KR102176839B1 - 녹용 및 가시오갈피의 추출물을 포함하는 면역 증강용 조성물 및 그 제조방법 - Google Patents
녹용 및 가시오갈피의 추출물을 포함하는 면역 증강용 조성물 및 그 제조방법 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 면역 증강용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 녹용 및 가시오갈피의 발효 추출물을 포함하는 면역 증강용 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 천연물 유래의 안전하면서도 다양한 원인으로 인한 면역 결핍을 예방하고 치료할 수 있는 물질을 개발하였으며, 대식세포의 면역 활성을 높이고 바이러스의 억제능을 확인하였다.
본 발명의 조성물은 천연물 유래의 안전하면서도 다양한 원인으로 인한 면역 결핍을 예방하고 치료할 수 있는 물질을 개발하였으며, 대식세포의 면역 활성을 높이고 바이러스의 억제능을 확인하였다.
Description
본 발명은 면역 증강용 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 녹용 및 가시오갈피의 발효 추출물을 포함하는 면역 증강용 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
면역이란 생체가 자기 성분 이외의 물질 등이 생체의 항상성을 깨뜨리거나 자기를 위협하는 것을 배제하기 위해 일어나는 일련의 생체 방어 반응을 의미하며 피부, 소화관, 호흡기 등을 통해 침입한 유해물질로부터 신체를 보호하는 방어체계로 외부 자극물질을 제거하는 대식 작용을 하거나, 상처에 발생한 심각한 염증을 줄이는 작용을 통한 항상성 유지 활동이라고 할 수 있다. 면역기능이 결핍되거나 저하가 되면 면역반응이 제대로 활성화되지 못하여 체내의 이물질에 대한 반응을 제대로 못하여 감염을 일으키게 된다. 면역기능 증진과 관련된 영양소로는 Fe, Zn, Cu, Se 등을 포함한 무기질과 비타민 A, C, E와 B 비타민들과 특정한 아미노산이나 지방산 등도 관심을 모으고 있으나, 평상시의 생체에서 면역기능조절의 불균형을 이루는 원인으로는 영양 부족뿐만 아니라 선천적 요인과 외부적 요인에 의해 면역계 불균형이 진행될 수 있다. 예를 들어 선천적으로 체내 면역기능 부진으로 식세포가 제 기능을 못하는 경우가 있으며, 이러한 면역부진 상태는 또한 외부 바이러스의 인체(숙주) 침투를 야기하고 침투된 바이러스의 증식이 촉진되어 여러 감염 질환으로부터 취약하게 된다. 대식세포는 외부 바이러스에 식세포 작용(Phagocytosis)을 통해 대응하는 대표적인 면역세포이다. 식세포 작용이란 사전적 의미로는 세포가 환경으로부터 고형입자를 잡아들이는 활동이라 할 수 있는데, 예를 들어 외부부터 칩입한 병원균 등을 세포내로 잡아들어 세포 내 소화를 하는 현상을 말한다. 이러한 식세포 작용을 통해 유해 병원균(바이러스 및 세균 등)을 무력화 하는 우리 몸의 가장 중요한 1차 방어 기능이며 효과적인 보호 수단이 된다. 식세포는 단핵구(monocyte)가 분화하여 생기는 세포이며, 혈관을 빠져나가 조직에 들어가서 점차 크기가 커지고 식세포 작용이 왕성한 대식세포로 분화한다. 같은 미생물에 의한 감염일 경우에도, 면역력이 약화된 사람의 경우에는 그렇지 않은 사람에 비해 심각한 감염증이 나타날 수 있다.
