KR20230057289A - 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주를 포함하는 면역증강용 조성물 - Google Patents
바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주를 포함하는 면역증강용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 상기 균주의 면역증강 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주는 IL-2, IFN-γ, TNF-a 및 IL-1β로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상 사이토카인의 발현 및 혈청 IgA 또는 혈청 IgG의 생성 촉진을 통해 신체 내 내재 및 적응 면역을 모두 효과적으로 증진시킬 수 있으므로, 면역증강을 위한 식품, 건강기능식품, 사료, 의약품 및 피부 건강 소재 등으로 다양하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 상기 균주의 면역증강 용도에 관한 것이다.
인체의 면역증강은 평소 다양한 세균과 바이러스(세균성 감염질환, 감기, 에이즈 등)으로부터 우리 신체를 보호하는 것으로, 병원성을 일으키는 바이러스, 균 등 감염원에 대한 신체 조직의 방어 반응으로 정의되어 있다. 최근 몇 년 동안 여러 연구에서 유산균, 비티도박테리아 등의 면역증강 효과에 대한 보고가 많이 되고 있으나, 현재까지 보고된 유산균은 유산균의 생존력과 유통과정에서의 안전성이 문제가 되고 지속적인 관리와 모니터링이 필요한 한계점이 있다. 또한인체에서의 활력을 고려하여 최근에는 수십배의 함량이 증가된 고밀도의 제품이 생산되어 유통되고 있으나, 과량 균주에 의한 부작용이 보고되고 있어, 이러한 문제점을 해소할 수 있는 새로운 면역증강용 균주에 대한 필요성이 있다.
본 발명자들은 전통 발효 식품으로부터 유용 균주를 분리 연구하던 중, 분리 동정된 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2균주가 우수한 면역증강 효과를 나타냄을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은, 바실러스 밸레젠시스(Bacillus velenzensis) Kh2-2 균주(기탁번호 : KCTC14642BP)를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주, 이의 배양액, 이의 균체 또는 이들의 무세포 추출물을 포함하는 면역증강용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 바실러스 밸레젠시스(Bacillus velenzensis) Kh2-2 균주(기탁번호 : KCTC14642BP)를 제공한다.
또한 본 발명은 상기 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주, 이의 배양액, 이의 균체 또는 이들의 무세포 추출물을 포함하는 면역증강용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주, 이의 배양액, 이의 균체 또는 이들의 무세포 추출물을 포함하는 면역증강용 식품 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주, 이의 배양액, 이의 균체 또는 이들의 무세포 추출물을 포함하는 면역증강용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 상기 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주, 이의 배양액, 이의 균체 또는 이들의 무세포 추출물을 포함하는 면역증강용 사료 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주는 IL-2, IFN-γ, TNF-a 및 IL-1β로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상 사이토카인의 발현 및 혈청 IgA 또는 혈청 IgG의 생성 촉진을 통해 신체 내 내재 및 적응 면역을 모두 효과적으로 증진시킬 수 있으므로, 면역증강을 위한 식품, 건강기능식품, 사료, 의약품 및 피부 건강 소재 등으로 다양하게 활용될 수 있다.
도 1A는 바실러스 균주의 pH 2.0 조건에서 내산성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 1B는 바실러스 균주의 0.5% 담즙염 조건에서 내담즙성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 1C는 바실러스 균주의 베타-글루코시다제 활성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 1D는 RAW264.7 세포에서 바실러스 균주 균체의 세포 독성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 1E는 RAW264.7 세포에서 바실러스 균주 균체 처리에 따른 NO 생산량을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 1F는 RAW264.7 세포에서 바실러스 균체 처리에 따른 사이토카인 발현량을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2A는 대식세포에서 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체 처리에 따른 세포 분화 유도를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 2B는 RAW264.7 세포에서 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체 처리에 따른 사이토카인 mRNA 발현 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 2C는 ELISA를 통해 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체 처리에 따른 표적 사이토카인 단백질 발현 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 3A 및 B는 대식세포에서 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체 처리에 따른 MAPK 및 NF-κB 신호 전달 경로 관련 단백질 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4A는 마우스 비장세포에서 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체의 세포 독성을 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 4B는 마우스 비장세포에서 바실러스 벨레젠시스 Kh2-2 균체 처리에 따른 NO 생성량을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 4C는 마우스 비장세포에서 바실러스 벨레젠시스 Kh2-2 균체 처리에 따른 사이토카인 mRNA 생성량을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 4D는 마우스 비장세포에서 바실러스 벨레젠시스 Kh2-2 균체 처리에 따른 사이토카인 단백질 TNF-α, IFN-γ 및 IL-2의 단백질 발현량을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 5A는 in vivo 실헙을 위한 대조군 및 실험군을 나타낸 도이다.
도 5B는 면역억제 마우스에서 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주 또는 균체 처리에 따른 비장 및 흉선의 기관 인덱스를 나타낸 도이다.
도 5C는 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주 또는 이의 균체의 NK 세포 독성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5D는 면역억제 마우스에서 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주 또는 이의 균체 처리에 따른 비장세포 증식 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5E는 면역억제 마우스에서 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주 또는 이의 균체 처리에 따른 적응 면역 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5F는 면역억제 마우스에서 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주 또는 이의 균체 처리에 따른 혈청 IgA 및 IgG 함량을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6A 내지 C는 면역억제 마우스에서 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주 또는 이의 균체 처리에 따른 혈청 내 사이토카인 IL-2, IL-6 및 IFN-γ의 발현 수준을 나타낸 도이다.
도 7A 및 B는 면역억제 마우스에서 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주 또는 이의 균체 처리에 따른 MAPK 및 NF-κB 신호 전달 경로 관련 단백질 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8A는 면역억제 마우스에서 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주 또는 이의 균체 처리에 따른 결장 길이를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 8B는 면역억제 마우스 결장 조직에서 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주 또는 이의 균체 처리에 따른 표적화된 사이토카인에 대한 mRNA 발현 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 8C는 면역억제 마우스에서 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주 또는 이의 균체 처리에 따른 장내 미생물총의 공유 풍부성에 대한 벤 다이어그램 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 8D는 상기 도 8C의 벤 다이어그램에 기초하여, 각 그룹의 장내 미생물군의 문 수준에서의 분류학적 구성 분포를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8E는 상기 도 8D에 기초하여, 문 수준에서 상위 3개의 풍부한 장내 미생물총의 평균을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 8F는 상기 장내 미생물총 공유 풍부성 분석 결과에 기초하여, 각 그룹의 속 수준에서 장내 미생물군의 분류학적 구성 분포를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 1B는 바실러스 균주의 0.5% 담즙염 조건에서 내담즙성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 1C는 바실러스 균주의 베타-글루코시다제 활성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 1D는 RAW264.7 세포에서 바실러스 균주 균체의 세포 독성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 1E는 RAW264.7 세포에서 바실러스 균주 균체 처리에 따른 NO 생산량을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 1F는 RAW264.7 세포에서 바실러스 균체 처리에 따른 사이토카인 발현량을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 2A는 대식세포에서 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체 처리에 따른 세포 분화 유도를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 2B는 RAW264.7 세포에서 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체 처리에 따른 사이토카인 mRNA 발현 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 2C는 ELISA를 통해 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체 처리에 따른 표적 사이토카인 단백질 발현 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 3A 및 B는 대식세포에서 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체 처리에 따른 MAPK 및 NF-κB 신호 전달 경로 관련 단백질 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 4A는 마우스 비장세포에서 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체의 세포 독성을 조사한 결과를 나타낸 도이다.
