KR102524102B1 - 쿠르토박테리움 프로이뮨 k3 균주 및 이를 포함하는 면역증강용 조성물 - Google Patents
쿠르토박테리움 프로이뮨 k3 균주 및 이를 포함하는 면역증강용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 새롭게 분리 동정된 균주인 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3, 이의 배양액 또는 이들의 무세포 추출물을 포함하는 면역 증강용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주 (기탁번호: KCTC14591BP), 이의 배양액 또는 이들의 무세포 추출물은 IL-2, IFN-γ, TNF-a 및 IL-1β 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상 사이토카인의 발현 및 혈청 IgA 또는 혈청 IgG 의 생성 촉진을 통해 신체 내 내재 및 적응 면역을 모두 효과적으로 증진시킬 수 있으므로, 면역증강을 위한 식품, 건강기능식품, 사료 및 의약품, 피부건강 소재 등으로 다양하게 활용될 수 있다.
Description
본 발명은 새롭게 분리 동정된 균주인 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주, 이의 배양액 또는 이들의 무세포 추출물을 포함하는 면역 증강용 조성물에 관한 것이다.
면역이란 생체가 자기 성분 이외의 물질 등이 생체의 항상성을 깨뜨리거나 자기를 위협하는 것을 배제하기 위해 일어나는 일련의 생체 방어 반응을 의미하며 피부, 소화관, 호흡기 등을 통해 침입한 유해물질로부터 신체를 보호하는 방어체계로 외부 자극물질을 제거하는 대식 작용을 하거나, 상처에 발생한 심각한 염증을 줄이는 작용을 통한 항상성 유지 활동이라고 할 수 있다. 면역기능이 결핍되거나 저하가 되면 면역반응이 제대로 활성화되지 못하여 체내의 이물질에 대한 반응을 제대로 못하여 감염을 일으키게 된다. 면역기능 증진과 관련된 영양소로는 Fe, Zn, Cu, Se 등을 포함한 무기질과 비타민 A, C, E와 B 비타민들과 특정한 아미노산이나 지방산 등도 관심을 모으고 있으나, 평상시의 생체에서 면역기능조절의 불균형을 이루는 원인으로는 영양 부족뿐만 아니라 선천적 요인과 외부적 요인에 의해 면역계 불균형이 진행될 수 있다. 예를 들어 선천적으로 체내 면역기능 부진으로 식세포가 제 기능을 못하는 경우가 있으며, 이러한 면역부진 상태는 또한 외부 바이러스의 인체(숙주) 침투를 야기하고 침투된 바이러스의 증식이 촉진되어 여러 감염 질환으로부터 취약하게 된다. 대식세포는 외부 바이러스에 식세포 작용(Phagocytosis)을 통해 대응하는 대표적인 면역세포이다. 식세포 작용이란 사전적 의미로는 세포가 환경으로부터 고형입자를 잡아들이는 활동이라 할 수 있는데, 예를 들어 외부부터 칩입한 병원균 등을 세포내로 잡아들어 세포 내 소화를 하는 현상을 말한다. 이러한 식세포 작용을 통해 유해 병원균(바이러스 및 세균 등)을 무력화 하는 우리 몸의 가장 중요한 1차 방어 기능이며 효과적인 보호 수단이 된다. 식세포는 단핵구(monocyte)가 분화하여 생기는 세포이며, 혈관을 빠져나가 조직에 들어가서 점차 크기가 커지고 식세포 작용이 왕성한 대식세포로 분화한다. 같은 미생물에 의한 감염일 경우에도, 면역력이 약화된 사람의 경우에는 그렇지 않은 사람에 비해 심각한 감염증이 나타날 수 있다.
인체의 면역증강은 평소 다양한 세균과 바이러스 (세균성 감염질환, 감기, 에이즈 등)으로부터 우리 신체를 보호하는 것으로, 병원성을 일으키는 바이러스, 균 등 감염원에 대한 신체 조직의 방어 반응으로 정의되어 있다. 최근 몇 년 동안 여러 연구에서 유산균, 비티도박테리아 등의 면역증강 효과에 대한 보고가 많이 되고 있으나, 현재까지 보고된 유산균은 유산균의 생존력과 유통과정에서의 안전성이 문제가 되고 지속적인 관리와 모니터링이 필요한 한계점이 있다. 또한 인체에서의 활력을 고려하여 최근에는 수십배의 함량이 증가된 고밀도의 제품이 생산되어 유통되고 있으나, 과량 균주에 의한 부작용이 보고되고 있어, 이러한 문제점을 해소할 수 있는 새로운 면역 증강용 균주에 대한 필요성이 있다.
본 발명자들은 전통 발효 인삼 음료으로부터 유용 균주를 분리 연구하던 중, 분리 동정된 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주가 우수한 면역증강 효과를 나타냄을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주, 이의 배양액 또는 이의 무세포 추출물을 포함하는 면역 증강제 및 이를 포함하는 식품, 건강기능식품 조성물, 사료 조성물 및 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 (Curtobacterium proimmune K3) 균주 (기탁번호: KCTC14591BP)를 제공한다.
또한 본 발명은 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주 (기탁번호: KCTC14591BP), 이의 배양액 또는 이들의 무세포 추출물을 포함하는, 면역 증강용 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은, 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주 (기탁번호: KCTC14591BP), 이의 배양액 또는 이들의 무세포 추출물을 포함하는, 면역 증강용 식품 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은, 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주 (기탁번호: KCTC14591BP), 이의 배양액 또는 이들의 무세포 추출물을 포함하는, 면역 증강용 건강기능식품 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은, 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주 (기탁번호: KCTC14591BP), 이의 배양액 또는 이들의 무세포 추출물을 포함하는, 면역 증강용 사료 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은, 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주 (기탁번호: KCTC14591BP)이의 배양액 또는 이들의 무세포 추출물을 포함하는, 면역 증강용 화장료 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은, 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주 (기탁번호: KCTC14591BP), 이의 배양액 또는 이들의 무세포 추출물을 포함하는, 면역 증강용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은, 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주 (기탁번호: KCTC14591BP) 를 불활화 처리하는 단계; 를 포함하는, 파라프로바이오틱스를 포함하는 면역 증강용 조성물의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 따른 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주 (기탁번호: KCTC14591BP), 이의 배양액 또는 이들의 무세포 추출물은 IL-2, IFN-γ, TNF-a 및 IL-1β 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상 사이토카인의 발현 및 혈청 IgA 또는 혈청 IgG 의 생성 촉진을 통해 신체 내 내재 및 적응 면역을 모두 효과적으로 증진시킬 수 있으므로, 면역증강을 위한 식품, 건강기능식품, 사료, 의약품 및 피부 건강 소재 등으로 다양하게 활용될 수 있다.