바이러스의 경우 숙주 내 침투 후 잠복기를 거쳐 활성을 띄는데 이때 스스로 유전자를 복제함으로써 숙주 내에서 점차 증식하게 된다. 이러한 과정에서 숙주의 면역력이 저하된 상태일 경우에는 숙주 내 바이러스의 증식이 더욱 활발해져 결국 바이러스 감염에 의한 다양한 증상들의 발현하게 된다. 소아마비, 홍역 등이 대표적인 바이러스에 의한 질환이며 몇 가지 질환의 경우 백신의 개발로 질환의 예방이 가능해졌다. 하지만 아직도 다양한 바이러스에 대한 예방 및 치료법이 필요한 상태이며, 이러한 치료법에서 항생제와 항바이러스제의 과다 사용으로 인한 내성은 더욱 큰 사회 문제가 되고 있다. 따라서 평소 체내 내재 면역을 증진 시킬 수 있고 외부 바이러스의 감염 시 내성의 부작용 없이 바이러스의 증식을 막을 수 있는 천연물 혹은 건강기능식품의 개발의 필요성이 대두 되고 있다.
인체의 면역증강은 평소 다양한 세균과 바이러스 (세균성 감염질환, 감기, 에이즈 등)으로부터 우리 신체를 보호하게 된다. 하지만 이러한 면역증강이 정상범위 이상으로 발달하게 되면 인체 내 과잉면역반응을 초래하게 된다. 과잉면역반응이란, 체내 면역세포가 정상적인 세포를 이상(異常)세포로 인식하여 그 결과 정상세포가 면역세포로부터 공격을 받아 면역이 정상 이상으로 항진된 상태를 말하는데, 이러한 경우 아토피, 건성, 류마티스 관절염, 루푸스와 같은 만성염증질환 및 자가면역질환을 야기할 수 있다. 따라서 면역증강용 조성물의 유효성 평가는 과도한 면역반응이 아닌 정상 범위 내에서의 면역증강 효과일 때 그 의미가 있다.
녹용은 매화록(Cervus nippon Temminck)의 화녹용, 마록(Cervus elaphus Linn 
)의 마녹용, 대록(Cervus canadensis Erxleben)의 대녹용 3가지로 분류할 수 있다. 아직 골질화되지 않았거나 약간 골질화된 어린 뿔을 녹용이라 하고 이미 골질화된 것은 녹각이라 한다 녹용은 1년에 한번 자라는 뿔로 자라는 힘이 대단하여 하루에 최대 2cm씩 자란다. 녹용의 주요 성분은 여러 가지 유리 아미노산과 다당류, 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycans; GAGs), 강글리오사이드 (Ganglioside), 히알루론산(hyaluronic acid), 케라틴(keratin), 시알산(sialic acid), 콜레스테롤(cholesterol), 지방산, 인지질, 무기질 성분 등을 함유하는 것 으로 보고되었다. 사슴 뿔을 선단부터 종으로 보았을 때 분골(tip), 상대(upper section), 중대(mid section), 하대(base)의 네 부위로 나눈다. 녹용의 부위별 유 효 성분의 분포를 살펴보면, 화학 성분의 지표인 콜라겐, 회분, 칼슘을 비롯한 무 기질 성분은 녹용의 하대 부위로 내려갈수록 그 함량이 높아지고, 위로 올라갈수록 단백질, 지방, 글리코사미노글리칸, 강글리오사이드, 시알산, 우론산(uronic acid) 등의 활성성분 함량은 증가한다. 본 발명은 전지 부위인 분골, 상대, 중대 및 하대 부위를 사용하는 것이 바람직하다.