도 4B는 마우스 비장세포에서 바실러스 벨레젠시스 Kh2-2 균체 처리에 따른 NO 생성량을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 4C는 마우스 비장세포에서 바실러스 벨레젠시스 Kh2-2 균체 처리에 따른 사이토카인 mRNA 생성량을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 4D는 마우스 비장세포에서 바실러스 벨레젠시스 Kh2-2 균체 처리에 따른 사이토카인 단백질 TNF-α, IFN-γ 및 IL-2의 단백질 발현량을 분석한 결과를 나타낸 도이다.
도 5A는 in vivo 실헙을 위한 대조군 및 실험군을 나타낸 도이다.
도 5B는 면역억제 마우스에서 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주 또는 균체 처리에 따른 비장 및 흉선의 기관 인덱스를 나타낸 도이다.
도 5C는 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주 또는 이의 균체의 NK 세포 독성을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5D는 면역억제 마우스에서 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주 또는 이의 균체 처리에 따른 비장세포 증식 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5E는 면역억제 마우스에서 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주 또는 이의 균체 처리에 따른 적응 면역 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 5F는 면역억제 마우스에서 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주 또는 이의 균체 처리에 따른 혈청 IgA 및 IgG 함량을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 6A 내지 C는 면역억제 마우스에서 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주 또는 이의 균체 처리에 따른 혈청 내 사이토카인 IL-2, IL-6 및 IFN-γ의 발현 수준을 나타낸 도이다.
도 7A 및 B는 면역억제 마우스에서 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주 또는 이의 균체 처리에 따른 MAPK 및 NF-κB 신호 전달 경로 관련 단백질 발현을 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8A는 면역억제 마우스에서 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주 또는 이의 균체 처리에 따른 결장 길이를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 8B는 면역억제 마우스 결장 조직에서 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주 또는 이의 균체 처리에 따른 표적화된 사이토카인에 대한 mRNA 발현 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 8C는 면역억제 마우스에서 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주 또는 이의 균체 처리에 따른 장내 미생물총의 공유 풍부성에 대한 벤 다이어그램 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 8D는 상기 도 8C의 벤 다이어그램에 기초하여, 각 그룹의 장내 미생물군의 문 수준에서의 분류학적 구성 분포를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
도 8E는 상기 도 8D에 기초하여, 문 수준에서 상위 3개의 풍부한 장내 미생물총의 평균을 비교한 결과를 나타낸 도이다.
도 8F는 상기 장내 미생물총 공유 풍부성 분석 결과에 기초하여, 각 그룹의 속 수준에서 장내 미생물군의 분류학적 구성 분포를 분석한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 양태에 따르면, 본 발명은 바실러스 밸레젠시스(Bacillus velenzensis) Kh2-2 균주(기탁번호 : KCTC14642BP)를 제공한다.
본 발명에 따른 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주는 전통 발효 인삼 음료로부터 분리된 균주로, 체내 섭취 시 안전한 균주이다. 상기 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주는 2021년 7월 22일에 생물자원센터에 특허기탁하였으며, 수탁번호 KCTC14642BP를 부여 받았다.
본 발명의 구체예에서, 상기 균주는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 것이 바람직하다. 상기 서열번호 1의 염기서열은 16S rDNA 유전자로, 균주를 동정할 때 사용한 부위이다.
본 발명의 구체예에서, 상기 균주는 내산성 또는 내담즙성을 갖는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 구체예에서, 상기 균주는 면역증강 활성을 갖는 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, 면역증강(Immunostimulation)은 암 및 염증 질환 등과 같은 다양한 질환에 대한 신체 방어 기전을 보강하는 중요한 치료학적 전략중 하나로서, 면역세포의 활성을 증가시켜 면역반응을 자극하여 면역증강 효과를 얻을 수 있다. 예컨대, 식세포들은 면역반응에서 주요한 역할을 수행하는데 대식세포에서의 주요한 역할인 식세포 작용은 미생물 및 기타 발열성 입자들을 흡수하고, 또한 종양괴사인자-α(tumor necrosis factor;TNF-α), 인터루킨-1β(interleukin; IL-1β), 인터루킨-12(interleukin; IL-12)와 같은 다수의 사이토카인(cytokin) 및 일산화 질소(nitric oxide; NO)과 같은 세포독성 및 염증성 물질을 분비함으로써 면역 반응을 자극시킨다. 따라서 대식세포 활성을 증가시키는 것이 면역증강을 위한 하나의 수단이 될 수 있다. 감염 및 질병의 발생은 면역 기능이 저하된 상태에서 주로 발생하기 때문에, 신체 면역체계의 기능이 저하된 경우 면역 증강 물질을 통해 이들 면역 반응을 증진시킬 수 있는 다양한 연구가 이루어지고 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 상기 면역은 내재 면역(innate immunity) 또는 적응 면역(adaptative immune)인 것이 바람직하며, 더 바람직하게는 내재 면역 및 적응 면역 모두를 의미하는 것일 수 있으나, 이에 본 발명의 범위가 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 바실러스 밸레젠시스(Bacillus velenzensis) Kh2-2 균주, 이의 배양액, 이의 균체 또는 이들의 무세포 추출물을 포함하는 면역증강용 조성물을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 배양액은 액체 배지에 균주를 접종하여 배양한 것을 의미하며, 배양액을 제거하고 균체만 PBS 등의 버퍼에 재부유시킨 것일 수 있다.
본 발명의 면역증강용 조성물은 약학적 조성물, 식품 조성물, 건강기능식품 조성물 또는 사료 조성물일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물인 경우, 상기 조성물은 약학적으로 유효한 양의 균체 및 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
상기에서 약학적으로 유효한 양이란, 면역증강 효과를 발휘하기에 충분한 양을 말한다. 상기 "약학적으로 허용되는"이란, 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다.
또한 본 발명에 따른 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 당해 기술 분야에 알려진 적합한 제제는 문헌(Remington's Pharmaceutical Science, 최근, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 것을 사용하는 것이 바람직하다. 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알 지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리 비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트, 광물 유 등이 있다. 상기 약학적 조성물을 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산 제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내 용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제 등이 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우 린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상에 의해 생각되는 조직계, 동물 또는 인간에서 생물학적 또는 의학적 반응을 유도하는 유효 성분 또는 약학적 조성물의 양인, 치료상 유효량으로 투여할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물에 대한 치료상 유효 투여량 및 투여횟수는 원하는 효과에 따라 변화될 것임은 당업자에게 자명하다. 그러므로, 투여될 최적의 투여 량은 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있으며, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효성분 및 다른 성분의 함량, 제형의 종류, 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 약학적 조성물은 1~10,000㎎/㎏/day, 바람직하게는 1~200㎎/㎏/day의 양으로 투여할 수 있으며, 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수 회에 나누어 투여할 수도 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다.
또한 본 발명의 조성물이 식품 조성물인 경우 상기 식품의 종류는 특별히 제한되지 아니하며, 통상적인 의미에서의 식품을 모두 포함할 수 있다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 비제한적인 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등을 들 수 있다. 상기 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 상기 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다.
본 명세서에서 식품이란 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며, 통상적인 의미이고, 상기 식품 조성물은 식품, 식품 첨가제, 건강 기능성 식품 및 음료를 모두 포함하는 의도이다.