도 1은 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 (Curtobacterium proimmune K3) 처리에 따른 세포 독성을 MTT 분석(A), LIVE/DEAD 분석 (B) 을 통해 확인한 결과 및 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 처리에 따른 세포의 형태 변화(C)를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (모든 값은 평균 ± S.D로 표시, ns, 통계적 유의성 없음).
도 2는 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물 처리에 따른 NO 생산(A) 및 사이토카인 발현 변화를 mRNA 분석 (B 내지 D) 및 단백질 ELISA 분석 (E 내지 G) 을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다(모든 값은 평균 ± S.D로 표시, * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 vs. con group).
도 3은 비장세포에서 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물 처리에 따른 세포 생존율 (A) 및 사이토카인 발현 변화를 mRNA 분석 (B 내지 E) 및 단백질 ELISA 분석 (F 내지 I) 을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다(모든 값은 평균 ± S.D로 표시, * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 vs. con group).
도 4는 CTX-면역억제 마우스에서 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물 처리에 따른, 면역관련 기관인 비장 및 흉선의 기관 인덱스 회복 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다(모든 값은 평균 ± S.D로 표시, * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 vs. con group. #p <0.05, ## p <0.01, ### p <0.001 vs. CTX 그룹).
도 5는 CTX-면역억제 마우스에서 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물 처리에 따른, NK 세포 생존 증진 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다(모든 값은 평균 ± S.D로 표시, * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 vs. con group. #p <0.05, ## p <0.01, ### p <0.001 vs. CTX 그룹).
도 6은 CTX-면역억제 마우스에서 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물 처리에 따른, 적응 면역 향상 효과를 비장 세포 증식을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다 (모든 값은 평균 ± S.D로 표시, * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 vs. con group. #p <0.05, ## p <0.01, ### p <0.001 vs. CTX 그룹).
도 7은 CTX-면역억제 마우스에서 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물 처리에 따른, 적응 면역 향상 효과를 귀 부종 변화를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다 (모든 값은 평균 ± S.D로 표시, * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 vs. con group. #p <0.05, ## p <0.01, ### p <0.001 vs. CTX 그룹).
도 8은 CTX-면역억제 마우스에서 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물 처리에 따른, 적응 면역 향상 효과를 ELISA 분석에 의한 혈청의 IgA (F) 및 IgG (G) 함량을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다 (모든 값은 평균 ± S.D로 표시, * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 vs. con group. #p <0.05, ## p <0.01, ### p <0.001 vs. CTX 그룹).
도 9는 CTX-면역억제 마우스에서 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물 처리에 따른, 혈청 면역 관련 사이토카인의 회복을 확인한 결과를 나타낸 도이다. (모든 값은 평균 ± S.D로 표시, *p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 vs. con group. #p <0.05, ## p <0.01, ### p <0.001 vs. CTX 그룹)
도 10은 CTX-면역억제 마우스의 비장 및 흉선에서 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물 처리에 따른, 면역 관련 사이토카인의 mRNA 발현 수준 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (모든 값은 평균 ± S.D로 표시, *p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 vs. Con 그룹. #p <0.05, ## p <0.01, ### p <0.001 대 CTX 처리 군).
도 11은 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물의 NF-kB 및 MAPK 신호 전달 경로 활성화를 비장 세포에서 IκBα 및 NF-κB 단백질의 면역 블롯팅 (A) 및 비장 세포에서 ERK, JNK 및 p38 단백질의 면역 블롯팅 (B)을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다(모든 값은 평균 ± S.D로 표시, * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 vs. con group. #p <0.05, ## p <0.01, ### p <0.001 vs. CTX 그룹)
도 2는 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물 처리에 따른 NO 생산(A) 및 사이토카인 발현 변화를 mRNA 분석 (B 내지 D) 및 단백질 ELISA 분석 (E 내지 G) 을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다(모든 값은 평균 ± S.D로 표시, * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 vs. con group).
도 3은 비장세포에서 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물 처리에 따른 세포 생존율 (A) 및 사이토카인 발현 변화를 mRNA 분석 (B 내지 E) 및 단백질 ELISA 분석 (F 내지 I) 을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다(모든 값은 평균 ± S.D로 표시, * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 vs. con group).
도 4는 CTX-면역억제 마우스에서 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물 처리에 따른, 면역관련 기관인 비장 및 흉선의 기관 인덱스 회복 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다(모든 값은 평균 ± S.D로 표시, * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 vs. con group. #p <0.05, ## p <0.01, ### p <0.001 vs. CTX 그룹).
도 5는 CTX-면역억제 마우스에서 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물 처리에 따른, NK 세포 생존 증진 효과를 확인한 결과를 나타낸 도이다(모든 값은 평균 ± S.D로 표시, * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 vs. con group. #p <0.05, ## p <0.01, ### p <0.001 vs. CTX 그룹).
도 6은 CTX-면역억제 마우스에서 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물 처리에 따른, 적응 면역 향상 효과를 비장 세포 증식을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다 (모든 값은 평균 ± S.D로 표시, * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 vs. con group. #p <0.05, ## p <0.01, ### p <0.001 vs. CTX 그룹).
도 7은 CTX-면역억제 마우스에서 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물 처리에 따른, 적응 면역 향상 효과를 귀 부종 변화를 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다 (모든 값은 평균 ± S.D로 표시, * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 vs. con group. #p <0.05, ## p <0.01, ### p <0.001 vs. CTX 그룹).
도 8은 CTX-면역억제 마우스에서 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물 처리에 따른, 적응 면역 향상 효과를 ELISA 분석에 의한 혈청의 IgA (F) 및 IgG (G) 함량을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다 (모든 값은 평균 ± S.D로 표시, * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 vs. con group. #p <0.05, ## p <0.01, ### p <0.001 vs. CTX 그룹).
도 9는 CTX-면역억제 마우스에서 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물 처리에 따른, 혈청 면역 관련 사이토카인의 회복을 확인한 결과를 나타낸 도이다. (모든 값은 평균 ± S.D로 표시, *p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 vs. con group. #p <0.05, ## p <0.01, ### p <0.001 vs. CTX 그룹)
도 10은 CTX-면역억제 마우스의 비장 및 흉선에서 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물 처리에 따른, 면역 관련 사이토카인의 mRNA 발현 수준 변화를 확인한 결과를 나타낸 도이다 (모든 값은 평균 ± S.D로 표시, *p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 vs. Con 그룹. #p <0.05, ## p <0.01, ### p <0.001 대 CTX 처리 군).