가시오갈피(Eleutherococ cus senticosus )는 산형화목 두릅나무과의 낙엽관목으로 가시오가피라고도 불린다. 전국 각지의 깊은 산골짜기에서 높이 2-3 m정도로 자라며 잎이 지는 떨기나무로 회갈색을 띄는데, 가늘고 긴 가시가 빽빽하게 나는 것이 특징으로 특히 잎자루 밑 부분에 많은 가시가 있다. 잎은 손바닥 모양으로 생긴 겹잎이 어긋나게 달리는데, 표면은 군데군데 털이 있고 뒷면은 어릴 때는 맥 위에 갈색털이 있으며 가장자리에 뾰족한 치아 모양의 톱니가 있다. 잎자루는 길이 3 ~8㎝로서 가시가 많다. 꽃은 7월 중순에서 8월 초에 연한 자주색이 도는 황색으로 피며, 산형꽃차례는 가지 끝에 1개씩 달리거나 또는 밑부분에서 갈라진다. 꽃자루가 갈라지는 곳에 꿀샘이 있다. 암술대는 길이 1~1.8㎝로서 완전히 합쳐지며, 암술머리는 아주 얕게 5갈래로 갈라진다. 열매는 둥글고 지름 8~10㎜로서 9월에 검은색으로 익는다. 오가(五加)'라는 한자는 산삼과 같이 잎이 다섯개가 붙어 있는 식물이란 뜻하는데, 가시오갈피는 손바닥 모양으로 펼쳐진 잎모양과 깊은 산속 그늘지고 부식질이 풍부한 토양에 자라는 생태적 특성이 유사한 것도 산삼과 닮아 있다.
본 발명자들은 천연물 유래의 안전하면서도 다양한 원인으로 인한 면역 결핍을 치료하고 예방할 수 있는 새로운 물질을 제공하고자 한다.
따라서, 본 발명자들은 천연 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물 및 그 제조방법을 제공하고자 하며, 천연 유효성분만으로 높은 바이러스 억제능과 면역력증강효과를 확인하고자 하였다.
상기의 목적을 달성하기 위하여 본 발명은 본 발명은 녹용 및 가시오갈피의 발효 추출물을 포함하는 면역 증강용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 a) 녹용 및 가시오갈피의 추출물을 각각 제조하는 단계;
b) 상기 a)단계에서 제조된 추출물을 각각 유산균, 바실러스속 균, 효모균 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 발효 균주로 발효시키는 단계;
c) 상기 제조된 발효 추출물을 여과하고 농축하는 단계; 및
d) 상기 c) 단계에서 제조된 녹용 및 가시오갈피의 발효 추출물을 혼합하는 단계;를 포함하는 면역 증강용 조성물의 제조방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 녹용과 가시오갈피의 발효 추출물을 유효 성분으로 함유하는 면역 증강용 식품 조성물을 제공한다.
본 발명에 따른 녹용 및 가시오갈피의 발효 추출물은 대식세포의 기능을 촉진하고 염증 반응을 억제함으로써 면역 체계가 활성화 되는 것을 확인할 수 있었다. 이는 발효공정을 통하여 생리활성 물질이 보다 많이 추출되고 새로운 생리활성 물질이 생성되는 것을 예측할 수 있으며, 세포 실험결과에서도 그 효과를 확인할 수 있었다. 또한, 동물모델의 실험결과에서도 면역 관련 사이토카인의 분비를 촉진시키고, B 세포와 T 세포의 면역세포를 활성화시켜 높은 면역증진 기능이 있음을 확인하였다. 본 발명의 조성물은 천연물에 유래한 것으로 안전하면서도 부작용이 없고 치료활성이 높은 새로운 면역 증강용 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 발효 녹용 추출물의 공정도이다.
도 2는 발효 가시오갈피 추출물의 공정도이다.
도 3은 녹용 추출물의 공정도이다.
도 4는 가시오갈피 추출물의 공정도이다.
도 5는 endotoxin 실험의 결과를 보여주는 것이다.
도 6은 세포생존율(WST assay) 실험의 결과를 보여주는 것이다. (A:녹용, B: 발효녹용, C:가시오갈피, D:발효가시오갈피, E: 녹용과 가시오갈피(7:3), F: 녹용과 가시오갈피 (5:5), G: 녹용과 가시오갈피(3:7), H:발효녹용과 발효가시오갈피(7:3), I:발효녹용과 발효가시오갈피(5:5), J: 발효녹용과 발효가시오갈피(3:7)
도 7은 대식세포 활동도 실험의 결과를 보여주는 것이다.
도 8은 Nitric acid 생성능 실험의 결과를 보여주는 것이다.