본 발명의 조성물을 첨가할 수 있는 식품으로는 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 캔디, 차, 비타민 복합제, 기능성 식품 등이 있다. 추가로, 본 발명에서 식품에는 특수영양식품(예, 조제유류, 영, 유아식 등), 식육가공품, 어육제품, 두부류, 묵류, 면류(예, 라면류, 국수류 등), 건강보조식품, 조미식품(예, 간장, 된장, 고추장, 혼합장 등), 소스류, 과자류(예, 스넥류), 유가공품(예, 발효유, 치즈 등), 기타 가공식품, 김치, 절임 식품(각 종 김치류, 장아찌 등), 음료(예, 과실, 채소류 음료, 두유류, 발효음료류, 아이스크림류 등), 천연조미료(예, 라면 스프 등), 비타민 복합제, 알코올 음료, 주류 및 그 밖의 건강보조식품류를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 상기 식품, 음료 또는 식품첨가제는 통상의 제조방법으로 제조될 수 있다.
본 발명의 식품 조성물은 바람직하게는 건강기능식품일 수 있다. 상기 건강기능식품이란 건강보조의 목적으로 특정성분을 원료로 하거나 식품 원료에 들어있는 특정성분을 추출, 농축, 정제, 혼합 등의 방법으로 제조, 가공한 식품을 말하며, 상기 성분에 의해 생체 방어, 생체리듬의 조절, 질병의 방지와 회복 등 생체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발휘할 수 있도록 설계되고 가공된 식품을 말하는 것으로서, 면역증강 등과 관련된 기능을 수행할 수 있는 것을 말한다.
본 발명에 따른 균주를 건강기능식품으로 사용하는 경우, 이를 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용될 수 있고, 이는 필요에 따라 선택하여 적절하게 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 균체 안전성이 보장되며, 농도 비례하여 활성 증가 효과를 나타내므로, 특정범위로 제한하지 않고 적절한 양으로 사용할 수 있음은 자명하다.
또한, 본 발명에 따른 균주가 사용될 수 있는 건강기능식품의 종류에는 특별한 제한이 없다. 예컨대, 라면, 기타 면류, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료, 각종 스프, 육류, 소세지, 빵, 초코렛, 캔디류, 과자류, 피자, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 또는 비타민 복합제 등이 있다.
특히, 본 발명에 따른 균주는 면역증강을 목적으로 하는 다양한 식품류에 추가되어 기능을 나타낼 수 있고, 통상의 기술자의 선택에 따라 통상적으로 건강기능식품에 함유될 수 있는 적절한 기타 보조성분과 공지의 첨가제와 혼합하여 사용할 수 있다. 상기 공지의 첨가제에는 본 발명에 따른 균주와 함께 사용할 수 있는 다른 미생물도 포함된다.
본 발명의 조성물이 면역증강용 사료 조성물은 사료첨가제 또는 배합사료일 수 있다.
본 발명에 있어서, “사료첨가제”는 영양적 또는 특정 목적을 위하여 사료에 미량으로 첨가되는 물질을 의미하는 것으로서, 본 발명의 기능성 사료첨가제는 균주를 유효 성분으로 포함할 수 있다. 상기 유효 성분은 공지의 사료 첨가물들과 일정 비율로 배합될 수 있다. 배합되는 경우 본 발명의 유효 성분은 사료첨가제 전체 중량에서 0.01 내지 99 중량%가 적용될 수 있다.
또한 본 발명의 사료 조성물은 배합사료 100중량부에 대하여 균주를 포함할 수 있다. 배합사료의 일 예로 옥수수 53.71중량%, 대두박 23.2중량%, 채종박 1.0중량%, 옥배아박 2.0중량%, 주정박 3.0중량%, 소맥피 2.7중량%, 감자전분 0.3중량%, 유지 2.8중량%, 탄산칼슘 9.9중량%, 제2인산칼슘 0.68중량%, 염화나트륨 0.23중량%, 인 분해효소제 0.03중량%, 염화콜린 0.05중량%, 메치오닌 0.2중량%, 미네랄 믹스 0.1중량%, 비타민 믹스 0.1중량%로 조성된다. 이외에도 통상적인 양계용 배합사료가 이용될 수 있음은 물론이다. 또한, 배합사료는 사육대상인 가축의 종류에 따라 소, 돼지, 오리 등의 배합사료가 이용될 수 있음은 물론이다.
상기 사료 조성물을 급이하여 가축을 사육할 수 있으며, 가축의 사육 시 본 발명의 균주를 물에 희석하여 식수로 제공될 수 있다. 이때 물 100ℓ에 유효성분(본 발명의 균주, 이의 배양액, 이의 균체 또는 이들의 무세포 추출물) 100 내지 500㎖가 적용될 수 있다.
본 발명의 사료 조성물은 당업자가 예상할 수 있는 범위 내의 다른 기타 영양성분을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 균주는 상업적으로 통상적인 동물 사료 조성물 내로 혼입될 수 있고, 예를 들어, 소, 돼지, 양, 가금류 등에 공급될 수 있다. 이를 위해 본 발명의 균주, 이의 배양액은 통상적인 동물 사료 구성 성분들과 혼합될 수 있고, 필요하다면 정제된 형태로 가공될 수 있다. 통상적인 동물 사료 구성성분은 예를 들어, 옥수수, 보리, 귀리, 대두, 어분, 겨, 대두유, 무기물, 미량 원소, 아미노산 및 비타민이다.
중복되는 내용은 본 명세서의 복잡성을 고려하여 생략하며, 본 명세서에서 달리 정의되지 않은 용어들은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것이다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
[실험방법]
실험재료
LB 브로스와 한천은 BECTON DICKINSON & COMPANY(B.D., Franklin Lakes, New Jersey, USA)에서 구입하였다. RAW264.7 및 YAC-1 세포주는 한국 세포주 은행(한국 서울)으로부터 구입하여 사용하였다. RPMI 1640 배양 배지, DMEM 배지, 페니실린(100 mg/mL)-스트렙토마이신(100U/mL) 및 우태아 혈청(FBS)은 GenDEPOT(Katy, TX, USA)에서 구입하여 사용하였고, MTT, DMSO, CTX(Cyclophosphamide), LMS(Levamisole hydrochloride)는 Sigma(St. Louis, MO, 미국)에서, LIVE/DEAD 세포 생존력 분석 염색은 Thermo Fisher Scientific(Thermo Scientific, USA)에서 구입하여 사용하였다. 모든 프라이머는 마크로젠(대한민국 서울)에서 디자인되었다. 모든 화학 물질과 시약은 시약 등급의 품질이며 상업적으로 이용 가능한 것을 이용하였다.
세포 및 동물 실험 방법
시험관 내 실험을 위해 RAW 264.7 세포를 페니실린(100mg/mL)-스트렙토마이신(100 U/mL) 및 10 % FBS가 보충된 DMEM 배지에서 배양하였다. 배양된 세포는 5% CO2가습기에서 37 ℃에서 배양하였다.
생체 외 실험을 위해, 자궁경부 탈구에 의해 BALB/c 마우스(4 주령)로부터 비장을 무균적으로 제거하였다. 또한, 10ml 주입 주사기의 플런저를 사용하여 조직을 부드럽게 균질화한 후 6겹의 거즈를 통과시켜 단일 세포가 되도록 하였다. 적혈구 용해 완충액(Sigma-Aldrich, MO, USA)을 사용하여 적혈구를 제거하고 부유 비장 세포를 PBS로 3 회 세척한 후 1200rpm에서 3 분 동안 원심분리하였다. 비장 세포에서 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2의 증식 촉진은 WST-8 세포 생존 어세이 키트를 BIOMAX(대한민국 서울)에서 구입하여 평가하였다. 비장 세포를 콘카나발린 A(ConA) 또는 다양한 농도의 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체(25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600 μg/mL)과 함께 1x106세포/웰의 밀도로 96- 웰 플레이트에 접종하고 48시간 동안 배양하였다. 10 μL의 WST-8 용액을 100 μL 세포 배양 배지에 첨가하고, 플레이트를 2 시간 동안 배양하였다. 광학 밀도 값은 SpectraMax ABS Plus 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 450nm에서 기록하였다.
