성 균주의 발생을 야기한다. 따라서, 작물 보호에 있어 안정성이 높은 유망한 대안을 고려해야 할 필요가 있다. 화학 진균제의 대체와 관련하여, 효과적인 미생물 제제는 식물 질병의 생물방제로서 지속 가능한 친환경농업의 주요 허용물질로 떠올랐다.
세균 및 진균을 비롯한 다양한 종류의 미생물제제가 식물병원체 방제에 사용되고 그들 중 일부는 유기농업자재시장에 소개되었다. 이들 미생물제제 중에서 세균 길항제, 특히 바실러스 종은 식물 근권에서 내생포자와 잠재적인 군락형성을 갖추고 있다. 그로 인해 바실러스 종은 극한조건에서도 빠른 성장속도, 토양에서의 장기생존, 높은 안정성같은 놀라운 특성으로 인해 토양 매개 진균성 질환을 방제하기 위한 유망한 후보로 알려져 있다. 또한, 바실러스 종은 식물 성장 촉진 호르몬, 사이더포어, 용균효소, 항진균 대사산물의 생산하고 병원체 침투에 대한 식물 면역 시스템의 방어 수준을 높여주는 특징을 가지고 있다. 상기 특징을 통해 바실러스 종은 식물 생장 촉진제로서의 잘 알려져 있다.
그러나, 상술한 생물학적 방제제의 대량 배양 및 실제 현장 적용은 많은 제한이 있다. 상기 제한의 예로 값비싼 접종 설비(inoculating facilities) (배양기 및 실험용 상업적 성장 배지), 성장 배지의 멸균, 배지의 오염 및 표적 병원체를 통제하기 위한 일관성의 상실 등이 있다. 게다가, 생산 비용을 줄이기 위한 희석으로 인해 생물학적 방제제는 토양과 식물의 근권에 서식하는 토착 미생물과 경쟁하기가 어렵다는 문제도 있다.
따라서, 본 발명자는 D.citri에 의한 검은점무늬병에 효과가 좋은 바실러스 벨레젠시스 CE 100 (Bacillus velezensis CE 100)및 이의 배양 방법에 대한 연구를 수행하였다.
Yun, G.-H., Lee, E.-T., & Kim, S.-D. (2001). Identification and antifungal antagonism of Chryseomonasluteola 5042 against Phytophthora capsici. Korean Journal of Applied Microbiology and Biotechnology, 29(3), 186-193. Kende, H., & Zeevaart, J. (1997). The five" Classical" plant hormones. The plant cell, 9(7), 1197.
본 발명자들은 식물병원균 방제효과가 뛰어난 균주와 바실러스 균주의 대량 배양방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 신규한 균주 및 균주의 대량배양방법을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 균주를 포함하는 식물병원균 방제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 바실러스 균주의 배양 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 KACC 81101BP를 제공한다.
본 발명의 신규한 바실러스 벨레젠시스 CE 100은 식물 병원균에 대하여 방제활성을 가지며, 기탁기관 국립농업과학원에 수탁번호 KACC 81101BP로 기탁되었다.
본 발명의 바실러스 벨레젠시스 CE 100균주의 16s rRNA 서열을 서열목록 제1서열에 나타내었다.
본 명세서 상의 용어 "식물 병원균"은 식물에 침입하여 식물의 잎, 줄기, 뿌리 또는 과실을 손실 및 손상을 일으키는 병원성 곰팡이(진균) 및 세균을 의미한다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 바실러스 벨레젠시스 CE 100균주의 균체, 배양액, 배양여과액 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 식물병원균 방제용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 식물병원균은 다이아포르테 사이트리 (Diaporthe citri), 균핵병균 (Sclerotinia sclerotiorum), 스클레로티움 세피보룸(Sclerotium cepivorum), 잿빛 무늬 병원균 (Monilinia fructicola),보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 코레토트리쿰 아큐타툼 (Collectotrichum acutatum), 보트리오티니아 퍼켈리아나 (Botryotinia fuckeliana), 실린드로카폰 데스트럭탄스 (Cylindrocarpon destructans), 셉토리아 글리시네스 (Septoria Glycines), 글로메렐라 신굴레이트 (Glomerella cingulate), 푸사리움 솔라니(Fusarium solani), 리족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani), 피리쿨라리아 그리세아 (Pyricularia grisea), 파이토프토라 드레크슬레리 (Phytophthora drechsleri), 보트리오스페리아 도치데아 (Botryosphaeria dothidea), 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이데스 (Colletotrichum gloeosporioides), 푸사리움 글라민아룸 (Fusarium grminearum), 파이토프토라 캡시사이 (Phytophthora capsici), 파이토프토라 니코티아나 (Phytophthora nicotianae), 알터나리아 포리 (Alternaria porri), 포마속 균들 (Phoma spp), 파이토프토라 인페스탄스 (Phytophthora infestans) 및 펙토박테리움 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum) 로 이루어진 군으로부터 선택되는 식물병원균이나,이에 한정되는 것은 아니며,더욱 구체적으로는 다이아포르테 사이트리 (Diaporthe citri)이다.
본 발명의 식물병원균 방제용 조성물이 식물방제용 농약 조성물로 제조되는 경우, 적당한 고체담체, 액체담체, 가스상담체, 계면활성제, 분산제 및/또는 기타제제용 보조제와 혼합하여, 유화제, 액제, 수화제, 분말제, 입자, 오일용액, 에어로졸 또는 플로어블제(flowables) 등의 임의의 적합한 제형으로 제조될 수 있다.
여기에 사용되는 고체담체에는 탈크, 벤토나이트, 클레이, 카올린, 규조토, 질석, 화이트카본 및 탄산칼슘 등이 포함된다. 액체담체에는 메탄올, n-헥산올 및 에탄올 글리콜 등의 알코올류; 아세톤, 메틸에틸케톤 및 시클로헥사논 등의 케톤류; n-헥산, 케로신 및 등유 등의 지방족 탄화수소류; 톨루엔, 크실렌 및 메틸나프탈렌 등의 방향족 탄화수소류; 디에틸에테르, 디옥산 및 테트라히드로퓨란 등의 에테르류; 에틸아세테이트 등의 에스테르류; 아세토니트릴 및 이소부틸니트릴 등의 니트릴류; 디메틸포름아미드 및 디메틸아세트아미드 등의 산아미드류; 두유 및 면실유 등의 식물유류 디메틸술폭사이드; 및 물이 포함된다. 가스상담체에는, LPG, 공기, 질소, 이산화탄소 및 디메틸에테르가 포함된다.
본 발명의 식물병원균 방제용 조성물은 일반적으로 그대로 또는 희석후에 사용된다.
본 발명의 병원균 방제용 조성물의 사용방법으로는 식물 자체에 적용 (줄기 및 잎에 적용), 토양으로의 적용(토양과 혼화 또는 덧거름), 현장용수로의 적용 및 종자로의 적용을 들 수 있다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 바실러스 벨레젠시스 CE 100 (KACC 81101BP) 균주의 배양 방법이다.