도 9는 사이토카인 특정결과를 보여주는 것이다. (A: IL-1
, B: IL-6, C: TNF-a)
도 10은 NK 세포의 활성화 평가실험의 결과를 보여주는 것이다.
도 11은 LP-BM5 면역결핍바이러스를 이용한 복제억제시험의 결과를 보여주는 것이다.
도 12는 LP-BM5 면역결핍바이러스를 이용한 바이러스 침투억제 시험의 결과를 보여주는 것이다.
도 13은 in-vivo 동물모델 실험의 프로토콜을 도식화한 것이다.
도 14는 MHC class Ⅰ 및 Ⅱ의 측정결과를 보여주는 것이다.
도 15는 CD4(+), CD8(+) 세포의 마커 발현 특성결과를 보여주는 것이다.
도 16는 T세포와 B세포의 증식뮬을 보여주는 것이다.(A:T세포, B: B 세포)
도 17은 CD4(+) T 세포에서 분비되는 Th1 사이토카인들의 측정결과를 보여주는 것이다.(A:IL-2, B:IFN-γ)
도 18은 Th2 사이토카인들의 측정결과를 보여주는 것이다.(A: IL-4, B: IL-6, C:IL-10, D: TNF-a)
도 19은 IL-12(A), IL-15(B)의 측정결과를 보여주는 것이다.
도 20는 NK 세포 활성도를 측정한 결과이다.
도 21은 혈중 NO의 생성능을 측정한 결과이다.
도 22은 혈중 면역글로불린의 측정 결과를 보여주는 것이다.(A: IgE, B: IgA, C:IgG)
도 23는 혈중 Leukocyte 측정결과를 보여주는 것이다.
도 2는 발효 가시오갈피 추출물의 공정도이다.
도 3은 녹용 추출물의 공정도이다.
도 4는 가시오갈피 추출물의 공정도이다.
도 5는 endotoxin 실험의 결과를 보여주는 것이다.
도 6은 세포생존율(WST assay) 실험의 결과를 보여주는 것이다. (A:녹용, B: 발효녹용, C:가시오갈피, D:발효가시오갈피, E: 녹용과 가시오갈피(7:3), F: 녹용과 가시오갈피 (5:5), G: 녹용과 가시오갈피(3:7), H:발효녹용과 발효가시오갈피(7:3), I:발효녹용과 발효가시오갈피(5:5), J: 발효녹용과 발효가시오갈피(3:7)
도 7은 대식세포 활동도 실험의 결과를 보여주는 것이다.
도 8은 Nitric acid 생성능 실험의 결과를 보여주는 것이다.
도 9는 사이토카인 특정결과를 보여주는 것이다. (A: IL-1
도 10은 NK 세포의 활성화 평가실험의 결과를 보여주는 것이다.
도 11은 LP-BM5 면역결핍바이러스를 이용한 복제억제시험의 결과를 보여주는 것이다.
도 12는 LP-BM5 면역결핍바이러스를 이용한 바이러스 침투억제 시험의 결과를 보여주는 것이다.
도 13은 in-vivo 동물모델 실험의 프로토콜을 도식화한 것이다.
도 14는 MHC class Ⅰ 및 Ⅱ의 측정결과를 보여주는 것이다.
도 15는 CD4(+), CD8(+) 세포의 마커 발현 특성결과를 보여주는 것이다.
도 16는 T세포와 B세포의 증식뮬을 보여주는 것이다.(A:T세포, B: B 세포)
도 17은 CD4(+) T 세포에서 분비되는 Th1 사이토카인들의 측정결과를 보여주는 것이다.(A:IL-2, B:IFN-γ)
도 18은 Th2 사이토카인들의 측정결과를 보여주는 것이다.(A: IL-4, B: IL-6, C:IL-10, D: TNF-a)
도 19은 IL-12(A), IL-15(B)의 측정결과를 보여주는 것이다.
도 20는 NK 세포 활성도를 측정한 결과이다.
도 21은 혈중 NO의 생성능을 측정한 결과이다.