SPF 등급의 수컷 ICR 마우스(6 주령, 25-27g)를 OrientBio에서 구입하여 사용하였다. 모든 마우스는 23-27℃ 온도 및 50% -70 %의 습도 조건에서 12 시간 조명: 12 시간 어두운 주기로 유지된 환경에서 유지시켰다. 모든 마우스에게 표준 사료와 물을 지속적으로 공급하였으며, 모든 실험은 실험 동물 관리 원칙(NIH 간행물 # 80-23, 1996 년 개정)과 경희대학교 동물 관리 및 사용 지침(승인 번호 KHGASP-20-375)에 따라 절차를 수행하였다. 1주 적응 기간 후, 마우스를 다음과 같이 7 개의 그룹으로 무작위로 나누었다:
| 대조군(Con) | 멸균 식염수를 사용한 CTX 미처리군 |
| 모델군(CTX) | 멸균 식염수와 CTX 처리군 |
| Kh2-2 | 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주 106 CFU/mL처리군 |
| Kh2-2 ly | 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체 106 CFU/mL처리군 |
| LMS | 레바미솔 염산염으로 처리된(40mg/kg) CTX 처리군(양성 대조군) |
Con 그룹을 제외한 모든 마우스에 멸균 식염수 내 CTX를 체중당 80 mg/kg으로 1 일 1 회 연속 3 일 동안 함께 복강 내 주사하여 면역 억제를 유도하였다. 마우스에게 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 또는 이의 균체, 또는 LMS를 20 일 동안 매일 1 회 경구 투여하였다. 이후 모든 마우스를 안락사시키고 혈액을 수집한 후 3000rpm, 4℃에서 15 분 동안 원심분리하여 혈청을 수집한 다음 생화학적 분석을 위해 -80℃에 보관하였다. 한편, 생화학적 마커 분석을 위해 신선한 비장 및 흉선 조직 샘플을 수확하고 -80℃에서 유지하였다.
ELISA 분석 방법
In vitro 및 ex vivo 실험을 위하여, RAW264.7 세포와 비장 세포를 96 웰 플레이트에 분주한 후 다양한 농도의 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체 및 LPS 또는 ConA를 각각 처리하였다. 배양 상층액 100 μl를 세포 배지로부터 수득하여 제조업체(R & D Systems)의 지침에 따른 ELISA를 사용하여 TNF-α, IL-1β, IL-2 및 INF-γ의 분비를 평가하였다.
in vivo 실험을 위해, 20 분 동안 1000 rpm으로 전혈로부터 마우스 혈청을 분리하였고, 혈청 내 TNF-α, IL-1β, IL-2, INF-γ(R & D Systems, Minneapolis, MN, USA) 및 IgG 및 IgA(Elabscience Biotechnology Co., Texas, USA)의 함량을 ELISA 키트로 측정하였다.
qRT-PCR 분석 방법
총 mRNA는 각각 Trizol 시약 키트 지침(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 의해 RAW264.7 세포, 비장 세포 및 마우스 비장 및 흉선 기관에서 수득하였다. 먼저, 총 RNA 500ng을 amfiRivert cDNA Synthesis Platinum Enzyme Mix(GenDEPOT, Katy, TX, USA)로 역전사하였으며, 반응은 SYBR PremixExTaqTM II(TaKaRa)와 함께 CFX96TM Real-Time RT-PCR 시스템을 사용하여 수행하였다. qRT-PCR은 amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix(GenDEOT, TX, USA)를 사용하여 20 μL 반응 부피에서 50 ng cDNA를 사용하여 수행하였고, qRT-PCR에 유전자 특이적 프라이머 서열을 표 1에 나타내었다. 유전자 발현은 GAPDH를 사용하여 정규화하였다.
| Primer | Sequence | |
| GAPDH | Forward | 5’-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3’ |
| Reverse | 5’-CCA CCA CCC TGT TGC TGT AG-3’ | |
| iNOS | Forward | 5’-AAT GGC AAC ATC AGG TCG GCC ATC ACT-3’ |
| Reverse | 5’-GCT GTG TGT CAC AGA AGT CTC GAA CTC-3’ | |
| TNF-α | Forward | 5'-AGC CCACGTCGTAGCAAACCACCAA-3' |
| Reverse | 5'-AAC ACC CAT TCC CTT CAC AGA GCA AT-3' | |
| IL-1β | Forward | 5'-TGC AGA GTT CCC CAA CTG GTA CAT C-3' |
| Reverse | 5'-GTG CTG CCT AAT GTC CCC TTG AATC-3' | |
| IFN-γ | Forward | 5’-TAT CTC TTT CTA CCT CAG AC-3’ |
| Reverse | 5’-GCA ATC ACA GTC TTG GCT AAT TAG-3’ | |
| IL-2 | Forward | 5’-CCT GAG CAG GAT GGA GAA TTA-3’ |
| Reverse | 5’-TCC AGA ACA TGC CGC AGA G-3’ | |
| IL-10 | Forward | 5’-TAGAGCTGCGGACTGCCTTCA-3’ |
| Reverse | 5’-GGTCTTCAGCTTCTCACCCAG-3’ | |
| IL-4 | Forward | 5’-TGATCACAACATTGCATTTCA-3’ |
| Reverse | 5’-ACACCAGATTGTCAGTCACTTG-3’ | |
면역블랏 분석
비장을 Pierce ™ RIPA Buffer(Thermo Fisher Scientific, Rockford, USA)를 이용하여 1 시간 동안 용해하였다. 비장 세포 균체를 12,000 rpm 및 4℃ 에서 20 분 동안 원심 분리하였고, 동일한 양(50 ㎍)의 총 단백질을 10 % SDS-PAGE에 로드하고 PVDF 막으로 옮겼다. 막을 PBST에서 5% 탈지유로 1 시간 동안 차단한 다음 1 차 항체와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 세척 후, 막을 각각의 2 차 항체와 함께 1 시간 동안 배양하였다. 면역 반응 밴드를 확인하고 Image J 소프트웨어를 사용하여 정량화하였다.
동물 및 생체 내 실험 설계
무게 28-30*?*g(나이, 4주)의 수컷 ICR 마우스는 Orient Bio Inc.(한국 성남)에서 구입하였다. 마우스는 자유롭게 음식과 물이 제공되는 통제실에서, 습도 23 ± 2°C에서 12시간 명암 주기로 수용되었다. 모든 실험은 경희대학교 동물연구소 동물관리위원회(KHUASP(SE)-14-040)의 승인을 받아 수행되었으며, 실험동물의 관리 및 사용에 관한 지침에 따라 수행되었다.