(a) 세균 배양용 배지 300 L 내지 700 L에 바실러스 벨레젠시스 CE 100(KACC 81101BP) 균주를 접종하는 단계;
(b) 접종된 바실러스 균주를 배양하는 단계; 및
(c) 단계 (b)의 결과물을 수득하는 단계를 포함한다.
본 발명의 배양 방법은 별도의 멸균 과정없이 배양시 오염을 최소화할 수 있는 기술이다.
상기 방법을 단계별로 설명한다.
(a) 세균 배양용 배지 300 L 내지 700 L에 바실러스 벨레젠시스 CE 100(KACC 81101BP) 균주를 접종하는 단계;
상기 세균 배양용 배지는 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균이 생장할 수 있는 배지라면 크게 제한되지 않는다. 본 발명의 세균 배양용 배지에 대하여 보다 구체적으로 예를 들면, 트립톤 소이 액체 배지, 영양 액체 배지, LB 배지(lysogeny broth), PB 배지 등이 있을 수 있으나 이에 한정되지는 않는다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 배지의 양은 300 L 내지 700 L, 350 L 내지 700 L, 400 L 내지 700 L, 450 L 내지 700 L, 500 L 내지 700 L, 300 L 내지 650 L, 350 L 내지 650 L, 400 L 내지 650 L, 450 L 내지 650 L, 500 L 내지 650 L, 300 L 내지 600 L, 350 L 내지 600 L, 400 L 내지 600 L, 450 L 내지 600 L, 500 L 내지 600 L, 300 L 내지 550 L, 350 L 내지 550 L, 400 L 내지 550 L, 450 L 내지 550 L, 500 L 내지 550 L이다.
단계 (b) 접종된 바실러스 균주를 배양하는 단계
상기 균주의 배양방법으로는 평판배양법, 고체 배양법, 액체 배양법 등이 있으나, 배양여과액을 얻기 용이하고 대량생산에 적합한 액체 배양하는 것이 바람직하다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 배양은 20℃ 내지 70℃에서 배양하는 것이다. 보다 구체적으로는 20℃ 내지 65℃, 20℃ 내지 60℃, 20℃ 내지 55℃, 20℃ 내지 50℃, 20℃ 내지 45℃, 20℃ 내지 40℃, 20℃ 내지 35℃, 20℃ 내지 30℃, 25℃ 내지 70℃, 25℃ 내지 65℃, 25℃ 내지 60℃, 25℃ 내지 55℃, 25℃ 내지 50℃, 25℃ 내지 45℃, 25℃ 내지 40℃, 25℃ 내지 35℃, 25℃ 내지 30℃, 30℃ 내지 70℃, 30℃ 내지 65℃, 30℃ 내지 60℃, 30℃ 내지 55℃, 30℃ 내지 50℃, 30℃ 내지 45℃, 30℃ 내지 40℃, 30℃ 내지 35℃, 35℃ 내지 70℃, 35℃ 내지 65℃, 35℃ 내지 60℃, 35℃ 내지 55℃, 35℃ 내지 50℃, 35℃ 내지 45℃, 35℃ 내지 40℃, 40℃ 내지 70℃, 40℃ 내지 65℃, 40℃ 내지 60℃, 40℃ 내지 55℃, 40℃ 내지 50℃, 40℃ 내지 45℃, 45℃ 내지 70℃, 45℃ 내지 65℃, 45℃ 내지 60℃, 45℃ 내지 55℃, 45℃ 내지 50℃이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면,상기 배양은 3 일 내지 20일 동안 배양하는 것이다.보다 구체적으로4 일 내지 20 일, 5 일 내지 20 일, 6 일 내지 20 일, 7 일 내지 20 일, 8 일 내지 20 일, 9 일 내지 20 일, 10 일 내지 20 일, 4 일 내지 19 일, 5 일 내지 19 일, 6 일 내지 19 일, 7 일 내지 19 일, 8 일 내지 19 일, 9 일 내지 19 일, 10 일 내지 19 일, 4 일 내지 18 일, 5 일 내지 18 일, 6 일 내지 18 일, 7 일 내지 18 일, 8 일 내지 18 일, 9 일 내지 18 일, 10 일 내지 18 일, 4 일 내지 17 일, 5 일 내지 17 일, 6 일 내지 17 일, 7 일 내지 17 일, 8 일 내지 17 일, 9 일 내지 17 일, 10 일 내지 17 일, 4 일 내지 16 일, 5 일 내지 16 일, 6 일 내지 16 일, 7 일 내지 16 일, 8 일 내지 16 일, 9 일 내지 16 일, 10 일 내지 16 일, 4 일 내지 15 일, 5 일 내지 15 일, 6 일 내지 15 일, 7 일 내지 15 일, 8 일 내지 15 일, 9 일 내지 15 일, 10 일 내지 15 일, 4 일 내지 14 일, 5 일 내지 14 일, 6 일 내지 14 일, 7 일 내지 14 일, 8 일 내지 14 일, 9 일 내지 14 일, 10 일 내지 14 일, 4 일 내지 13 일, 5 일 내지 13 일, 6 일 내지 13 일, 7 일 내지 13 일, 8 일 내지 13 일, 9 일 내지 13 일, 10 일 내지 13 일, 4 일 내지 12 일, 5 일 내지 12 일, 6 일 내지 12 일, 7 일 내지 12 일, 8 일 내지 12 일, 9 일 내지 12 일, 10 일 내지 12 일, 4 일 내지 11 일, 5 일 내지 11 일, 6 일 내지 11 일, 7 일 내지 11 일, 8 일 내지 11 일, 9 일 내지 11 일, 10 일 내지 11 일, 4 일 내지 10 일, 5 일 내지 10 일, 6 일 내지 10 일, 7 일 내지 10 일, 8 일 내지 10 일, 9 일 내지 10 일이다.
본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 배양은 pH 4 내지 9에서 배양하는 것이다. 보다 구체적으로 pH 4 내지 9, pH 4 내지 8, pH 4 내지 7, pH 4 내지 6, pH 5 내지 9, pH 5 내지 8, pH 5 내지 7, pH 5 내지 6, pH 6 내지 9, pH 6 내지 8 또는 pH 6 내지 7 이다.
단계 (c) 단계 (b)의 결과물을 수득하는 단계
상기 단계 (b)의 결과물은 공지의 수득 방법을 통해 수득할 수 있다.
단기 (b)의 결과물은 특정 균주를 배양 배지에서 배양한 배양액, 농축 배양액, 배양액의 건조물, 배양 여과액, 농축 배양 여과액, 또는 배양 여과액의 건조물의 형태로 수득할 수 있다.
본 단계에서 수득된 결과물은 상술한 본 발명의 일 양태에 따른 식물 병원균 방제용 조성물로 제조될 수 있다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주를 제공한다.
(b) 본 발명은 식물병원균 방제용 조성물을 제공한다.
(c) 본 발명의 바실러스 균주의 배양 방법을 이용하는 경우, 바실러스 균주를 비멸균 환경에서 대량 배양할 수 있다.