도 22은 혈중 면역글로불린의 측정 결과를 보여주는 것이다.(A: IgE, B: IgA, C:IgG)
도 23는 혈중 Leukocyte 측정결과를 보여주는 것이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 녹용 및 가시오갈피의 발효 추출물을 포함하는 면역 증강용 조성물에 관한 것이다. 일 구현예에서는 상기 추출물은 감압고온추출, 열탕추출, 상온추출, 열수추출, 냉침 추출, 환류추출, 초음파 추출 또는 증기추출 방법으로 추출한 것이다. 일 구현예에서는 상기 발효 추출물은 유산균, 바실러스속 균, 효모균 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 발효 균주로 발효된 것이며, 바람직하게는 락토바실러스 플랜타룸 GSRB-K8 (Lactobacillus plantarum GSRB-K8, 기탁번호 KCCM 12675P)균주로 발효하는 것이다. 일 구현예에서는 상기 발효는 20 내지 60 ℃의 온도 조건 하에서 12 내지 48시간 동안 이루어지는 것이며, 바람직하게는 37℃에서 24시간동안 발효시키는 것이다. 일 구현예에서는 상기 조성물은 녹용 및 가시오갈피의 발효 추출물이 건조 중량으로 각각 3:7으로 혼합되는 것이다. 일 구현예에서는 상기 비율로 혼합된 발효 추출물이 150 내지 250 ㎍/ml의 농도인 것이다.
또한, 본 발명은 a) 녹용 및 가시오갈피의 추출물을 각각 제조하는 단계;
b) 상기 a)단계에서 제조된 추출물을 각각 유산균, 바실러스속 균, 효모균 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 발효 균주로 발효시키는 단계;
c) 상기 제조된 발효 추출물을 여과하고 농축하는 단계; 및
d) 상기 c) 단계에서 제조된 녹용 및 가시오갈피의 발효 추출물을 혼합하는 단계;를 포함하는 면역 증강용 조성물의 제조방법에 관한 것이다. 일 구현예에서는 상기 a)단계의 추출은 감압고온추출, 열탕추출, 상온추출, 열수추출, 냉침 추출, 환류추출, 초음파 추출 또는 증기추출 방법으로 추출한 것이며, 바람직하게는 추출은 80 내지 95℃에서 3시간 동안 가열하여 추출하는 열수 추출한 것이다. 일 구현예에서는 상기 b)단계의 발효는 20 내지 60 ℃의 온도 조건 하에서 12 내지 48시간 동안 이루어지는 것이며, 바람직하게는 37℃에서 24시간동안 발효시키는 것이다. 일 구현예에서는 발효는 락토바실러스 플랜타룸 GSRB-K8 (Lactobacillus plantarum GSRB-K8, 기탁번호 KCCM 12675P)균주로 발효하는 것이 바람직하다. 일 구현예에서는 상기 c)단계이후에 각 농축된 발효 추출물을 건조시키는 단계를 추가로 포함하는 것이다. 일 구현예에서는 상기 d) 단계는 녹용 및 가시오갈피의 발효 추출물이 건조 중량으로 각각 3:7으로 혼합되는 것이다. 일 구현예에서는 상기 혼합된 녹용 및 가시오갈피의 발효 추출물이 150 내지 250 ㎍/ml의 농도인 것이며, 가장 바람직하게는 200 ㎍/ml의 농도인 것이다.
또한, 본 발명은 녹용 및 가시오갈피의 발효 추출물을 유효 성분으로 함유하는 면역 증강용 식품 조성물에 관한 것이다. 일 구현예에서는 상기 추출물은 상기 녹용 및 가시오갈피의 발효 추출물이 건조 중량으로 각각 3:7으로 혼합되는 것이며, 바람직하게는 혼합된 발효 추출물이 150 내지 250 ㎍/ml의 농도로 함유되는 것이며, 가장 바람직하게는 200 ㎍/ml의 농도인 것이다. 일 구현예에서는 상기 식품 조성물은 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제, 천연 탄수화물, 영양제, 비타민제, 증점제, pH 조절제, 방부제 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 첨가제를 추가로 포함하는 것이다.