도 11은 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물의 NF-kB 및 MAPK 신호 전달 경로 활성화를 비장 세포에서 IκBα 및 NF-κB 단백질의 면역 블롯팅 (A) 및 비장 세포에서 ERK, JNK 및 p38 단백질의 면역 블롯팅 (B)을 통해 확인한 결과를 나타낸 도이다(모든 값은 평균 ± S.D로 표시, * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001 vs. con group. #p <0.05, ## p <0.01, ### p <0.001 vs. CTX 그룹)
본 발명은 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 (Curtobacterium proimmune K3, KCTC14591BP); 및 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 (Curtobacterium proimmune K3, KCTC14591BP), 이의 배양액 또는 이들의 무세포 추출물을 포함하는, 면역 증강용 조성물, 건강기능식품 조성물, 식품조성물, 화장료 조성물, 사료 조성물 및 약학적 조성물에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명의 "쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 (Curtobacterium proimmune K3)" 는 대한민국 용인의 전통 발효 인삼 음료으로부터 분리된 균주로, 16s rRNA 서열 기반 분석 결과, 기존에 알려지지 않은 새로운 균주인 것이 확인되었다. 따라서 상기 균주를 2021.06.01일자로 한국생명공학연구원에 기탁하고, 기탁번호 KCTC14591BP 를 부여받았다. 본 균주의 16s rRNA 서열은 서열번호 1로 나타내었다.
본 발명의 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주, 이의 배양액 또는 이들의 무세포 추출물은 독성을 나타내지 않으면서, NF-κ및 MAPK 신호 전달 경로를 활성화하고, 면역관련 사이토카인인 IL-2, IFN-γ, TNF-a 및 IL-1β의 생산을 증진시킬 수 있을 뿐만 아니라, 비장 세포 증식 및 혈청 IgA 및 IgG 의 생산을 촉진할 수 있어, 내재 및 적응 면역을 모두 증진시킬 수 있는 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주는 생균 또는 사균 형태를 모두 포함하며, 생균 또는 사균의 형태로 포함되어 면역 증강 효과를 나타낼 수 있다. 본 발명에 있어 "사균"은 불활화 균주, 용해물, 파라프로바이오틱스와 동일한 의미로 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어, "파라프로바이오틱스" 란 인간의 건강상 유용한 효과를 제공하기 위하여 다양한 물리 화학적 방법으로 불활성화된 미생물 또는 세포 분획물을 의미한다. 프로바이오틱스로부터 파라프로바이오틱스를 분리하고 정제하기 위한 방법은 이에 제한되는 것은 아니나 열에 의한 불활화, 자외선 처리, 방사선 조사, 고압 및 초음파로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상에 의해 수행될 수 있다.
따라서, 본 발명의 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주는 열, 자외선, 방사선 조사, 고압 및 초음파로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 불활화 처리에 의하여 불활성화된 사균인 파라프로바이오틱스로 면역증강용 조성물에 포함될 수 있다.
본 발명에서는 바람직한 일 구현예로서 초음파 처리에 의하여 불활화된 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주를 개시하고 있으며, 보다 구체적으로 60 내지 120분, 바람직하게는 60 내지 100분, 더욱 바람직하게는 80 내지 100분 동안 초음파 처리하여 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주를 불활화시킬 수 있다.
본 발명의 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주, 이의 배양액 또는 이의 무세포 추출물은 내재 면역 및/또는 적응 면역을 모두 증강시킬 수 있다. 보다 구체적으로, 본 발명의 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주, 이의 배양액 또는 이의 무세포 추출물은 IL-2, IFN-γ, TNF-a 및 IL-1β 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상 사이토카인의 발현을 증진시킬 수 있으며, 혈청 IgA 또는 혈청 IgG 의 생성을 촉진할 수 있다.
본 발명의 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주는 면역 증강 효과를 나타내므로, 면역증강을 목적으로 하는 식품 조성물, 건강기능식품 조성물, 화장료 조성물, 사료 조성물 및 약학적 조성물의 형태로 제공될 수 있다.
따라서 본 발명은 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주 (기탁번호: KCTC14591BP), 이의 배양액 또는 이들의 무세포 추출물을 포함하는, 면역 증강용 식품 조성물 또는 건강기능식품 조성물을 제공한다.
상기 식품 또는 건강기능식품 조성물은 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제, 천연 탄수화물, 영양제, 비타민제, 증점제, pH 조절제, 방부제 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 첨가제를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 상기 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food)및 식품 첨가제(food additives)등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
예를 들면, 건강 식품으로는 상기 조성물 자체를 차, 주스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마말레이드 등), 어류, 육류, 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등)등에 추출물을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명의 식품용 조성물 중 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3, 이의 배양액 또는 이의 무세포 추출물의 바람직한 함량은 식품용 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 50% 일 수 있으며, 바람직하게는 0.01 내지 30% 범위로 함유될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 건강 기능성 식품 조성물은 정제, 환제, 과립제, 분말제, 액제, 경질캅셀제, 연질캅셀제 등과 같은 일반적인 제형으로 제조될 수 있으며, 죽, 빵, 음료, 바, 초콜릿, 쿠키, 차, 드링크제, 비타민 복합제, 육류, 소시지, 캔디, 면, 젤리 등과 같은 임의의 형태로 제조될 수 있다.
상기와 같은 여러 제형 또는 형태를 제조하기 위해, 전술한 부형제들과 같은 식품학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 사용할 수 있으며, 제조하고자 하는 제형 또는 형태의 제조에 당해 기술 분야에서 사용 가능한 것으로 공지되어 있는 임의의 담체 또는 첨가제가 이용될 수 있다.
또한 본 발명은 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주 (기탁번호: KCTC14591BP), 이의 배양액 또는 이들의 무세포 추출물을 포함하는, 면역 증강용 사료 조성물에 관한 것이다.
상기 사료용 조성물은 공지의 사료 보조제, 식품 첨가제 또는 사료 첨가제를 추가적으로 포함할 수 있으며, 발효사료, 배합사료, 펠렛형태 및 사일리지 등의 형태로 제조될 수 있다.
또한 본 발명은 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주 (기탁번호: KCTC14591BP), 이의 배양액 또는 이들의 무세포 추출물을 포함하는, 면역 증강용 화장료 조성물에 관한 것이다.
상기 화장료 조성물은 상기 유효성분 이외에 통상적으로 허용되는 성분들을 제한 없이 포함할 수 있으며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제, 그리고 담체를 포함할 수 있다. 상기 화장료 조성물은 피부 건강을 위한 다양한 소재를 제한없이 포함하는 의미로 해석될 수 있다.
또한 본 발명은 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주 (기탁번호: KCTC14591BP), 이의 배양액 또는 이들의 무세포 추출물을 포함하는, 면역 증강용 약학적 조성물에 관한 것이다.
상기 조성물은 면역 관련 질병의 예방, 치료 또는 개선을 위해 사용될 수 있고, 면역 관련 질병으로는 천식, 계절성 또는 통년성 비염, 알러지성 비염, 결막염, 아토피성 피부염, 두드러기, 적혈구의 용혈, 급성 사구체 신염, 감기, 만성 피로를 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약학적 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구제 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화되어 사용할 수 있고, 제형화를 위하여 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용되는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다.