일주일 동안 적응시킨 후, 마우스를 대조군(CON), 모델 대조군(CTX), 양성 대조군(LMS), Kh2-2 및 Kh2-2 균체 그룹의 5개 그룹으로 무작위로 나누었다. 다음 23일 동안 모든 마우스는 멸균수와 사료에 자유롭게 접근하도록 했다. 처리 첫 날부터 대조군의 마우스를 제외한 모든 마우스에 60 mg/(kg·d) CTX를 3일 연속 복강 내 주사하여 면역억제 마우스 모델을 개발하였다. 대조군의 동물은 멸균 식염수(대조군)를 주사했다. 이어서, CON 및 CTX 그룹에 PBS(100 μL/d)를 경구 투여하였다. Kh2-2 및 Kh2-2 균체 상등액 그룹에는 Kh2-2 세포(1 × 106 CFU/mL) 및 Kh2-2 균체(1 × 106 CFU/mL)을 10 mL/kg/의 부피로 경구 투여했다. 마우스를 매일 모니터링하였다. 모든 동물은 12시간 동안 엄격하게 금식시킨 후 에테르를 흡입하여 완전히 마취시킨 후 희생시켰다. 희생된 마우스의 혈액, 흉선, 비장 및 결장은 추가 연구를 위해 즉시 채취하였다. 기관 지수(organ index)는 다음 공식으로 계산하였다.
장기 중량비(%) = 장기 중량(g) / 체중(g) × 100%
비장세포의 증식 및 자연살해(NK) 세포의 세포독성
비장 세포 증식 분석을 위해 무균 조건 하에 희생된 마우스로부터 비장을 수집하였다. 비장세포를 수집한 후, 이를 96웰 플레이트에 도말했다. 비장세포 증식은 각각 LPS 및 Con A를 사용한 WST-8 분석을 사용하여 평가하였다. 30분 후 450 nm에서 분광광도계 마이크로플레이트 판독기에서 흡광도를 측정했다(SpectraMax® ABS plus).
비장 세포에서 NK 세포의 세포 독성을 측정하였다. 구체적으로, 표적 세포인 림프모세포 YAC-1 세포(2×105 cells/well)는 NK 세포 활성 분석을 검출하기 위해 5시간 동안 96-well 플레이트에서 비장세포(eector cells, 2×106 cells/well)와 공동 배양되었다. YAC-1 세포의 생존력은 WST-1 분석 키트를 사용하여 평가되었고, NK 세포 세포독성은 다음 공식에 의해 계산되었다.
NK 세포 세포 독성(%) = (T-(S-E))/T, (T는 표적 세포의 OD 값, S는 테스트 샘플의 OD 값, E는 효과기 세포의 OD 값)
지연형 과민증(Delayed-type hypersensitivity, DTH) 분석
마우스의 배 털을 면도한 후, 20 μL 1% 디니트로플루오로벤젠(dinitrofluorobenzene, DNFB)을 감작화를 위해 도포했다. 감작 과정은 24시간 후에 반복했다. 4일 후, DNFB를 마우스의 각 오른쪽 귀에 24시간 동안 도포했다. 각 마우스의 양쪽 귀에 해당 부위에 5mm 구멍을 뚫어 각 귀 부위의 무게를 기록하였다. 귀 부종 정도는 각 마우스의 왼쪽 귀와 오른쪽 귀의 무게 차이로 표시했다.
High throughput sequencing 및 생물정보학 분석
각 그룹에서 무작위로 선택된 5마리 마우스의 신선한 대변 샘플을 액체 질소에서 신속하게 동결했다. 장기 보존을 위해 대변 샘플을 -80℃에서 보관했다. 토양용 FastDNA Spin Kit(MP Biomedicals, CA, USA)를 사용하여 대변 샘플에서 게놈 DNA를 추출했다. 16S rDNA의 V3 및 V4 영역은 이전 연구에 따라 범용 프라이머를 사용한 PCR을 사용하여 게놈 DNA에서 증폭시켰고, ChunLab, Inc.(서울, 한국)에 의해 제조업체의 지침에 따라 Illumina MiSeq Sequencing system(Illumina, USA)으로 시퀀싱했다. 생성된 고품질 시퀀스는 추가 생물정보학 분석을 위해 EzBioCloud 16S 기반 MTP(천랩의 생물정보학 클라우드 플랫폼)를 사용하여 OTU(operational taxonomic unit)로 분류했다. 마지막으로 종 수준은 OTU 상동성에 따라 클러스터링했다.
통계적 분석
모든 실험 데이터는 평균 ± SD로 나타냈으며, 4 개 그룹 간의 통계적으로 유의 한 차이는 일원 분산 분석(ANOVA)에 이어 Tukey-Kramer 테스트를 사용하여 평가하였다. 통계 그래프는 GraphPad Prism 8를 이용하여 나타내었다.
[실시예]
실시예 1. 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2의 분리 정제 및 균체 제조
대한민국 용인의 전통 발효 인삼 음료로부터 균주를 분리하였다. 분리된 균주의 16S rRNA 염기 서열을 기반으로 한 계통수 분석 결과, 분리 균주가 바실러스 밸레젠시스 속인 것으로 확인되었으며, 종래 알려진 균주와 상이한 16S rRNA 서열을 갖는 새로운 균주인 것을 확인하였으며, 이를 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2라 명명하였다. 상기 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2를 생물자원센터에 2021년 7월 22일자로 기탁하고 KCTC14642BP 번호를 부여받았다. 해당 균주의 유전자 분석을 수행한 16S rRNA 서열은 서열번호 1로 표시된다.
후술되는 실험에는 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2의 균체를 사용하였다. 상기 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체를 제조하기 위하여, 균주를 600 nm에서 1.2Å의 광학 밀도에 도달할 때까지 36℃에서 24 시간 동안 100 mL LB 배지에서 배양 후, 배지를 제거하고, PBS 세척을 3 회 반복한 다음 동결 건조를 위해 펠릿으로 현탁하였다.
또한 후술되는 실험의 대조군으로는 Kh2-1, Kh8-3 및 Kh3-1 균주를 이용하였다. Kh2-1, Kh8-3 및 Kh3-1 균주는 Kh2-2 균주 분리 시 함께 분리된 균주이다.
실시예 2. 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2의 특성 분석
바실러스 밸레젠시스 Kh2-2의 내산성, 내담즙성 및 베타-글루코시다제 활성을 확인하였다.
2.1 내산성
바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주를 pH 2.0인 MRS 배지에서 3, 6 및 12시간 동안 배양한 후 생존율을 확인하였다. 산성 조건에서 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2의 생존율을 확인한 결과는 도 1A에 나타내었다.
도 1A에 나타낸 바와 같이, 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2는 산성 조건에서 생존율이 높은 것을 확인하였다. 이는 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2가 내산성이 우수하다는 것을 의미한다.
2.2 내담즙성
바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주를 0.5% 담즙염을 포함하는 MRS 배지에서 3, 6 및 12시간 동안 배양한 후 생존율을 확인하였다. 상기 조건에서 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2의 생존율을 확인한 결과는 도 1B에 나타내었다.
도 1B에 나타낸 바와 같이, 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2는 담즙염 존재 하에서도 생존율이 높은 것을 확인하였다. 이는 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2가 내담즙성이 우수하다는 것을 의미한다.
2.3 베타-글루코시다제 활성
바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주의 베타-글루코시다제 활성을 분석하였다. 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주는 bile esculin을 가수분해하고, 유리당을 에너지로 사용하여 esculetin을 배지로 방출한다. 그 후 구연산 제2철과 반응하여 페놀성 철 착물을 형성하는데, 이 때 콜로니의 색상이 짙은 갈색으로 변한다. 베타-글루코시다제 활성을 분석한 결과는 도 1C에 나타내었다.