도 1은 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 TSA 배지에서의 배양 결과(a)및 현미경으로 관찰한 결과(b)를 나타낸다.
도 2는 바실러스 벨레젠시스 CE 100균주의 16s rRNA염기서열을 바탕으로 계통분석한 결과를 나타낸다.
도 3은 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 PBA 배지에서 다양한 온도조건으로 배양한 결과를 나타낸다.
도 4는 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 PBA 배지에서 다양한 pH조건으로 배양한 결과를 나타낸다.
도 5는 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 다양한 병원체에 대한 균사체 성장 억제율을 나타낸다.
도 6은 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주의 다양한 병원체에 대한 길항 작용에 대해 나타낸다.
도 7은 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주 휘발성 화합물의 다양한 진균에 대한 균사체 성장 억제율을 나타낸다.
도 8는 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주 휘발성 화합물의 다양한 진균에 대한 균사체 성장 억제 및 균사 변형을 나타낸다.
도 9은 바실러스 벨레젠시스 CE 100 균주 휘발성 화합물의 다양한 진균에 대한 균사체 성장 억제 및 균사 변형을 나타낸다.
도 10은 바실러스 벨레젠시스 CE 100균과 P.carotovorum의 TSB배지에 공접종한 결과를 그래프로 나타낸다.
도 11는 바실러스 벨레젠시스 CE 100균과 P.carotovorum의 TSA배지에 공접종한 것을 육안으로 관찰한 결과를 나타낸다.
도 12은 바실러스 벨레젠시스 CE 100균주의 대량배양기에서의 성장 정도를 날짜별로 측정한 결과를 나타낸다.
도 13은 바실러스 벨레젠시스 CE 100균주의 PB배지에서 대량 배양하여 CFU/ml및 pH로 측정한 결과를 나타낸다.
도 14는 바실러스 벨레젠시스 CE 100균주의 대량 배양 PB배지유래 배양여과액의 다양한 농도에서의 균사체 성장 억제정도를 나타낸다.
도 15은 바실러스 벨레젠시스 CE 100균주의 대량 배양 PB배지(LP-CE)유래배양여과액의 다양한 농도에서의 균사체 성장 억제정도를 육안으로 관찰한 결과를 나타낸다.
도 16은 바실러스 벨레젠시스 CE 100균주 배양여과액 10%(a), 30%(b), 50%(c), 70%(d)에서의 분생 포자 발아 억제율을 나타낸다.
도 17은 바실러스 벨레젠시스 CE 100균주 배양여과액 10%(a), 30%(b), 50%(c), 70%(d)에서의 분생 포자 발아 결과를 나타낸다.
도 18은 바실러스 벨레젠시스 CE 100균주의 효소 활성을 정성적으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 19는 바실러스 벨레젠시스 CE 100균주의 온도 조건에 따른 키티나아제 활성을 나타낸다.
도 20은 바실러스 벨레젠시스 CE 100균주의 온도 조건에 따른 글루카나아제 활성을 나타낸다.
도 21은 바실러스 벨레젠시스 CE 100균주의 온도 조건에 따른 프로테아제 활성을 나타낸다.
도 22는 바실러스 벨레젠시스 CE 100균주의 pH 조건에 따른 키티나아제 활성을 나타낸다.
도 23은 바실러스 벨레젠시스 CE 100균주의 pH 조건에 따른 글루카나아제 활성을 나타낸다.
도 24는바실러스 벨레젠시스 CE 100균주의 pH 조건에 따른 키티나아제 활성을 나타낸다.
도 25는 바실러스 벨레젠시스 CE 100균주의 사이더포어의 생산을 확인한 결과를 나타낸다.
도26은 바실러스 벨레젠시스 CE 100균주 1:5 희석 배양액(a), 1:3 희석 배양액(b), 희석하지 않은 배양액(c)을 처리한 D.citri감염 잎에 대한 결과를 나타낸다.
도 27은 화분에 심어진 나무에 바실러스 벨레젠시스 CE 100균주(CE), 항진균제(Fungicide)를 처리한 결과를 나타낸다.
도 28은 화분에 심어진 나무에 바실러스 벨레젠시스CE 100균주(CE), 항진균제(Fungicide)를 처리한 후의 검은점무늬병 발생율을 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
박테리아 균주 및 병원성 진균 분리 및 동정
본 연구에서 사용된 박테리아 균주는 바실러스 벨레젠시스 CE 100(Bacillus velezensis CE 100, 토마토 화분(pot) 실험에 쓰인 토양에서 분리한 균주, 이하 CE 100균)이다. 상기 균주를 트립톤 소이빈 한천배지(tryptone soybean agar)(TSA)에 선상도말(streak) 하여 순수한 배양균(pure colonies)을 획득하였다. 그 후 획득한 배양균을 트립톤 소이 액채 배지(Tryptone soy broth, TSB)에서 30 ℃에서 3일 동안 130rpm으로 쉐이킹 인큐베이터(shaking incubator)를 이용해 배양하였다. 그 결과물인 박테리아 배양액을107 CFUs/mL로(CFU, colony forming units) 조정하였으며 추가실험을 위해 50%(v/v) 글리세롤(glycerol)로 처리하여 -80℃로 냉동보관 하였다.
감귤류(citrus)에서 검은점무늬병(melanose)을 일으키는 병원성 진균 (fungal pathogen)인, Diaporthe citri F.A. Wolf (농업미생물은행(KACC), 접근번호 45782)는 감자 포도당 한천배지(potato dextrose agar)(PDA)에서 26 ℃에서 14일 동안 계대배양 하였다.
본 발명자는 실험을 위한D. citri의 분생포자 현탁물(conidial suspension)을 Ko et al, 2012에서 기술한 방법으로 준비하였다. 멸균 코르크 보어(Cork borer)를 사용하여 5 mm 직경의 균사체 플러그(mycelial plug)를 채취한 다음 감자 포도당 한천배지(PDA)에서 26℃로 14일 동안 배양하였다. 분생포자(conidial)의 발생을 유도하기 위하여 진균 플러그(fungal plug)를 오트밀 한천배지(oat meal agar)(OA)에 접종하여 26℃로 14일 동안 배양 후, 실온 형광등 조건으로 14일 동안 배양하였다. 그 후, 완전히 포화된 플레이트에 10ml 멸균 증류수를 첨가하여 멸균 주걱(spatula)를 이용하여 균사체(mycelium)를 긁어냈다. 수득된 분생포자(conidia)는 멸균된 미라클로스(miracloth)(CALBIOCHEM)를 이용해 여과하였다. 분생포자(conidia)의 수는 현미경(Olympus BX41, Japan)하에서 150x 배율로 헤모사이토미터 (hemocytometer)를 이용하여 측정하였고 1.0×106conidia/ml로 조정하였다.
실험에 사용한 감귤나무 재배 방법
3년된 감귤나무 묘??(mandarin seedlings)(Jeju Island, SouthKorea)을 2:1:1비의 토양(bed soil), 질석(vermiculite) 및 화강암 조각(granite fragments)을 함유한 플라스틱 화분(30 cm X 25 cm)에 심었다. 감귤나무 묘목은 전남대학교에서 1년간 온실 상태에서 재배되었으며 1주일 간격으로 물을 주었다.