상기 담체 또는, 부형제 또는 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리게이트, 셀룰로즈, 메틸셀룰로즈, 미정질 셀룰로즈, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다.
제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 중량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 제조할 수 있다.
경구 투여를 위한 고형제제는 상기 균주에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제조할 수 있다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용할 수 있다.
경구를 위한 액상 제제로는 현탁액, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용하는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.
비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등을 사용할 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(Tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세롤젤라틴 등을 사용할 수 있다.
상기 약학적 조성물의 바람직한 투여량은 환자의 상태, 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서는 1일 0.0001 내지 2,000 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 2,000 mg/kg으로 투여할 수 있다. 투여는 하루에 한 번 투여할 수도 있고, 수회 나누어서 투여할 수도 있다. 다만, 상기 투여량에 의해서 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 약학적 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유 동물에 다양한 경로로 투여할 수 있다. 투여의 모든 방식은 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁 내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해서 투여할 수 있다.
또한 본 발명은 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주 (기탁번호: KCTC14591BP) 을 불활화 처리하는 단계; 를 포함하는, 파라프로바이오틱스를 포함하는 면역 증강용 조성물의 제조방법을 제공한다.
상기 제조방법은 면역증강 효과를 갖는 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3를 특히 사균 형태, 즉 파라프로바이오틱스 형태로 제조하기 위한 것이며, 불활화처리는 자외선, 방사선 조사, 고압 및 초음파로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 불활화 처리일 수 있다.
본 발명의 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 의 불활화 형태인 파라프로바이오틱스, 사균, 또는 용해물은 생균제 대비 더욱 안전함과 동시에 우수한 면역 증강 효과를 발휘할 수 있는 장점이 있다.
이하, 발명의 구체적인 실시예를 통해, 발명의 작용 및 효과를 보다 상세하게 설명하기로 한다. 다만, 이러한 실시예는 발명의 예시로 제시된 것에 불과하며, 이에 의해 발명의 권리범위가 정해지는 것은 아니다.
실험재료
LB 브로스와 한천은 BECTON DICKINSON & COMPANY (B.D., Franklin Lakes, New Jersey, USA)에서 구입하였다. RAW264.7 및 YAC-1 세포주는 한국 세포주 은행 (한국 서울)으로부터 구입하여 사용하였다. RPMI 1640 배양 배지, DMEM 배지, 페니실린 (100 mg/mL)-스트렙토마이신 (100U/mL) 및 우태아 혈청 (FBS)은 GenDEPOT (Katy, TX, USA)에서 구입하여 사용하였고, MTT, DMSO, CTX(Cyclophosphamide), LMS(Levamisole hydrochloride)는 Sigma (St. Louis, MO, 미국)에서, LIVE/DEAD 세포 생존력 분석 염색은 Thermo Fisher Scientific (Thermo Scientific, USA)에서 구입하여 사용하였다. 모든 프라이머는 마크로젠 (대한민국 서울)에서 디자인되었다. 모든 화학 물질과 시약은 시약 등급의 품질이며 상업적으로 이용 가능한 것을 이용하였다.
세포 및 동물 실험 방법
시험관 내 실험을 위해 RAW 264.7 세포를 페니실린 (100mg/mL)-스트렙토마이신 (100 U/mL) 및 10 % FBS가 보충된 DMEM 배지에서 배양하였다. 배양된 세포는 5% CO2 가습기에서 37 ℃로 배양하였다.
생체 외 실험을 위해, 자궁경부 탈구에 의해 BALB/c 마우스(4 주령)로부터 비장을 무균적으로 제거하였다. 또한, 10ml 주입 주사기의 플런저를 사용하여 조직을 부드럽게 균질화한 후 6겹의 거즈를 통과시켜 단일 세포가 되도록 하였다. 적혈구 용해 완충액 (Sigma-Aldrich, MO, USA)을 사용하여 적혈구를 제거하고 부유 비장 세포를 PBS로 3 회 세척한 후 1200rpm에서 3 분 동안 원심분리하였다. 비장 세포에서 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 의 증식 촉진은 WST-8 세포 생존 어세이 키트를 BIOMAX (대한민국 서울)에서 구입하여 평가하였다. 비장 세포를 콘카나발린 A(ConA) 또는 다양한 농도의 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물 (25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600 μg/mL)과 함께 1x106 세포/웰의 밀도로 96- 웰 플레이트에 접종하고 48시간 동안 배양하였다. 10 μL의 WST-8 용액을 100 μL 세포 배양 배지에 첨가하고, 플레이트를 2 시간 동안 배양하였다. 광학 밀도 값은 SpectraMax ABS Plus 마이크로 플레이트 판독기를 사용하여 450nm에서 기록하였다.
SPF 등급의 수컷 ICR 마우스 (6 주령, 25-27g)를 OrientBio에서 구입하여 사용하였다. 모든 마우스는 23-27℃ 온도 및 50% -70 %의 습도 조건에서 12 시간 조명: 12 시간 어두운 주기로 유지된 환경에서 유지시켰다. 모든 마우스에게 표준 사료와 물을 지속적으로 공급하였으며, 모든 실험은 실험 동물 관리 원칙 (NIH 간행물 # 80-23, 1996 년 개정)과 경희대 학교 동물 관리 및 사용 지침 (승인 번호 KHGASP-20-375)에 따라 절차를 수행하였다. 1주 적응 기간 후, 마우스를 다음과 같이 7 개의 그룹으로 무작위로 나누었다:
| 대조군 (Con) | 멸균 식염수를 사용한 CTX 미처리 군 |
| 모델군 (CTX) | 멸균 식염수와 CTX 처리군 |
| C.proimmune K3 -L | 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 105 CFU/mL 처리군 |
| C.proimmune K3-H | 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 106 CFU/mL 처리군 |
| C.proimmune K3 Ly-L | 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물 105 CFU/mL 처리군 |
| C.proimmune K3 Ly-H | 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물 106 CFU/mL 처리군 |
| LMS | 레바미솔 염산염으로 처리된(40mg/kg) CTX 처리군 (양성대조군) |
Con 그룹을 제외한 모든 마우스에 멸균 식염수 내 CTX를 체중당 80 mg/kg으로 1 일 1 회 연속 3 일 동안 함께 복강 내 주사하여 면역 억제를 유도하였다. 마우스에게 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주 또는 이의 용해물, 또는 LMS를 20 일 동안 매일 1 회 경구 투여하였다. 이후 모든 마우스를 안락사시키고 혈액을 수집한 후 3000rpm, 4℃에서 15 분 동안 원심 분리하여 혈청을 수집한 다음 생화학적 분석을 위해 -80℃에 보관하였다. 한편, 생화학적 마커 분석을 위해 신선한 비장 및 흉선 조직 샘플을 수확하고 -80℃ 에서 유지하였다.