본 발명은 녹용 및 가시오갈피의 발효 추출물을 포함하는 면역 증강용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 a) 녹용 및 가시오갈피의 추출물을 각각 제조하는 단계;
b) 상기 a)단계에서 제조된 추출물을 각각 유산균, 바실러스속 균, 효모균 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 발효 균주로 발효시키는 단계;
c) 상기 제조된 발효 추출물을 여과하고 농축하는 단계; 및
d) 상기 c) 단계에서 제조된 녹용 및 가시오갈피의 발효 추출물을 혼합하는 단계;를 포함하는 면역 증강용 조성물의 제조방법에 관한 것이다. 상기 녹용 및 가시오갈피의 발효 추출물이 건조 중량으로 1: 0.5 내지 5의 조성으로 혼합될 수 있으며, 바람직하게는 1:1내지 3의 조성으로 혼합되는 것이며, 가장 바람직하게는 3:7으로 혼합되어 발효되는 것이다. 본 발명은 녹용 및 가시오갈피의 추출물로 본 발명의 조성물은 상기한 약재들 외에도 맛이나 풍미 등을 위해 당업계에서 통상적으로 첨가하는 약재들도 추가적으로 포함할 수 있다. 또한, 상기 비율로 혼합된 발효 추출물이 150 내지 250 ㎍/ml의 농도로 함유되는 조성물이 바람직하다. 유효성분이 충분한 약리효과를 나타내도록 하기 위하여 함량이 150 ㎍/ml이상이 되어야 하며, 250 ㎍/ml이상에서는 비용증가 대비 더 높은 약효를 기대하기 어려울 것이다. 가장 바람직하게는 200 ㎍/ml인 것이다.
또한, 본 발명의 조성물은 내복용이나 외용으로 사용하기 위하여 약재를 추출하여 제조되는 추출물들을 포함할수 있다. 일 구현 예에서, 본 발명의 조성물은 약재들 각각의 추출물을 혼합하여 포함할 수 있고, 다른 구현 예에서는 혼합된 약재로부터 얻어진 추출물을 포함할 수 있다.
이때 녹용 또는 가시오갈피의 추출물은 통상의 추출방법을 이용하여 제조될 수 있다. 즉 추출 용매를 상기 약재에 가하여 고온에서 저압 또는 고압 조건에서 추출하는 방법을 사용할 수 있다. 추출방법으로는 감압고온추출, 열탕추출, 상온추출, 열수추출, 냉침 추출, 환류추출, 초음파 추출 또는 증기추출 방법으로 추출한 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 추출 용매로서는, 예를 들어 물, 탄소수 1 내지 4의 저급 알콜 또는 이들을 혼합한 혼합 용매를 사용할 수 있다. 용매의 사용량에는 특별한 제한이 있는 것은 아니나, 추출 효율, 조성물의 효능 또는 경제성 등을 고려할 때 용매의 양은 추출 대상 약재의 건조 중량 대비 1 내지 50배 정도 사용할 수 있으며, 바람직하게는 2 내지 10배 첨가하여 2 시간 내지 5시간 가열하여 추출하는 것이 보다 바람직하다. 열수 추출의 경우 추출 온도는 80 내지 95℃인 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 또한, 추출시간은 3시간이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다. 아울러 추출 횟수는 1 내지 5회인 것이 바람직하나, 이에 한정하지 않는다.