저비용 배지와 배양기의 준비
박테리아 균주를 저비용으로 대량 배양하기 위해, 탄소원 및 무기염류 등을 포함하는Pink-Brown(PB)배지를 박테리아 균주의 대량 증식을 위해 사용 하였다. 또한, 균주의 대량생산을 위해 저가의 배양기(1 톤) (모델명, M-1000, MC-biotec, 대한민국)를 개발하였다. 실험은 M-1000 배양기와 500L의 비멸균 PB배지를 이용하여 수행하였다. PB 배지에서 CE 100균은 25 ℃내지 50 ℃ 및 4 내지 10 pH범위에서 배양 가능하였다(도 3 및 도 4).
실시예 1: 바실러스 벨레젠시스 CE 100의 길항 작용의 검정
바실러스 벨레젠시스 CE 100의 길항 작용을 대치 배양법(Yoon et al., 2012)을 통해 검정하였다. 바실러스 균주는 각 포테이토 덱스트로오즈 한천배지 (Potato dextrose agar, PDA)플레이트의 한쪽 면에 선상도말 하였으며, 다양한 균류 플러그를 바실러스 균주가 도말된 플레이트의 다른면에 접종하였다. 병원성 진균만 접종한 플레이트를 대조군으로 하였다. 상기 플레이트를 25℃로 14일 동안 배양하였다.
세균성 병원체의 억제를 관찰하기 위해 TSA 배지에 10μL의 펙토박테리움 카로토보룸 (Pectobacteriumcarotovorum)(107CFU/mL)를 도말하였고 병원체 접종 플레이트 중앙에 바실러스 벨레젠시스 CE 100(107CFU/mL)를 접종하였다. 바실러스 벨레젠시스 CE 100의 집락 주변의 억제 구역(inhibition zone)은 접종 4일 후에 관찰하였다.
병원성 진균 및 세균의 성장 억제는 하기 식을 이용하여 계산하였다.
Figure 112019102261376-pat00001
실시예 1-1. 바실러스 벨레젠시스 CE 100의 식물병원균에 대한 길항 작용의 검정
대치 배양의 결과는 CE 100균주가 표적 병원성 진균인 D.citri을 포함한 다양한 식물병원균에 대해 강한 억제 활성을 가지는 것을 보여준다. CE 100균주의 억제율은 도5, 도 6및 표1에 나타내었다.
병원성 진균/세균 처리 균주 억제율(%) 항진균/항균 활성
D.citri B.velezensis CE 100 73.81±0.0 +++
S.sclerotiorum 49.72±0.0 +
S.cepivorum 76.35±4.2 +++
M.fructicola 56.52±0.0 ++
Phoma spp. 60.68±3.9 ++
B.cinerea 52.83±0.0 ++
C.acutatum 61.21±2.1 ++
B.fuckeliana 55.83±1.8 ++
C.destructans 53.66±2.1 ++
P.infestans 77.53±2.0 +++
S.glycines 55.26±9.5 ++
G.cingulata 39.74±2.9 +
F.oxysporum 46.70±2.5 +
F.solani 46.11±2.6 +
P.nicotianae 70.07±3.1 +++
R.solani 54.97±2.4 ++
P.grisea 48.41±1.4 +
P.drechsleri 62.00±4.0 ++
B.dothidea 55.77±3.3 ++
C.gloeosporioides 56.41±2.9 ++
F.graminearum 57.05±1.1 ++
P.capsici 30.77±4.0 +
A.porri 56.41±0.0 ++
(-)30% 이하의 억제율, (+) 30 %에서 50%사이의 억제율,(++) 50 %에서 70 % 사이의 억제율, (+++) 70%에서 100% 사이의 억제율
실시예 2: volatile plate assay를 통한 CE 100균의 진균성 병원체에 대한 성장 억제검정
바실러스 벨레젠시스 CE 100에 의해 생성되는 휘발성 화합물의 균사체 성장억제는 volatile plate assay에 의해 확인하였다. PBA 배지에 50μL의 CE 100균 배양액(107CFU/mL)을 분주하였다. 그 후,각 병원체의 균사체 플러그를 PDA 배지 중앙에 접종하였고 병원체를 접종한 플레이트를 뒤집어 CE 100균 플레이트와 마주보게 두었다. 그 후 상기 플레이트를 테이프를 이용하여 봉인하고 26℃에서 각 병원성 진균의 성장정도에 따라 3일에서 20일까지 배양하였다. 그 후, 각 병원체의 균사체 및 균사 성장 억제 정도를 측정하였다.
또한, 각 플레이트균사체의 균사 변형(hyphal deformation of the mycelium)은 현미경(Olympus BX41, Japan)을 이용하여 확인하였다.
실시예 2-1. volatile plate assay를 통한 CE 100균의 식물병원균 균사체(mycelial) 성장 억제 확인
volatile plate assay의 결과는 CE 100균주가 다양한 식물병원균에 대해 강한 억제 활성을 가지는 것을 보여준다.volatile plate assay를 통해 측정한CE 100균주의 균사체 성장 억제율은 도8, 도 9및 표3에 나타내었다.
병원성 진균/세균 처리 균주 억제율(%) 항진균/항균 활성
D.citri B.velezensis CE 100 00.00±0.0 -
S.sclerotiorum 18.39±7.8 -
S.cepivorum 40.00±14.9 +
M.fructicola 2.40±1.3 -
Phoma spp. 32.93±8.5 +
B.cinerea 40.84±0.5 +
C.acutatum 14.29±1.7 -
B.fuckeliana 36.07±8.7 +
C.destructans 17.45±12.3 -
P.infestans 32.11±5.7 +
S.glycines 26.61±1.6 -
G.cingulata 34.68±0.9 +
F.oxysporum 13.37±4.8 -
F.solani 5.78±2.7 -
P.nicotianae 0.00±0.0 -
R.solani 18.47±4.8 -
P.grisea 10.40±0.4 -
P.drechsleri 26.94±3.1 -
B.dothidea 25.12±2.2 -
C.gloeosporioides 32.80±3.3 +
F.graminearum 13.59±8.1 -
P.capsici 3.31±3.0 -
A.porri 50.61±11.1 ++
P.carotovorum 00.00±0.0 -
(-)30% 이하의 억제율, (+) 30 %에서 50%사이의 억제율,(++) 50 %에서 70 % 사이의 억제율, (+++) 70%에서 100% 사이의 억제율
실시예 2-2. volatile plate assay를 통한 CE 100균의 식물병원균 균사 변형(hyphal deformation) 확인
CE 100균이 생산한 휘발성 화합물에 의해 병원체 균사(hyphal)의 형태는 균사의 가지를 따라 뒤틀리는 형상을 나타내었다 (도 8및 도 9). 이는 대조군인 정상 균사와 비교했을 때 처리 군의 균사는 비정상인 구조를 나타낸 것이다.