ELISA 분석 방법
In vitro 및 ex vivo 실험을 위하여, RAW264.7 세포와 비장 세포를 96 웰 플레이트에 분주한 후 다양한 농도의 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물 및 LPS 또는 ConA 를 각각 처리하였다. 배양 상층액 100 마이크로리터를 세포 배지로부터 수득하여 제조업체(R & D Systems) 의 지침에 따른 ELISA를 사용하여 TNF-α, IL-1βIL-2 및 INF-γ의 분비를 평가하였다.
in vivo 실험을 위해, 20 분 동안 1000 rpm으로 전혈로부터 마우스 혈청을 분리하였고, 혈청 내 TNF-α, IL-1β, IL-2, INF-γ(R & D Systems, Minneapolis, MN, USA) 및 IgG 및 IgA (Elabscience Biotechnology Co., Texas, USA)의 함량을 ELISA 키트로 측정하였다.
qRT
-
PCR
분석 방법
총 mRNA는 각각 Trizol 시약 키트 지침 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)에 의해 RAW264.7 세포, 비장 세포 및 마우스 비장 및 흉선 기관에서 수득하였다. 먼저, 총 RNA 500ng을 amfiRivert cDNA Synthesis Platinum Enzyme Mix (GenDEPOT, Katy, TX, USA)로 역전사하였으며, 반응은 SYBR PremixExTaqTM II (TaKaRa)와 함께 CFX96TM Real-Time RT-PCR 시스템을 사용하여 수행하였다. qRT-PCR은 amfiSure qGreen Q-PCR Master Mix (GenDEOT, TX, USA)를 사용하여 20 μL 반응 부피에서 50 ng cDNA를 사용하여 수행하였고, qRT-PCR에 유전자 특이적 프라이머 서열을 표 2에 나타내었다. 유전자 발현은 GAPDH를 사용하여 정규화하였다.
| Primer | Sequence | |
| GAPDH | Forward | 5'-ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC-3' |
| Reverse | 5'-CCA CCA CCC TGT TGC TGT AG-3' | |
| iNOS | Forward | 5'-AAT GGC AAC ATC AGG TCG GCC ATC ACT-3' |
| Reverse | 5'-GCT GTG TGT CAC AGA AGT CTC GAA CTC-3' | |
| TNF-α | Forward | 5'-AGC CCACGTCGTAGCAAACCACCAA-3' |
| Reverse | 5'-AAC ACC CAT TCC CTT CAC AGA GCA AT-3' | |
| IL-1β | Forward | 5'-TGC AGA GTT CCC CAA CTG GTA CAT C-3' |
| Reverse | 5'-GTG CTG CCT AAT GTC CCC TTG AATC-3' | |
| IFN-γ | Forward | 5'-TAT CTC TTT CTA CCT CAG AC-3' |
| Reverse | 5'-GCA ATC ACA GTC TTG GCT AAT TAG-3' | |
| IL-2 | Forward | 5'-CCT GAG CAG GAT GGA GAA TTA-3' |
| Reverse | 5'-TCC AGA ACA TGC CGC AGA G-3' | |
면역블랏
분석
비장을 Pierce ™ RIPA Buffer (Thermo Fisher Scientific, Rockford, USA)를 이용하여 1 시간 동안 용해하였다. 비장 세포 용해물을 12,000 rpm 및 4℃ 에서 20 분 동안 원심 분리하였고, 동일한 양 (50 ㎍)의 총 단백질을 10 % SDS-PAGE에 로드하고 PVDF 막으로 옮겼다. 막을 PBST에서 5% 탈지유로 1 시간 동안 차단한 다음 1 차 항체와 함께 4℃에서 밤새 배양하였다. 세척 후, 막을 각각의 2 차 항체와 함께 1 시간 동안 배양하였다. 면역 반응 밴드를 확인하고 Image J 소프트웨어를 사용하여 정량화하였다.
통계적 분석
모든 실험 데이터는 평균 ± SD로 나타냈으며, 4 개 그룹 간의 통계적으로 유의 한 차이는 일원 분산 분석 (ANOVA)에 이어 Tukey-Kramer 테스트를 사용하여 평가하였다. 통계 그래프는 GraphPad Prism 8를 이용하여 나타내었다.
실시예
1.
쿠르토박테리움
프로이뮨
K3 의
분리 정제 및
용해물
제조
대한민국 용인의 전통 발효 인삼 음료으로부터 균주를 분리하였다. 분리된 균주의 16S rRNA 염기 서열을 기반으로 한 계통수 분석 결과, 분리 균주가 쿠르토박테리움 속인 것으로 확인되었으며, 종래 알려진 균주와 상이한 16S rRNA 서열을 갖는 새로운 균주인 것을 확인하였다. 분리된 균주인 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3를 한국생명공학연구원에 2021.06.01 일자로 기탁하고 KCTC14591BP 번호를 부여받았다. 해당 균주의 유전자 분석을 수행한 16S rRNA 서열을 서열번호 1에 표시하였다.
쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 의 용해물은 하기와 같은 방법으로 제조하였다.
먼저 600 nm에서 1.2Å의 광학 밀도에 도달할 때까지 36 ℃에서 24 시간 동안 100 mL LB 배지에서 배양하였다. 도달 후, 배지에 현탁하고, 균주를 약 90분 동안 초음파 처리한 다음 20 분 동안 4000 rpm으로 원심 분리하였다. 상층액을 제거하고 PBS 5ml를 펠릿으로 첨가하고 용해될 때까지 부드럽게 교반한 후, 20분 동안 4000rpm으로 원심분리하였다. PBS 세척을 3 회 반복한 다음 동결 건조를 위해 펠릿으로 현탁하였다.
실시예
2.
쿠르토박테리움
프로이뮨
K3 의
NO 생산 유도 및 사이토카인 분비 유도 확인 (
in vitro
)
RAW264.7 세포에서 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물의 세포 독성을 조사하기 위해 세포를 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물 (25μg/mL, 50μg/mL 및 100μg/mL) 및 LPS (1μg/mL)로 24시간 동안 처리하였고, 세포 독성 및 NO 생산, 사이토카인 분비에 미치는 영향을 확인하였다.