도 1C에 나타낸 바와 같이, Kh2-2 및 Kh3-1 균주는 베타-글루코시다제 활성을 나타내었고, 이는 콜로니가 흑색으로 변화된 것으로 확인된다. 상기 결과는 Kh2-2 및 Kh3-1 균주가 bile esculin 배지에서 성장했다는 것을 시사한다. 담즙염을 가수분해하는 능력은 미생물이 장내 미생물총의 균형을 유지하는데 도움을 줄 수 있다.
실시예 3. 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2의 세포 독성 확인
RAW264.7 세포에서 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체의 세포 독성을 조사하였다. 구체적으로, LIVE/DEAD 염색 키트(L-3224, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체를 RAW264.7 세포를 처리한 후, 세포 독성을 확인하였다. 키트의 Calcein AM 및 ethidium homodimer-1 혼합은 죽은 세포에 대해서는 적색(Ex 528 nm, Em 617 nm) 및 살아있는 세포에 대해서는 녹색(Ex 495 nm; Em 515 nm)으로 나타나 세포 간의 차이를 분석한다. RAW264.7 세포를 플레이팅하고 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체를 25 μg/mL, 50 μg/mL 및 100 μg/mL, 및 LPS(1μg/mL)을 처리한 후, 배양하였다. 24시간 배양 후 염료를 배지에 용해시키고 30 분 동안 배양하였다. Leica DMLS Clinical Microscope(Leica, Wetzlar, Germany)로 세포를 확인하여 세포 독성을 확인하였다. 세포 독성을 확인한 결과는 도 1D에 나타내었다.
도 1D 에 나타낸 바와 같이, 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체는 세포 독성이 거의 없는 것을 확인하였다.
세포 독성 분석 후, 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체 처리가 NO 생산 및 사이토카인(iNOS) 분비에 미치는 영향을 확인하였다. NO 생산 및 사이토카인 분비를 확인한 결과는 도 1E 및 F에 각각 나타내었다.
도 1E에 나타낸 바와 같이, 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체 처리군은 농도 의존적으로 NO 생산을 유도하는 것을 확인하였다. 이는 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2가 RAW264.7 세포의 대식세포에서 사이토카인 분비를 향상시킬 수 있음을 보여주는 결과이다.
도 1F에 나타낸 바와 같이, 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체 처리군은 iNOS의 발현이 현저히 증가된 것을 확인하였다. 상기 결과는 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체 처리에 따라 사이토카인의 분비가 증가된다는 것을 뒷받침한다.
실시예 4. 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체의 RAW264.7 세포 분화 유도 확인
바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체를 RAW264.7 세포에 다양한 농도(25, 50, 100 μg/ml)로 처리한 후 세포 분화 유도 여부를 형광이미지를 통해 확인하였으며, 그 결과는 도 2A에 나타내었다.
도 2A에 나타낸 바와 같이, 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체는 RAW264.7 세포에서 세포 크기를 증가시키고, 위족(도 2A의 노란 화살표)을 신장시켜 분화를 유도하는 것을 확인하였다. 상기 결과는 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체가 세포 독성 없이 세포의 분화를 유도할 수 있음을 의미한다.
실시예 5. 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체 처리에 따른 사이토카인 발현 분석
바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체를 RAW264.7 세포에 다양한 농도(25, 50, 100 μg/ml)로 처리한 후, 사이토카인 IL-6, TNF-α 및 IL-1β의 mRNA 발현을 분석하였다. 사이토카인 mRNA 분석 결과는 도 2B에 나타내었다.
도 2B에 나타낸 바와 같이, 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체는 LPS 처리에 의해 증가된 IL-6, TNF-α 및 IL-1β의 mRNA 발현을 감소시키는 것을 확인하였다.
상기 사이토카인 mRNA 발현 분석 결과에 기초하여, 각 표적 사이토카인의 단백질 발현을 ELISA를 통해 측정하였다. 사이토카인의 단백질 IL-6, TNF-α 및 IL-1β의 단백질 발현을 분석한 결과는 도 2C에 나타내었다.
도 2C에 나타낸 바와 같이, 균체만 처리하여도 농도 의존적으로 면역증강 효과가 우수한 것을 확인하였다.
실시예 5. 대식세포에서 NF-κB 및 MAPKs 신호전달 경로에 대한 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체의 효과
NF-κB 신호 전달은 사이토카인 유전자 발현의 중요한 조절 인자이며 항 염증 치료 중재에 중요한 역할을 하며, MAPK를 활성화함으로써 세포 성장과 분화에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 또한, 사이토카인에 대한 세포 반응과 TNF-α, IL-2, IFN-γ와 같은 유전자의 관련 발현을 조절한다. 따라서 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체가 사이토카인 발현 조절에서 신호전달 경로에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 신호전달 경로 관련 단백질(ERK, p38, JNK, p65 및 IκBα) 및 이들의 인산화 단백질 양을 분석하였다. 단백질 발현을 분석한 결과는 도 3A 및 B에 나타내었다.
도 3A 및 B에 나타낸 바와 같이, LPS 처리군에서는 NF-κB 신호 및 MAPK 단백질의 활성화가 크게 증가(즉, 면역 증강)되는 것을 확인하였다. 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체 처리군은 인산화된 NF-κB, IκBα 및 인산화된 JNK, ERK, p38의 단백질 발현이 농도의존적으로 증가되는 것을 확인하였다. 상기 결과는 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체만 처리하여도, LPS처럼 면역 증강 효과가 우수한 것을 의미한다.
실시예 6. 마우스 비장세포에서 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2의 면역자극 효과
마우스 비장세포에서 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체의 세포 독성을 조사하였으며, 그 결과는 도 4A에 나타내었다.
도 4A에 나타낸 바와 같이, 바실러스 벨레젠시스 Kh2-2 균체는 마우스 비장세포에서 세포 독성을 나타내지 않는 것을 확인하였다.
세포 독성 조사 후 바실러스 벨레젠시스 Kh2-2 균체 처리에 따른 NO 생성량을 분석하였다. NO 생성량을 분석한 결과는 도 4B에 나타내었다.
도 4B에 나타낸 바와 같이, 바실러스 벨레젠시스 Kh2-2 균체 처리군은 농도 의존적으로 NO 생성량이 증가하는 것을 확인하였다.
바실러스 밸레젠시스 Kh2-2가 파라프로바이오틱스로서 비장 세포에서 면역관련 사이토카인 생성 역시 유도할 수 있는지 여부를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 구체적으로, 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체를 마우스 비장 세포에 다양한 농도(25, 50, 100 μg/ml)로 처리한 후, 사이토카인 IFN-γ, IL-2, TNF-α, IL-4, IL-6 및 IL-10의 mRNA 발현을 분석하였다. 사이토카인 mRNA 분석 결과는 도 4C에 나타내었다.
도 4C에 나타낸 바와 같이, 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체는 IFN-γ, IL-2, TNF-α, IL-4, IL-6 및 IL-10의 mRNA 발현을 증가시키는 것을 확인하였다.
상기 사이토카인 mRNA 발현 분석 결과에 기초하여, 각 표적 사이토카인의 단백질 발현을 ELISA를 통해 측정하였다. 사이토카인 단백질 TNF-α, IFN-γ 및 IL-2의 단백질 발현을 분석한 결과는 도 4D에 나타내었다.
도 4D에 나타낸 바와 같이, 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체는 사이토카인 단백질 TNF-α, IFN-γ 및 IL-2의 단백질 발현을 대조군(CON)에 비해 증가시키는 것을 확인하였다. 특히, IFN-γ는 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체의 농도에 의존적으로 발현이 증가한 것을 확인하였다.