실시예 3: CE 100균과 P.carotovorum의 공동 배양을 통한 CE 100균의 세균 성장 억제 능력 검정
다른 세균의 존재 하에 그 세균의 성장을 억제하는 CE 100균주의 경쟁능력을 입증하기 위해 TSB배지에 CE 100균과 박테리아 병원체인 Pectobacterium carotovorum을 공동접종 하였다.
100 μL CE 100균과 (108 CFU/mL) 와 150 μL P. carotovorum(108 CFU/mL)를 TSB배지에서 130rpm으로 30℃에서 6일 동안 배양하였다.
매일 시료를 채취하여 두개의 세균의 수를 CFU/mL로 측정하였다. 각각의 세균을 단독으로 접종한 TSB배지를 대조군으로 사용하였다.
또한, CE 100균과 P.carotovorum을 TSA배지에 공동접종하여 배양하였다.
접종 후 매일 집락의 성장정도를 관찰하였다. 각각의 세균을 단독으로 접종한 TSA배지를 대조군으로 사용하였다.
CE 100균과 P.carotovorum의 TSB배지에 공접종한 결과를 도 10에 나타내었다. CE 100균과 P.carotovorum 공동배양 결과를 살펴보면, P.carotovorum는 2일차부터 그 수가 감소하기 시작하여 4일차에는 관찰되지 않는 양상을 보였다.
CE 100균과 P.carotovorum의 TSA배지에 공접종한 결과를 도 11에 나타내었다. CE 100균과 P.carotovorum공동배양 결과를 살펴보면, P.carotovorum를 단독으로 접종한 배지에서와는 달리 공동배양을 통해 P.carotovorum의 성장이 억제되는 양상을 보였다.
실시예 4: CE 100균의 대량 배양(Large-scale)에서의 pH변화와 성장 패턴의 연구
배양일에 따른 대량 배양(현장 수준)에서의 pH 변화와 균의 성장의 패턴을 확인하기 위해, 먼저, 바실러스CE 100균 100μl(107CFUs/mL)를 1% TSA 플레이트(직경 150 mm)에 멸균 유리 비드(sterile glass beads)를 사용하여 분주하였고 3일 동안 30 ℃에서 배양하였다.
균주 플레이트에서 획득한 배양균을 비멸균 PB 배지 500L를 이용하여 50℃중온성 세균의 성장을 억제하기 위한 조건)조건에서 각각 다른 배양기에서 배양하였다. 각각의 배양기에서 채취된 시료를 10일 동안 매일 세포수 및 pH 변화를 관찰하였다. 본 실험은 소량배양에서의 균주 성장과 비교되는 고온 조건에서 대용량 배양기를 이용한 균주 성장을 확립하기 위해 수행하였다.
대량 배양에서, CE 100균의 성장과정을 도 12에서 나타내었다. CE 100균의 성장은 배양 3일차에 2.67x 105 CFUs/mL로 최대 성장하였다. 또한, CE 100균의 성장은 전체 실험과정 동안 비교적 일정하게 유지되는 양상을 나타내었다(도 13). CE 100균이 배양된 배지의 PH는 1일차에 최저점인 pH 4.75까지 도달하고, 그 후 꾸준히 증가하여 pH 5.86까지 도달하였다 (도 13).
실시예 5: CE 100균에 의한 배양 여과액에 의한D. citri 균사체 (Mycelial) 성장 억제 검정
표적 병원성 진균의 균사체(Mycelial) 성장 억제를 확인하기 위해, 소량 배양 및 대량 배양 단계에서 획득한 5, 7, 및 10 일 째의 세균 배양액을 12000rpm, 15분 동안 원심분리하여 상층액을 획득하고, 그 상층액을 Whatman filter paper No.6를 이용하여 여과한다. 남아 있는 살아있는 균들은 주사기용 여과기(syringe filter)를 이용하여 완전히 제거한다. 생성된 배양 여과액을 미리 오토클레이브한 PDA배지와 혼합하여 최종 농도를 10%, 30%, 50%로 하고60℃로 온도를 조정하였다. 그 후, 직경 2mm의 D.citri진균 플러그(fungal plug)를 각 플레이트의 중앙에 접종하였다. 배양 여과액 없는(0%)PDA 플레이트에서 자란 병원체를 대조군으로 사용하였다.균사체 성장 억제는 접종 후14일 동안 측정되었고 억제 퍼센트는 하기 식을 기초로 하여 결정하였다.
Figure 112019102261376-pat00002
(C는 대조군에서의 진균 콜로니의 직경, T는 처리군에서의 진균 콜로니의 직경)
또한, 각 플레이트 균사체의 균사 변형(hyphal deformation of the mycelium)은 현미경(Olympus BX41, Japan)을 이용하여 확인하였다.
실시예 5-1. CE 100균 배양 여과액(BCF)에 의한 D. citri 균사체 (Mycelial) 성장 억제
본 발명자는 D.citri균사체의 성장이 상술한 방법으로 제조된 다양한 농도의 배양 여과액에 의해 억제됨을 확인하였다. 대량배양된 PB 배지의 배양 여과액은 농도 증가에 따라 억제 수준도 증가하였다. 특히, 5일차 및 7일차 LP-CE 유래 50% BCF(bacterial culture filtrates) 처리군에서 각각 59.27% 및 63.31%의 억제율을 보였다. (도 14 및 23). 7일차 ST-CE 유래 50% BCF 처리군에서는 63.31%의 억제율을 보였다.
또한, 현미경으로 관찰한 결과, CE 100균 배양 여과액을 처리한 병원체 균사(hyphal)의 형태는 팽창하고 균사의 가지를 따라 뒤틀리는 형상을 나타내었다. 이는 대조군인 정상 균사와 비교했을 때 처리군의 균사는 비정상인 구조를 나타낸 것이다.
실시예 6:CE 100균 배양 여과액에 의한D.citri의 분생포자 발아(conidial germination) 억제 검정
D. citri분생포자 발아(conidial germination)의 억제를 조사하기 위해,대량 배양단계에서 얻어진 박테리아 배양 여과액을 오토클레이브한 PDB(Potato Dextrose Broth)액체배지와 혼합하여 최종 농도를 10%, 30%, 50% 및 70%로 하였다. 그 후, 100μL D. citri분생포자 현탁물(conidial suspension)(1.0 x 106분생포자/ml)을 각각의 튜브에 접종하여 총 부피가 1mL가 되도록 하였다. 박테리아 배양 여과액 없는 PDB 액체배지에 접종된 분생포자 현탁물을 대조군으로 하였으며, 같은 실험을 총 3회 수행하였다.
발아된 분생포자의 수는 현미경(Olympus BX41, Japan)하에서 150x 배율로 헤모사이토미터를 이용하여 측정하였고 발아 억제 퍼센트는 하기 식을 이용하여 계산하였다.