2.1 세포 독성 및 세포 분화 유도 확인
쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물을 RAW264.7 세포에 처리한 후 세포 사멸 여부를 MTT 어세이 및 형광이미지를 통해 확인하였다. 세포 독성 실험은 구체적으로 다음과 같이 수행하였다. LIVE/DEAD 염색 키트 (L-3224, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하여 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물을 RAW264.7 세포를 처리한 후, 세포 독성을 확인하였다. 키트의 Calcein AM 및 ethidium homodimer-1 혼합은 죽은 세포에 대해서는 적색(Ex 528 nm, Em 617 nm) 및 살아있는 세포에 대해서는 녹색(Ex 495 nm; Em 515 nm) 으로 나타나 세포 간의 차이를 분석한다. RAW264.7 세포를 플레이팅하고 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물을 25 μg/mL, 50 μg/mL 및 100 μg/mL, 및 LPS (1μg/mL)을 처리한 후, 배양하였다. 24시간 배양 후 염료를 배지에 용해시키고 30 분 동안 배양하였다. Leica DMLS Clinical Microscope (Leica, Wetzlar, Germany)로 세포를 확인하여 세포독성을 확인하였다. 또한, 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 및 LPS 처리 후의 세포 형태를 관찰하였으며, 그 결과를 도 1에 나타내었다.
도 1 A 및 B 에 나타낸 바와 같이, 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 를 처리한 모든 농도 실험 군에서 세포 사멸이 확인되지 않음을 확인하였다. 또한 도 1 C 에 나타낸 바와 같이, 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3은 RAW264.7 세포에서 세포 크기를 증가시키고, 위족 (도 1C 의 노란 화살표)을 신장시켜 분화를 유도하는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 가 RAW264.7 세포에 대한 세포 독성 없이 분화를 유도할 수 있음을 보여주는 결과이다.
2.2 NO 생산 및 사이토카인 분비 효과 확인
파라프로바이오틱스는 항염증 반응을 조절하고, 양성 면역 반응을 유도할 수 있다. 면역 반응에서 대식세포는 중요 역할을 하는 것으로 알려져 있으며, 점막 대식세포는 세균 제거, 항상성 유지 및 보호 면역에서 특히 중요한 기능을 하는 것으로 알려져 있다. 대식세포가 염증 자극에 노출되면, TNF-α, IL-1βIFN-γ와 같은 사이토카인과 다른 분자 (NO)를 분비한다. 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3가 사이토카인 및 NO 생산을 유도할 수 있는지 여부를 확인하기 위하여, TNF-α, IL-1β및 IFN-γ의 mRNA 사이토카인 유전자 발현 및 NO 생산 확인 실험을 수행하였다.
먼저 RAW264.7 세포를 96-웰 플레이트 (1 x 104 세포/웰)에 24시간 동안 플레이 팅하고 다양한 농도의 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물 25, 50, 100, 200, 300, 400, 500, 600 μg/ml 및 LPS (1 μg / mL)를 24 시간 동안 처리한 후 배양하였다. 100 μL의 배양 상등액을 첨가하여 100 μL의 Griess 시약과 반응시켰다. 15 분 동안 배양한 후, 흡광도는 575 nm에서 마이크로플레이트 리더로 관찰하였다. 아질산나트륨의 표준 곡선은 아질산염의 농도를 추정하기 위해 사용하였다. 또한, 사이토카인 발현을 정량화하기 위하여, ELISA 분석을 수행하였다. 그 결과 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 를 24시간 처리한 군에서 모두 NO 생산 및 사이토카인 분비의 증가가 유도되어 면역 활성 증진 효과가 확인되었고, 특히 100 μg/ml 이하의 농도에서 농도 의존적인 우수한 면역 활성이 나타나, 이를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 를 24시간 처리한 군에서 농도 의존적으로 NO 생산 및 사이토카인의 분비의 증가가 유도됨을 확인하였다. 이는 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3가 RAW264.7 세포의 대식세포에서 사이토카인 분비를 향상시킬 수 있음을 보여주는 결과이다.
2.3 비장 세포에서 사이토카인 분비 효과 확인
쿠르토박테리움 프로이뮨 K3가 파라프로바이오틱스로서 비장 세포에서 면역관련 사이토카인 생성 역시 유도할 수 있는지 여부를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 이를 위하여 쥐의 비장세포에 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물을 처리한 후, WST-8 분석을 수행하였다. BALB/c 마우스의 비장세포에 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물 25 내지 100 ㎍/mL을 24시간 동안 처리하였으며, ConA (1μg/mL) 를 양성 대조군으로 사용하였다. WST-8 분석 결과 및 정량화를 위한 ELISA 분석 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에 나타낸 바와 같이, T 세포 미토겐으로 면역 조절 사이토카인 TNF-α, IL-1β, IL-2, 및 IFN-γ 를 분비하는 것으로 알려진 ConA 처리군에서 대조군 대비 사이토카인 방출의 증가가 확인되었으며, 본 발명의 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 를 처리한 실험군에서도 세포 사멸 없이 유의한 TNF-α, IL-1β, IL-2, 및 IFN-γ 분비 증가가 확인되었다. 이러한 결과는 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물이 비장세포에서 사이토카인 발현을 촉진할 수 있음을 보여주는 결과이다.
단백질 발현 정량화를 위한 ELISA 분석 결과에서도 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물 처리군에서 TNF-α, IL-1β, IL-2, 및 IFN-γ 의 발현이 용량의존적으로 증가된 것을 확인하였다. 이러한 결과는 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물이 비장세포에서 다양한 면역 조절 사이토카인을 활성화 시킴으로써 면역자극효과를 나타낼 수 있다는 것을 보여주는 결과이다.
실시예
3. 면역억제 마우스에서
쿠르토박테리움
프로이뮨
K3 의
면역증강 효과 확인
3.1 기관 인덱스 및 선천 면역 효과 확인
쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물이 면역 조절 효과를 나타낼 수 있음을 보여주는 결과에 기초하여, 이의 면역 조절 효과를 in vivo 에서 추가적으로 확인하였다. In vivo 면역 실험을 위하여 시클로포스포아민(CTX)- 유도된 면역억제마우스를 이용하였고, 양성 대조군으로는 LMS 40mg/kg 처리군을 이용하였다. 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물 처리군은 처리 농도에 따라 C.proimmune K3 Ly-L (105 CFU/mL 처리군) 또는 C.proimmune K3 Ly-H(106CFU/mL 처리군)으로 나누어 수행하였다. 마우스의 체중은 실험 동안 매일 측정하였으며, 적응 기간 1주일 후 초기 체중에서는 유의한 변화가 관찰되지 않았다. 그러나, 대조군 그룹을 제외한 나머지 5마리 면역 억제 마우스 군은 대조군과 비교하여, CTX 처리 후 체중이 감소되는 것을 확인하였다. 그러나 CTX 처리군과 달리 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물 처리군에서는 전체 실험 기간 동안 체중의 변화가 관찰되지 않았다. 면역 관련 기관인 비장 및 흉선에서 기관 인덱스를 확인하고 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 4에 나타낸 바와 같이, CTX 에 의한 면역학적 장애에 대한 간접적 지표로 고려될 수 있는, 비장 및 흉선의 인덱스는 CTX 처리 이후 감소되는 것을 확인하였다 그러나 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물 처리군에 의하여 이러한 감소는 용량의존적으로 회복되었고, 양성 대조군으로 사용된 LMS 처리군보다 더 나은 정도의 비장 및 흉선 인덱스 회복 효과를 획인하였다. 이러한 결과는 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물이 마우스에서 CTX 에 의해 유도된 위축성 면역 기관에 효과를 나타낼 수 있음을 보여주는 결과이다.