실시예 6. 면역억제 마우스에서 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주 및 이의 균체의 면역증강 효과 확인
도 5A에 기재된 대조군 및 실험군으로, 후술되는 In vivo 면역 실험을 수행하였다. 구체적으로, 실험군은 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주(106 CFU/mL 처리군)를 처리한 그룹; 및 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주 균체(106 CFU/mL 처리군)을 처리한 그룹;으로 나누어 수행하였다. 시클로포스포아민(CTX)-유도된 면역억제 마우스를 이용하였고, 양성 대조군으로는 LMS 50mg/kg 처리군을 이용하였다.
6.1 기관 인덱스 및 선천 면역 효과 확인
바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체가 면역 조절 효과를 나타낼 수 있음을 보여주는 결과에 기초하여, 이의 면역 조절 효과를 in vivo에서 추가적으로 확인하였다. 마우스의 체중은 실험 동안 매일 측정하였으며, 적응 기간 1주일 후 초기 체중에서는 유의한 변화가 관찰되지 않았다. 그러나, 대조군 그룹을 제외한 나머지 5마리 면역 억제 마우스 군은 대조군과 비교하여, CTX 처리 후 체중이 감소되는 것을 확인하였다. 그러나 CTX 처리군과 달리 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2균체 처리군에서는 전체 실험 기간 동안 체중의 변화가 관찰되지 않았다.
면역 관련 기관인 비장 및 흉선에서 기관 인덱스를 확인하고 그 결과를 도 5B에 나타내었다.
도 5B에 나타낸 바와 같이, CTX에 의한 면역학적 장애에 대한 간접적 지표로 고려될 수 있는, 비장 및 흉선의 기관 인덱스는 CTX 처리에 따라 감소되었다. 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체 처리에 따라 회복되는 것을 확인하였고, 양성 대조군으로 사용된 LMS 처리군보다 더 나은 기관 인덱스 회복 효과를 확인하였다. 상기 결과는 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주가 마우스에서 CTX에 의해 유도된 위축성 면역 기관에 효과를 나타낼 수 있음을 의미한다.
6.2 NK 세포 활성 증진 효과 확인
바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주가 감염을 조절하고 면역 조절 역할을 하는 선천 면역 시스템의 효과기 림프구인 NK 세포 활성에도 영향을 미칠 수 있는지 여부를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 비장 세포 현탁액을 제조하기 위하여, 최종 밀도가 1 x 106 세포/mL가 되도록 완전 RPMI-1640 배지 용액 내 현탁하여 96-웰 플레이트 상에 위치시켰다. NK 세포 활성 분석을 위해 YAC-1 세포를 표적 세포로 사용하고 비장 세포(이펙터 세포)와 함께 배양하였다. 비장 세포 현탁액을 YAC-1 세포(1 x 105 세포/mL)에 첨가하여 96-웰 플레이트에서 10 : 1의 효과기 대 표적 세포 비율을 얻었다. 450nm에서 WST-8 검출 키트 및 마이크로플레이트 리더를 사용하여 세포 생존력을 평가하였다. RPMI 1640 배지를 대조군으로 사용하였다. NK 세포 독성은 하기 수식을 통해 계산하였다.
NK 세포 독성(%) = (ODT- (ODS-ODE)) / ODT
* ODT는 표적 세포 대조군의 흡광도, ODS는 테스트 샘플의 흡광도, ODE는 효과기 세포 contrtols의 흡광도.
NK 세포에 대한 독성을 분석한 결과는 도 5C에 나타내었다.
도 5C에 나타낸 바와 같이, 대조군(Con) 마우스와 비교하여, CTX 처리된 마우스는 NK 세포 활성이 현저히 감소되었으며, 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체를 처리한 마우스에서는 감소된 NK 세포 활성이 뚜렷하게 회복되는 것을 확인하였다. 상기 결과는 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주 또는 균체가 CTX-유도된 선천 면역 억제에 대하여 효과를 나타낼 수 있음을 의미한다.
6.3 비장세포 증식 효과 확인
CTX 처리된 마우스에 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체를 처리한 후, 이들이 비장 증식을 유도할 수 있는지 확인하였다. 비장세포 증식 효과를 확인한 결과는 도 5D에 나타내었다.
도 5D에 나타낸 바와 같이, CTX 처리군에서는 비장 세포의 증식이 현저히 억제되었으나, 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주 또는 균체 처리군은 CTX 처리군에 비해 비장 세포의 증식이 현저히 증가된 것을 확인하였다.
6.3 적응면역 효과확인
지연성 과민증(Delayed hypersensitivity, DTH)은 개인의 기억 T 세포 기능을 반영하는 전형적인 세포 매개 면역 반응을 의미한다. 지연성 과민증 반응을 통해 적응 면역 효과를 평가하기 위하여 마우스의 복부 털을 제거하고 20 μL의 1 % 디니트로플루오로벤젠(DNFB)을 이용하여 마우스를 감작시켰으며, 감작 과정을 24 시간 후에 반복하였다. DNFB를 4 일 후 오른쪽 귀에 도포하였다. 24 시간 반응 후 모든 마우스의 양쪽 귀를 해당 부분에 5 mm 구멍으로 펀칭하고 각 귀 부분의 무게를 기록하였고, 귀 부종의 정도를 각 마우스의 왼쪽 귀와 오른쪽 귀의 무게 차이로 표시하였다. 적응 면역 효과를 평가하기 위하여, 각 실험군에서 귀 부종의 변화를 확인하였고, 그 결과를 도 5E에 나타내었다.
도 5E에 나타낸 바와 같이, CTX를 주입한 군에서는 대조군(Con) 군에 비하여, 귀 부종으로 확인되는 DTH 반응이 하향 조절되었다. 귀 부종의 정도는 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주 또는 균체 처리군에서 회복되었으며, 이는 LMS 처리군보다 더 우수한 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
상기 결과는 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주 또는 균체가 DTH 반응을 강화하고 면역 반응을 증진시킨다는 것을 의미한다.
6.4 혈청 IgA 및 IgG 함량 비교
면역 반응은 B-림프구에 의해 조절되는데, 이는 형질 세포로 분화하여 면역 글로불린(IgA 및 IgG)을 생성하고 특정 항원과 결합하는 것으로 알려져 있다. ELISA를 이용한 혈청 IgA 및 IgG 함량 측정을 통해, 체액성 면역 반응 효과를 확인하였으며, 그 결과를 도 5F에 나타내었다.
도 5F에 나타낸 바와 같이, CTX 처리된 마우스에서 대조군 마우스(CON)와 비교하여 혈청 IgA 및 IgG 수준이 크게 감소된 것을 확인하였다. 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체 처리군은 혈청 IgA 및 IgG 수준이 증가된 것을 확인하였다. 상기 결과는 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주 또는 CTX 처리된 마우스에서 체액성 면역을 향상시킬 수 있음을 의미한다.
6.5 혈청 사이토카인 분비 증진 효과 확인
바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체 처리가 혈청 사이토카인의 수준에 미치는 영향을 확인하였다. 구체적으로, CTX 처리에 의해 면역 억제 마우스에 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균주 또는 균체를 투여하였으며, 혈청 내 IL-2, IL-6 및 IFN-γ의 수준을 확인하였다. 혈청 내 IL-2, IL-6 및 IFN-γ의 수준을 확인한 결과는 도 6A 내지 C에 각각 나타내었다.