Figure 112019102261376-pat00003
GC는 대조군에서의 발아수준(%), GT는 처리군에서의 발아수준(%)
배양 여과액에 의한 D. citri 분생포자 발아 억제에 대한 실험결과는 표4에 나타내었다. 실험 결과는 바실러스 벨레젠시스 CE 100의 배양 여과액이 D.citri분생포자의 발아에 강한 억제효과를 나타내는 것을 보여주었다. 배양 여과액의 농도는 발아 억제 수준에 영향을 준다. CE 100균주는 가장 높은 농도(70 %)를 사용하는 경우에 96% 이상의 발아 억제율을 나타내었다. 배양 여과액의 분생포자 발아 억제는 농도의존적이며, 이는 대조군의 경우 24시간 후에 분생포자가 100% 발아한 것과는 분명한 차이가 있는 것이다(도 16).
배양 여과액 포자 발아 억제율(%)
10% 30% 50% 70%
B. velezensis CE 100 9.27 29.85 86.71 98.3
대조군 0
실시예 7: CE 100균의 효소 활성 분석
다양한 효소 활성을 관찰하기 위한 배지를 제조하기 위해 2% 한천과 다양한 기질(예를 들어, 프로테아제 활성 확인을 위한 2% 카제인, 아밀라아제 활성 확인을 위한 2%전분, 글루카나아제 활성 확인을 위한 1% 라미나린, 키티나아제 활성 확인을 위한 1% 콜로이드성 키틴)을 혼합하였다. 셀룰라아제 배지는 셀룰로오스 0.5g, 콩고 레드 0.1g, 리터 당 한천 20g을 사용하여 제조하였다. 리파아제 활성 검출에 사용할 배지를 페놀레드 0.1g, 한천 20g, 리터 당 올리브 오일 20ml(PH 7.3)를 사용하여 제조하였다.
상술한 각 한천 배지에CE 100균 5μL(107CFU/mL)를 각 배지의 중앙에 접종하여 30℃에서 3일동안 배양하였다. 그 후, 플레이트에 요오드 용액(요오드 1g, 요오드화 칼륨 5g, 증류수 330 ml)을 첨가하였다. 웰 주변의 투명대(clear zone)의 발달은 각 효소의 활성을 나타낸다.
또한, 키티나아제, 글루카나아제 및 프로테아제의 활성을 다양한 pH 및 온도 조건에서 UV 분광기(UV spectrophotometer)를 이용하여 정량적으로 분석하였다. 30℃에서 TSA 배지에 CE 100균5μL(107CFU/mL)를 접종하여 동일한 집락(colony)를 배양하였다. 그 후, 각 집락을 다양한 온도(30, 40 및 50℃) 및 pH(6, 7 및 8) 조건을 가지는 PB 배지에 접종하였다. 그 후, 효소활성을 10일 동안 매일 측정하였다.
또한, CE 100균에 의해 생산되는 철 킬레이트화제인 사이더포어 (siderophore)의 생산을 확인하기 위해 CAS(chromeazurol S) 한천배지를 이용하였다. CE 100균 배양액을 CAS한천 배지에 접종하고 30℃에서 5일 동안 배양하였다. CE 100균 집락 주변으로 주황색으로 변색하는 것은 사이더포어의 생산을 의미한다.
실시예 7-1. CE 100균의 정성적 효소 활성 확인
CE 100균의 효소 활성을 정성적으로 확인한 결과를 도 18에 나타내었다. CE 100균은 5가지 효소 활성(글루카나아제, 프로테아제, 키티나아제, 리파아제 및 셀룰라아제)을 나타냈으며, 아밀라아제 활성은 나타내지 않았다.
실시예 7-2. CE 100균의 정량적 효소 활성 확인
CE 100균의 온도 및 pH 조건에 따른 효소활성을 도19내지 24에 나타내었다.
키티나아제 활성은 50℃에서 가장 높은 활성을 나타냈으며 각 온도별로 배양 5일차 및 7일차에서 가장 높은 활성을 나타내었다.
글루카나아제 활성은 40 ℃에서 가장 높은 활성을 나타냈으며 각 온도 별로 3일차에 최고 활성을 나타내고 점차 감소하는 양상을 보였다.
프로테아제 활성은30 ℃에서 가장 높은 활성을 나타냈으며, 50 ℃ 에서는 거의 활성을 나타내지 않았다. 30 ℃ 및 40 ℃에서 배양한 결과는 3일차에 가장 높은 활성을 나타냈으며 이후로는 활성이 점차 감소하는 양상을 보였다.
키티나아제 활성은 pH6에서 가장 높은 활성을 나타냈으며 각 온도 별로 배양 2일차 및 7일차에 가장 높은 활성을 나타내었다.
글루카나아제 활성은 pH 6에서 가장 높은 활성을 나타냈으며 pH 수치에 관계없이 3일차 이후로는 비슷한 활성 수준을 나타내었다.
프로테아제 활성은 pH 8에서 가장 높은 활성을 나타냈으며, pH 수치에 관계없이 8일차에 가장 높은 활성을 나타내었다. 또한, 프로테아제 활성은 pH 수치나 배양일차에 관계없이 전반적으로 일정한 활성 정도를 보였다.
실시예 7-3. CE 100균의 사이드포어(siderophore)생산 확인
CE 100균의 사이드포어 생산여부를 확인한 결과를 도 25에 나타내었다. CE 100균을 접종한 곳 주변이 주황색으로 변색하는 것으로 보아 CE 100균이 사이더포어를 생산한다는 것을 알 수 있다.
실시예 8: CE 100균의 배양여과액의 정성적 효소 활성 분석
실시예 7에서 설명한 각 한천 배지에 8mm 웰을 만들고 대량배양기의 7일차 배양액에서 여과된 박테리아 배양 여과액 100μL를 각 배지에 접종하여 30℃에서 1일 동안 배양하였다. 그 후, 플레이트에 요오드 용액(요오드 1g, 요오드화 칼륨 5g, 증류수 330 ml)을 첨가하였다. 웰 주변의 투명대(clear zone)의 발달은 각 효소의 활성을 나타낸다.
CE 100균의 대량 배량에서 얻은 배양 여과액의 효소 활성을 정성적으로 확인한 결과를 표 5에 나타내었다. 표 5을 살펴보면, CE 100균의 배양 여과액은 5가지 효소 활성(글루카나아제,프로테아제, 키티나아제,리파아제 및 셀룰라아제)을 나타냈으며, 아밀라아제 활성은 나타내지 않았다.
배양
여과액		 효소
아밀라아제 셀룰라아제 키티나아제 글루카나아제 프로테아제 리파아제
CE 100 - + + + + +
(+): 효소 활성 (-): 효소비활성
실시예 9: 감귤 나무 잎을 이용한 CE 100균의 배양여과액의 검은점무늬병 방제효과 검정
D. citri에 대한 박테리아 배양액의 생체 방어 활성을 확인하기 위해 예비 잎실험 (preliminary leaf experiment)을 수행하였다. 대량 배양 과정을 통해 얻은 박테리아 배양액과 증류수를 혼합하여 1:3, 1:5의 비율의 배양액을 제조하였다. 감귤 나무에서 분리한 어린 잎을 각 배양액에 30분 동안 침지하고 2시간동안 공기 건조하였다. 증류수에 침지한 잎을 대조군으로 사용하였다. 그 후, 배양액 및 증류수에 침지하여 얻은 잎을 D. citri의 분생 현탁액(1.0 x 106분생포자/mL)에 30분간 침지하고 암실 조건 하에서 25℃의 플라스틱 용기에 7일간 보관하였다. 진균 감염을 위한 습도 유지와 건조상태로부터 잎을 보호하기 위해 젖은 멸균 페이퍼 타월을 용기에 함께 보관하였다. 잎의 갈색 병변의 발생은 균류(fungal) 포자 접종 후 7일 째에 검사하였다.