3.2
NK
세포 활성 증진 효과 확인
쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물이 미생물 감염을 조절하고 면역 조절 역할을 하는 선천 면역 시스템의 효과기 림프구인 NK 세포 활성에도 영향을 미칠 수 있는지 여부를 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 비장 세포 현탁액을 상기 기재된 바와 같이 제조한 다음, 최종 밀도가 1 x 106세포/mL가 되도록 완전 RPMI-1640 배지 용액 내 현탁하여 96- 웰 플레이트 상에 위치시켰다. NK 세포 활성 분석을 위해 YAC-1 세포를 표적 세포로 사용하고 비장 세포 (이펙터 세포)와 함께 배양하였다. 비장 세포 현탁액을 YAC-1 세포 (1 x 105 세포/mL)에 첨가하여 96- 웰 플레이트에서 10 : 1의 효과기 대 표적 세포 비율을 얻었다. 450nm에서 WST-8 검출 키트 및 마이크로플레이트 리더를 사용하여 세포 생존력을 평가하였다. RPMI 1640 배지를 대조군으로 사용하였다. NK 세포 독성은 하기 수식을 통해 계산하였고, 그 결과를 도 5에 나타내었다.
NK 세포 독성(%) = (OD T - (OD S -OD E )) / OD T
- 여기서 OD T 는 표적 세포 대조군의 흡광도, OD S 는 테스트 샘플의 흡광도, OD E 는 효과기 세포 contrtols의 흡광도.
도 5에 나타낸 바와 같이, 대조군(Con) 마우스와 비교하여, CTX 처리된 마우스는 NK 세포 활성이 현저히 감소되었으며, 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물을 처리한 마우스에서는 감소된 NK 세포 활성이 뚜렷하게 향상되는 것을 확인하였다.
이러한 결과는, 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물이 CTX-유도된 선천 면역 억제에 대하여 효과를 나타낼 수 있음을 보여주는 결과이다.
3.3
비장세포
증식 효과 확인
CTX 처리된 마우스에 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물을 C.proimmune K3 Ly-L (105 CFU/mL 처리군) 또는 C.proimmune K3 Ly-H(106CFU/mL 처리군) 로 처리한 후, 이들이 비장 증식을 유도할 수 있는지 확인하기 위한 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, CTX 처리군에서는 비장 세포의 증식이 현저히 억제되었으나, 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물을 처리한 실험군에서 용량 의존적으로 회복되는 것을 확인하였다.
3.3 적응면역 효과확인
지연성 과민증 (Delayed hypersensitivity, DTH)은 개인의 기억 T 세포 기능을 반영하는 전형적인 세포 매개 면역 반응을 의미한다. 지연성 과민증 반응을 통해 적응 면역 효과를 평가하기 위하여 마우스의 복부 털을 제거하고 20 μL의 1 % 디니트로플루오로벤젠 (DNFB) 을 이용하여 마우스를 감작시켰으며, 감작 과정을 24 시간 후에 반복하였다. DNFB를 4 일 후 오른쪽 귀에 도포하였다. 24 시간 반응 후 모든 마우스의 양쪽 귀를 해당 부분에 5mm 구멍으로 펀칭하고 각 귀 부분의 무게를 기록하였고, 귀 부종의 정도를 각 마우스의 왼쪽 귀와 오른쪽 귀의 무게 차이로 표시하였다. 적응 면역 효과를 평가하기 위하여, 각 실험군에서 귀 부종의 변화를 확인하였고, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, CTX 를 주입한 군에서는 대조군 (Con) 군에 비하여, 귀 부종으로 확인되는 DTH 반응이 하향 조절되었다. 귀 부종의 정도는 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물 처리군에서 농도의존적으로 회복되었으며, 이는 LMS 처리군보다 더 우수한 효과를 나타내는 것으로 확인되었다.
상기와 같은 결과를 통해, 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 이 DTH 반응을 강화하고 면역 반응을 증진시키는 역할을 할 수 있음을 확인하였다.
3.4 혈청
IgA
및
IgG
함량 비교
면역 반응은 B-림프구에 의해 조절되는데, 이는 형질 세포로 분화하여 면역 글로불린 (IgA 및 IgG)을 생성하고 특정 항원과 결합하는 것으로 알려져 있다. ELISA를 이용한 혈청 IgA 및 IgG 함량 측정을 통해, 체액성 면역 반응 효과를 확인하였으며, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 8에 나타낸 바와 같이, CTX 처리된 마우스에서 대조군 마우스와 비교하여 혈청 IgA 및 IgG 수준이 크게 감소되었으나, 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물 처리군, 특히 고농도의 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물 처리군에서 혈청 IgA 및 IgG 수준이 증가하였다. 이는 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 가 CTX 처리 된 마우스에서 체액성 면역을 향상시킬 수 있음을 나타낸다.
3.5 사이토카인 분비 증진 효과 확인
본 발명의 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 처리가 혈청 사이토카인의 수준에 영향을 미치는지 확인하기 위한 실험을 수행하였다. 먼저 CTX 처리에 의하여 면역억제된 마우스에 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물을 투여하였으며, 혈청 내 TNF-α, IL-1β, IFN-γ 및 IgA 및 IgG (F) 의 수준을 확인하였고, 그 결과를 도 9에 나타내었다. 또한 면역관련 기관인 비장 및 흉선에서 각 사이토카인의 mRNA 발현양의 변화를 측정하고 그 결과를 도 10에 나타내었다.
도 9에 나타낸 바와 같이, CTX 주입에 의한 면역억제 반응으로 혈청 사이토카인은 유의하게 억제되었으나, 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물을 투여한 군에서는 TNF-α (A), IL-1β(B), IFN-γ(C), IgA (E) 및 IgG (F) 의 수준이 용량의존적으로 증가하는 것을 확인하였다.
도 10에서도 동일한 결과가 확인되었다. 구체적으로 CTX 주입은 비장 및 흉선 조직에서 사이토카인 (IL-2, TNF-α, IFN-γ 및 IL-1β 수준의 현저한 감소를 유도하였으나, 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물을 처리한 군에서는 모두 용량 의존적으로 CTX 그룹 마우스에 비해 IL-2, TNF-α, IFN-γ 및 IL-1β의 수준이 현저하게 증가한 것으로 나타났다. 이러한 결과는 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 이 면역 억제된 마우스의 비장 조직에서 사이토카인의 유전자 발현을 회복시킬 수 있음을 보여주는 결과이다.
실시예
4.