도 6A 내지 C에 나타낸 바와 같이, CTX 주입에 의한 면역억제 반응으로 혈청 사이토카인은 유의하게 억제되었으나, 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체 처리군은 CTX 처리군에 비해 혈청 사이토카인 수준이 회복된 것을 확인하였다. 상기 결과는 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체가 면역 억제된 마우스의 혈청에서 사이토카인의 유전자 발현을 회복시킬 수 있음을 의미한다.
실시예 7. 면역억제 마우스에서 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체가 NF-κB 및 MAPKs 신호전달 경로에 미치는 영향 확인
NF-κB 신호 전달은 사이토카인 유전자 발현의 중요한 조절 인자이며 항 염증 치료 중재에 중요한 역할을 하며, MAPK를 활성화함으로써 세포 성장과 분화에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 또한, 사이토카인에 대한 세포 반응과 TNF-α, IL-2, IFN-γ와 같은 유전자의 관련 발현을 조절한다. 따라서 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체가 사이토카인 발현 조절에서 신호전달 경로에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 신호전달 경로 관련 단백질(ERK, p38, JNK, p65 및 IκBα) 및 이들의 인산화 단백질 양을 분석하였다. 단백질 발현을 분석한 결과는 도 7A 및 B에 나타내었다.
도 7A 및 B에 나타낸 바와 같이, CTX 처리군에서는 NF-κB 신호 및 MAPK 단백질의 활성화가 크게 억제되었으나, 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체를 처리한 군에서는 인산화된 NF-κB(p-p65), IκBα 및 인산화된 JNK, ERK, p38의 단백질 발현 감소가 회복되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체가 NF-κB 및 MAPK 신호 전달 경로를 활성화하여 CTX에 의해 유도된 면역 억제를 회복시킬 수 있음을 나타낸다.
실시예 8. 면역억제 마우스에서 바실러스 밸레젠시스 Kh2-2 균체가 CTX 유발 결장 손상 및 장내 미생물 구성에 미치는 영향 조사
CTX 처리가 결장 손상을 유발하여 장 면역 억제를 유발할 수 있음; 및 장 길이가 결장 손상 지수를 반영한다는 것;이 당 분야에 알려져 있다. 이에, Kh2-2 균체 처리에 따른 결장 길이를 분석하였으며, 그 결과는 도 8A에 나타내었다.
도 8A에 나타낸 바와 같이, CTX 처리군은 대조군 마우스보다 결장 길이가 짧은 것을 확인하였다. 그러나 CTX 처리된 마우스에 Kh2-2 균체를 처리한 마우스는 결장 길이가 회복된 것을 확인하였다.
또한, CTX 처리된 마우스의 결장 조직에서 Kh2-2 균체 처리에 따른 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 발현을 분석하였다. 분석 결과는 도 8B에 나타내었다.
도 8B에 나타낸 바와 같이, CTX 처리군은 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 발현이 억제된 것을 확인하였다. 그러나 CTX 처리된 마우스에 Kh2-2 균체를 처리한 마우스는 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 발현이 증가된 것을 확인하였다.
상기 결과는 Kh2-2 균체가 흉선/비장 지수, 결장 길이 및 사이토카인 발현을 포함하는 전신 면역을 개선함으로써 CTX 처리 마우스에서 면역자극 활성을 나타낸다는 것을 의미한다. 이전 연구에서 숙주 면역이 장내 미생물총과 공생 관계가 있음을 보여주었으므로 특정 박테리아 종은 T 및 B 세포 활성화를 포함한 장 면역 반응을 조절할 수 있다. 따라서 Kh2-2 균체의 면역 강화 효과는 장내 미생물총의 조절과 양의 상관관계가 있을 수 있다.
실시예 9. 장내 세균 조성 분석
박테리아의 공유 풍부도는 대조군, CTX, Kh2-2 균체 그룹에서 벤 다이어그램을 분석하였다. 벤 다이어그램 분석 결과는 도 8C에 나타내었다.
도 8C에 나타낸 바와 같이, 대조군은 39개의 고유한 OTU(operational taxonomic units)를 확인했다. 반면, CTX, Kh2-2 및 Kh2-2 균체 상등액 그룹은 각각 28, 8 및 6개의 고유한 OTU가 있음을 확인하였다.
Kh2-2 및 Kh2-2 균체 상등액 처리 후 장내 세균 조성의 변화를 추가로 확인하기 위해 대조군, CTX, Kh2-2 및 Kh2-2 균체 상등액 그룹의 세균 조성을 문 및 속 수준에서 비교하였으며, 그 결과는 도 8D 및 E에 나타내었다.
도 8D 및 E에 나타낸 바와 같이, Bacteroidetes와 Firmicutes는 문 수준(> 95%)에서 모든 그룹에서 지배적인 박테리아 군집임을 확인하였다. CTX는 Bacteroidetes의 상응하는 감소와 함께 Firmicutes 및 Proteobacteria의 상대적 풍부함을 증가시켰다. CTX 그룹과 비교하여 Kh2-2 처리는 장내 세균 불균형을 부분적으로 역전시켰다. 이는 프로바이오틱스가 CTX 유도 장내 세균 불균형을 조절하여 면역 반응을 향상시킬 수 있음을 시사하는 이전 연구와 일치한다. 흥미롭게도, Kh2-2 균체 처리는 CTX로 유도된 Firmicutes/Bacteroidetes의 비율 증가에 영향을 미치지 않는 것으로 보이나, Tenericutes의 상대적 풍부도는 증가시킨 것을 확인하였다.
상기 결과는 Kh2-2 및 Kh2-2 상등액이 다양한 패턴의 작용을 통해 CTX로 유발된 장내 세균 불균형을 조절할 수 있음을 시사한다.
상기 도 8D 및 E를 기반으로, 장내 미생물총을 추가분석하였다. 분석 결과는 도 8F에 나타내었다.
도 8F에 나타낸 바와 같이, CTX군은 대조군에 비해 Helicobacter, Barnesiella, Alistipes 및 Ruminococcus의 존재비가 더 높은 것을 확인하였고, Kh2-2 또는 Kh2-2 상등액 처리군은 상기 균주들의 존재비가 낮은 것을 확인하였다.
상기 결과는 Kh2-2가 CTX로 유도된 면역결핍 마우스에서 일부 유익한 박테리아의 성장을 효과적으로 촉진하고 여러 유해 박테리아의 성장을 억제함을 시사한다.
이상, 본 발명내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의해 정의된다고 할 것이다.
Claims (9)
- 바실러스 밸레젠시스(Bacillus velenzensis) Kh2-2 균주(기탁번호 : KCTC14642BP).
- 제1항에 있어서, 상기 균주는 서열번호 1의 염기서열을 포함하는 것인, 균주.
- 제1항에 있어서, 상기 균주는 내산성 또는 내담즙성을 갖는 것인, 균주.
- 제1항에 있어서, 상기 균주는 면역증강 활성을 갖는 것인, 균주.
- 제4항에 있어서, 상기 면역은 내재 면역(innate immunity) 또는 적응 면역(adaptative immune)인, 균주.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 균주, 이의 배양액, 이의 균체 또는 이들의 무세포 추출물을 포함하는, 면역증강용 약학적 조성물.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 균주, 이의 배양액, 이의 균체 또는 이들의 무세포 추출물을 포함하는, 면역증강용 식품 조성물.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 균주, 이의 배양액, 이의 균체 또는 이들의 무세포 추출물을 포함하는, 면역증강용 건강기능식품 조성물.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 균주, 이의 배양액, 이의 균체 또는 이들의 무세포 추출물을 포함하는, 면역증강용 사료 조성물.
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