대조군의 경우에는 약 90%의 잎이 감염되었다(도 26a). 또한 5배 희석한 배양액의 경우에도 감염은 심각한 양상을 보였다(도 26b). 그러나 3배 희석한 배양액에서는 일부 잎에서만 감염을 나타내었다(도 26c). 또한, 희석을 하지 않은 배양액의 경우에는 질병의 증상을 나타내지 않았다(도 26d). 상기 결과로부터 질병의 방제 값(%)는 배양액의 희석정도에 의존한다는 사실을 알 수 있다. 감귤류 나무 잎에서는 배양액의 희석정도가 높을수록 질병의 방제율은 낮아졌다.
실시예 10: 감귤나무를 이용한 CE 100균의 배양여과액의 검은점무늬병 방제 효과 검정
화분에서 자란 동일한 4년생 감귤나무를 바실러스 균주의 배양액의 검은점무늬병 방제에 관한 연구에 사용하였다. 모든 잎과 작은 가지가 제거된 각 감귤나무를 전남대학교의 온실에서 재배하였다. 감귤나무에 새로운 잎이 돋아날 때, 검은점무늬 방제를 위한 실험에 이용하였다.
실험을 위해 네 가지 종류의 처리군[CE 100대량배양액 (CE), 합성 항진균제(F), 및 대조군(Con)]을 사용하였고 각 감귤나무를 무작위로 정렬하였다. CE 100균을 PB배지 및 대량배양기를 이용하여 7일 동안 50℃에서 배양하였다. 각 박테리아 배양액을(2.0 Х 105 CFU/mL) 증류수를 이용해 희석(1:1, v:v)하였고 상기 배양액을 잎 표면에 처리하여 2시간 동안 공기 건조하였다.제품화된 합성 항진균제인 dithianon을 제조사의 권장 사항에 따라 잎에 처리한 후 2시간 동안 공기 건조하였다.잎에 물을 처리한군을 대조군으로 이용하였다. 그 후, D.citri의 분생포자 현탁물(1.0 x 106분생포자/mL)을 잎의 표면에 처리하였다. 접종된 식물을 28 ± 2℃및 60% 상대습도에서 재배하였다. 검은점무늬병의 발병(appearance)은 D.citri의 분생포자 현탁물 처리 20일 후에 조사하였다. 질병 발생률은 각 처리 식물에 갈색 병변과 함께 가장자리에 노란색 경계가 있는 잎의 수를 세어 측정하였다.
CE 100균의 감귤나무에 대한 엽면살포(foliar spray)는 D.citri에 의한 검은점무늬병에 대한 방제에 뛰어난 효과가 있다(도 27). 제품화된 항진균제를 처리한 감귤나무의 경우 가장 낮은 질병 발생(incidence)(3.51%)을 보였다. 병원체 접종 20일차에CE 100균을 처리한 군에서(9.32% 및 11.25%) 대조군(46.28%)과 비교했을 때 질병 발생율이 감소한 양상을 보였다(도 28). 즉, 상기 결과를 통해 실제 판매되는 항진균제와 CE 100균의 경우 검은점무늬병 방제에 있어 비슷한 효과를 발휘한다는 사실을 알 수 있다.
고찰
본 명세서에서, 바실러스 균주인 바실러스 벨레젠시스 CE 100의 D.citri에 대한 길항 효과를 대치배양을 통해 확인하였다. 또한 상기 균주는 D.citri의 균사체 성장 억제 효과를 발휘한다 (표 1 및 2).
또한 CE 100균은 D.citri를 포함하는 다양한 병원성 진균 원인체 및 세균성 병원체의 성장 억제 효과를 보여준다 (표 1).
다양한 종류의 미생물 제품이 존재하지만, 그 사용에는 많은 제한이 있다. 예를 들어, 접종물 및 배양기의 높은 비용, 배양 중 오염, 현장에서의 일관성 및 효율성 저하 같은 문제가 있다(Ryu &Gyehun, 2000;Jeon, 2017) . In-vitro에서, 환경조건의 최적화를 통해 다량의 표적 대사 산물을 쉽게 생산할 수 있다. 그러나 현장에서는 그러한 특정 조건을 만족하는 것이 쉽지 않다. 결과적으로 접종된 생물 방제 균의 수가 토착 미생물의 수보다 낮아지게 되는 비효율적인 결과가 발생한다(Sylvia et al. 2005).
접종된 생물방제균의 수가 증가하면 향상된 병원체 억제효과를 도출할 수 있다(Ahmad et al., 2011). 다량의 생물방제균의 적용은 토착 미생물 군집을 억제할 수 있어 성공적인 병원체 억제를 유도할 수 있다.
다양한 연구에서 길항 박테리아(antagonistic bacteria)가 병원성 진균의 확산을 막고 독성을 감소시키는 용해 효소(lytic enzyme)의 중요한 공급원이라는 것을 보여준다(Aktuganov et al., 2008; Khabbaz et al., 2015; Kumar etal., 2011). 키티나아제 및 β-1,3-글루카나아제(β-1,3-glucanase)같은 곰팡이 세포벽 분해 효소는 병원성 진균의 억제에 있어 중요한 역할을 한다(Naing et al., 2014; Jamal et al., 2015). 본 명세서에서 키티나아제 및 글루카나아제를 포함하는 다양한 효소의 활성에 대해 확인하였다(표 5, 도 18). 또한 본 발명자는 대량 배양을 통해 획득한 CE 100균의 배양여과액의 대상 병원체에 대한 균사체 성장 억제 효과 및 포자 발아 억제 효과를 확인하였다. 상기 배양 여과액의 처리는 강한 D.citri포자 발아 억제효과를 나타낸다 (표 4, 도 16). 상기 결과는 포자발아 억제효과가 배양여과액에 포함된 다양한 항진균 대사 산물과 용해 효소 활성과 관련이 있음을 시사한다.
또한, 배양 여과액의 병원성 진균에 대한 억제 효과는 배양 5일차보다 7일차에서 더 높은 것을 알 수 있다(도 14). 강한 억제 수준은 긴 배양 기간 동안의 생체 활성이차 대사 산물(bioactive secondary metabolite)의 보다 높은 생산과 관련될 수 있다. 즉, 상기 결과는 실험실 수준의 배양과 비교해도 실제현장에서 이루어지는 배양법 또한 병원성 진균의 억제 활성을 가지는 대사산물이 충분히 생산된다는 사실을 보여준다.