NF
-
κB
및
MAPKs
신호전달 경로에 대한 효과
NF-κB 신호 전달은 사이토카인 유전자 발현의 중요한 조절 인자이며 항 염증 치료 중재에 중요한 역할을 하며, MAPK를 활성화함으로써 세포 성장과 분화에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 또한, 사이토카인에 대한 세포 반응과 TNF-α, IL-2, IFN-γ와 같은 유전자의 관련 발현을 조절한다. 따라서 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물이 사이토카인 발현 조절에서 신호전달 경로에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 인산화된 NF-κB 및 IκBα를 포함하는 NF-κB 및 MAPK 단백질 및 인산화된 JNK, ERK 및 p38의 양을 각각 분석하였고, 그 결과를 도 11에 나타내었다.
도 11에 나타낸 바와 같이, CTX 처리군에서는 NF-κB 신호 및 MAPK 단백질의 활성화가 크게 억제되었으나, 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 용해물을 처리한 군에서는 인산화된 NF-κB, IκBα 및 인산화된 JNK, ERK, p38의 단백질 발현 감소가 회복되는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 이 NF-κB 및 MAPK 신호 전달 경로를 활성화하여 CTX에 의해 유도된 면역 억제를 회복시킬 수 있음을 보여주는 결과이다.
상기와 같은 결과를 통해, 본 발명의 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 가 면역관련 사이토카인의 mRNA 발현 및 분비를 촉진함으로써 RAW264.7 대식세포 (시험관 내) 및 비장 세포 (생체 외) 면역 활성화를 자극함을 확인하였다. 또한 in vivo 실험을 통해 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 이 내재 면역 및 적응 면역을 회복하여 면역 억제를 완화 시키고 IL-2, IFN-γ, TNF-a 및 IL-1β과 같은 사이토카인 생산을 현저히 향상시킬 수 있음을 확인하여, 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 이 면역증진 효과를 나타낼 수 있음을 확인하였다.
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proimmune K3
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<400> 1
ttttgagttt ttggtnccgg ctcaggacga acgctggcgg cgtgcttaac acatgcaagt 60
cgaacgatga tcaggagctt gctcttgtga ttagtggcga acgggtgagt aacacgtgag 120
taacctgccc ctgactctgg gataagcgtt ggaaacgacg tctaatactg gatacgactg 180
ccggccgcat ggtctggtgg tggaaagatt ttttggttgg ggatggactc gcggcctatc 240
agcttgttgg tgaggtaatg gctcaccaag gcgacgacgg gtagccggcc tgagagggtg 300
accggccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat 360
attgcacaat gggcgaaagc ctgatgcagc aacgccgcgt gagggatgac ggccttcggg 420
ttgtaaacct cttttagtag ggaagaagcg aaagtgacgg tacctgcaga aaaagcaccg 480
gctaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggtgc aagcgttgtc cggaattatt 540
gggcgtaaag agctcgtagg cggtttgtcg cgtctgctgt gaaatcccga ggctcaacct 600
cgggcttgca gtgggtacgg gcagactaga gtgcggtagg ggagattgga attcctggtg 660
tagcggtgga atgcgcagat atcaggagga acaccgatgg cgaaggcaga tctctgggcc 720
gtaactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac cctggtagtc 780
cacgccgtaa acgttgggcg ctagatgtag ggacctttcc acggtttctg tgtcgtagct 840
aacgcattaa gcgccccgcc tggggagtac ggccgcaagg ctaaaactca aaggaattga 900
cgggggcccg cacaagcggc ggagcatgcg gattaattcg atgcaacgcg aagaacctta 960
ccaaggcttg acatacaccg gaaacggcca gagatggtcg cccccttgtg gtcggtgtac 1020
aggtggtgca tggttgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt cccgcaacga 1080
gcgcaaccct cgttctatgt tgccagcgcg ttatggcggg gactcatagg agactgccgg 1140
ggtcaactcg gaggaaggtg gggatgacgt caaatcatca tgccccttat gtcttgggct 1200
tcacgcatgc tacaatggcc ggtacaaagg gctgcgatac cgtaaggtgg agcgaatccc 1260
aaaaagccgg tctcagttcg gattgaggtc tgcaactcga cctcatgaag tcggagtcgc 1320
tagtaatcgc agatcagcaa cgctgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc 1380
cgtcaagtca tgaaagtcgg taacacccga agccggtggc ctaaccctgg gaagagcctc 1440
aaggatgacc 1450
Claims (14)
- 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 (Curtobacterium proimmune K3) 균주 (기탁번호: KCTC14591BP).
- 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주 (기탁번호: KCTC14591BP), 이의 배양액 또는 이들의 무세포 추출물을 포함하는, 면역 증강용 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주는 생균 또는 사균인, 면역 증강용 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주는 열, 자외선, 방사선 조사, 고압 및 초음파로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 불활화 처리에 의하여 불활성화된 사균인 것을 특징으로 하는, 면역 증강용 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 면역 증강은 내재 면역 또는 적응 면역 증강인, 면역 증강용 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주 (기탁번호: KCTC14591BP), 이의 배양액 또는 이들의 무세포 추출물은 IL-2, IFN-γ, TNF-a 및 IL-1β 로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상 사이토카인의 발현을 증진시키는 것인, 면역 증강용 조성물.
- 제2항에 있어서, 상기 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주 (기탁번호: KCTC14591BP), 이의 배양액 또는 이들의 무세포 추출물은 혈청 IgA 또는 혈청 IgG 의 생성을 촉진하는 것인, 면역 증강용 조성물.
- 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주 (기탁번호: KCTC14591BP), 이의 배양액 또는 이들의 무세포 추출물을 포함하는, 면역 증강용 식품 조성물.
- 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주 (기탁번호: KCTC14591BP), 이의 배양액 또는 이들의 무세포 추출물을 포함하는, 면역 증강용 건강기능식품 조성물.
- 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주 (기탁번호: KCTC14591BP), 이의 배양액 또는 이들의 무세포 추출물을 포함하는, 면역 증강용 사료 조성물.
- 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주 (기탁번호: KCTC14591BP)이의 배양액 또는 이들의 무세포 추출물을 포함하는, 면역 증강용 화장료 조성물.
- 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주 (기탁번호: KCTC14591BP)이의 배양액 또는 이들의 무세포 추출물을 포함하는, 면역 증강용 약학적 조성물.
- 쿠르토박테리움 프로이뮨 K3 균주 (기탁번호: KCTC14591BP)를 불활화 처리하는 단계; 를 포함하는, 파라프로바이오틱스를 포함하는 면역 증강용 조성물의 제조방법.
- 제13항에 있어서, 상기 불활화 처리는, 자외선, 방사선 조사, 고압 및 초음파로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 불활화 처리인 것을 특징으로 하는, 파라프로바이오틱스를 포함하는 면역 증강용 조성물의 제조방법.
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2021
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