현미경 관찰 결과 또한, 대량 배양을 통해 획득한 CE 100균 배양여과액을 처리한 D.citri의 경우 균사 구조가 공포가 형성되며 뒤틀리는 것을 보여준다.
다양한 농도의 바실러스 메가테리움(B. megaterium)배양 여과액은 알타나리아 알타나타(Alternaria alternate)의 포자 발아 및 균사체 성장 억제 효과를 나타낸다(Li etal. 2015). Li et al의 결과는 본 명세서의 결과와 일치한다. 현미경 관찰 결과 또한, 배양여과액을 처리한 알타나리아 알타나타(A. alternate)의 경우 균사 구조가 팽창 및 파열되고 비정상적인 포자 발아(작고 공포가 형성된)가 있음을 보여준다.
많은 연구에 따르면 미생물은 배양 중에 유기산을 생산한다(Jones, 1998; Magnuson &Lasure, 2004; Vyas & Gulati, 2009).
본 발명자는 CE 100균의 경우 소량배양의 경우보다 대량배양의 경우가 pH가 더 낮다는 사실을 밝혔다. 대량으로 배양하는 경우 초기 단계(5일차)에서의 pH 감소는 유기산의 분비와 관계 있을 수 있다. 낮은 pH를 통해 중온성 세균의 증식을 억제하고 이를 통해 오염을 방지할 수 있다.
생물방제균의 대량 배양은 고가의 배양기 및 배지 때문에 비용문제에서 제한이 있다.
생물방제균의 대량생산에 있어 적합한 배지의 조건은 저렴하고, 충분한 양의 대사산물을 생산가능하도록 효율적이여야 한다(lewis, 1991).
본 명세서에서 설명한 현장 적용이 가능한 CE 100균의 대량생산법은 오염이 없고, 충분한 세포 수, 및 충분한 대사 산물을 가질 수 있다.
본 명세서에서 설명한 CE 100균의 대량배양법은 가격대 성능비가 좋은 배양기 및 배지를 사용하는 배양법이다. 또한 현장에서 배양하는 동안 오염을 최소화할 수 있는 배양법이다.
본 명세서에서 설명한 CE 100 균의 대량 배양 동안 오염이 발생하지 않는 이유는 바실러스 CE 100균주가 배양과정에서 생성하는 활성 대사산물 및 배양과정동안 유지되는 낮은 pH에 의한 것이다.
또한, 일반적으로 미생물이 생존하기 어려운 환경인 고열 조건하에서 바실러스 CE 100균주는 생존가능 하기 때문에 고온에서 배양함으로써 다른 바람직하지 않은 미생물을 제거 가능하다.
따라서 멸균과정없이 오염을 최소화 가능한 것은 1) 고열 조건하에서 생존가능한 점 2) 생물활성 대사산물을 생성 3)배양과정에서 유지되는 낮은 pH 조건에 의해 이루어진다.
CE 100균 모두 희석율에 따라 감귤 나무 잎의 D.citri감염을 유의미하게 감소시켰다 (도 26). 희석율이 높을수록 표적 병원체 방제 효과는 낮게 나타났다.
본 발명자는 대조군과 비교했을 때 배양액 처리를 한 감귤나무의 경우 검은점무늬병 발생율이 낮다는 사실을 밝혀냈다(도 28). CE 100의 배양액의 전처리(엽면 살포)는 감귤 나무에서 검은점무늬병의 발생율을 감소시킨다.
상기 결과로부터, CE 100에 의해 분비되는 식물성 세포 및 다양한 대사산물이 D.citiri방제에 중요한 역할을 하는 것을 알 수 있다.
결과적으로, 본 발명은 저비용으로 반복적인 희석없이 쉽게 적용할 수 있는 CE 100균주의 대량 배양 방법에 관한 것이다. 본 발명의 배양 방법을 통해 바실러스 벨레젠시스 CE 100은 다양한 조건하에서 오염없이 충분한 양의 효소와 대사산물이 존재하도록 대량 배양 가능하다. 상기 대량 배양을 통해 제조된 배양액을 D.citri억제에 이용할 수 있다.
농업생명공학연구원 KACC81101BP 20190731
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Claims (7)

  1. 바실러스 벨레젠시스 (Bacillus velezensis) CE 100 KACC 81101BP.
  2. 제 1 항의 균주의 균체, 배양액, 배양여과액 또는 이들의 조합을 유효성분으로 포함하는 식물병원균 방제용 조성물.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 식물병원균은 다이아포르테 사이트리 (Diaporthe citri), 균핵병균 (Sclerotinia sclerotiorum), 스클레로티움 세피보룸(Sclerotium cepivorum), 잿빛 무늬 병원균 (Monilinia fructicola),보트리티스 시네레아 (Botrytis cinerea), 코레토트리쿰 아큐타툼 (Collectotrichum acutatum), 보트리오티니아 퍼켈리아나 (Botryotinia fuckeliana), 실린드로카폰 데스트럭탄스 (Cylindrocarpon destructans), 셉토리아 글리시네스 (Septoria Glycines), 글로메렐라 신굴레이트 (Glomerella cingulate), 푸사리움 솔라니(Fusarium solani), 리족토니아 솔라니 (Rhizoctonia solani), 피리쿨라리아 그리세아 (Pyricularia grisea), 파이토프토라 드레크슬레리 (Phytophthora drechsleri), 보트리오스페리아 도치데아 (Botryosphaeria dothidea), 콜레토트리쿰 글로에오스포리오이데스 (Colletotrichum gloeosporioides), 푸사리움 글라민아룸 (Fusarium grminearum), 파이토프토라 캡시사이 (Phytophthora capsici), 파이토프토라 니코티아나 (Phytophthora nicotianae), 알터나리아 포리 (Alternaria porri), 포마 속 (Phoma sp.), 파이토프토라 인페스탄스 (Phytophthora infestans) 및 펙토박테리움 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum)으로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 식물병원균 방제용 조성물.
  4. 다음의 단계를 포함하는 바실러스 벨레젠시스 CE 100 (KACC 81101BP) 균주의 대량 배양 방법:
    (a) 세균 배양용 배지 300 L 내지 700 L에 바실러스 벨레젠시스 CE 100(KACC 81101BP) 균주를 접종하는 단계;
    (b) 접종된 바실러스 균주를 배양하는 단계; 및
    (c) 단계 (b)의 결과물을 수득하는 단계.
  5. 제 4항에 있어서, 상기 (b) 단계는 30℃ 내지 50℃ 에서 배양하는 단계인 것인, 바실러스 벨레젠시스 CE 100(KACC 81101BP) 균주의 대량 배양 방법.
  6. 제 4항에 있어서, 상기 (b) 단계는 1일 내지 10일 동안 배양하는 단계인 것인, 바실러스 벨레젠시스 CE 100(KACC 81101BP) 균주의 대량 배양 방법.
  7. 제 4항에 있어서, 상기 (b) 단계는 pH 4 내지 9에서 배양하는 단계인 것인, 바실러스 벨레젠시스 CE 100(KACC 81101BP) 균주의 대량 배양 방법.
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