본 발명의 녹용 및 가시오갈피는 건조된 상태에서 절단된 형태 또는 분말의 형태로 발효공정을 거칠 수 있으며, 바람직하게는 추출물 제조단계에서 발효시키는 것이다. 발효는 유산균, 바실러스속 균, 효모균 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 발효 미생물을 이용하는 것이다. 녹용 및 가시오갈피의 유효 성분을 최대한으로 추출할 수 있도록 하는 것이며, 손실없이 빠르고 균일하게 유효성분을 함유하도록 함으로써 약리효과를 극대화시킬 수 있다. 발효는 20 내지 60 ℃의 온도 조건 하에서 12 내지 48시간 동안 발효시켜 얻을 수 있다. 바람직하게는 37℃에서 24시간동안 발효시키는 것이다. 유산균은 스트렙토코커스(Streptococcus) 속, 락토코커스(Lactococcus) 속, 엔테로코커스(Enterococcus) 속, 락토바실러스(Lactobacillus) 속, 페디오코커스(Pediococcus) 속, 류코노스톡(Leuconostoc) 속, 바이셀라(Weissella) 속 및 비피도박테리움(Bifidobacterium) 속으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 균주인 것이 바람직하지만 이에 한정하지 않으며, 더욱 바람직하게는 락토바실러스 플랜타룸균(Lactobacillus plantarum)이며, 가장 바람직하게는 락토바실러스 플랜타룸 GSRB-K8 (Lactobacillus plantarum GSRB-K8, 기탁번호 KCCM 12675P, 한국미생물보존센터)균주로 발효하는 것이다.
일 구현 예에서, 본 발명의 조성물은 각각의 약재(이때, 각 약재는 추출 전 분쇄기로 분쇄하거나 잘게 자른 것을 이용할 수 있다)를 적정한 용매를 이용하여 추출한 후 이를 혼합하여 제조될 수도 있으며, 혼합 약재를 함께 추출하여 추출 당시부터 각 추출물이 혼합된 형태로 제조할 수 있다.
다음으로, 상기 발효 추출물을 여과하여 불순물을 제거한다. 상기 여과 방법으로는 특별히 제한은 없으며, 당업계의 통상적인 방법을 사용하여 여과할 수 있다. 구체적으로 50 내지 200 mesh의 미세 여과지를 통과시킴으로써 불순물이 제거된 추출물을 얻을 수 있다. 또한 70℃에서 F/P(퍼라이트2%)로 여과시킬 수 있다. 따라서 본 발명에 있어서, 추출물은 상기 추출 및 발효 공정을 거쳐 분획, 농축, 건조 또는 정제의 각 단계에서 얻어지는 모든 추출액, 분획 및 정제물, 그들의 희석액, 농축액 또는 건조물을 모두 포함하는 개념이다. 농축 단계 이후의 살균 및 건조는 통상의 방법으로 이루어질 수 있으며, 농축은 15 brix이상에서 이루어지고, 90 내지 95℃에서 2시간 이상 건조되는 것이 바람직하다.
한편, 상기 추출물을 감압 증류 및 동결 건조 또는 분무 건조 등과 같은 추가적인 과정에 의해 분말 상태로 제조한 후 이러한 분말을 사용할 수도 있음은 물론이다.
또한, 본 발명에 따른 조성물은 일 구현예에서, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 상세하게는, 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다.
또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜 (propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물은 유효 성분으로써 녹용 및 가시오갈피의 혼합 발효추출물 이외에 약제학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있는데, 이러한 약제학적으로 허용되는 담체는 약품 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 또한 첨가제로서 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다.
상기 담체는 본 발명의 조성물에 그것의 전체 중량에 대하여 약 1 중량 % 내지 약 99.99 중량 %, 바람직하게는 약 90 중량% 내지 약 99.99 중량 %로 포함될 수 있으며, 상기 첨가제는 약 0.1 중량 % 내지 약 20 중량 %로 포함될 수 있다.
본 발명의 조성물은 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엘렉시르제, 엑스제, 분말제, 과립제, 정제, 경고, 도고제, 로션, 연고 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 조성물은 그 1일 투여량이 통상 0.001 ~ 150 mg/kg 체중 범위이고, 1회 또는 수회로 나누어 투여할 수 있다. 그러나, 본 발명의 조성물의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중, 환자의 중증도 등의 여러 관련 인자에 비추어 결정되는 것이므로 상기 투여량은 어떠한 측면으로 든 본 발명의 범위를 제한하는 것으로 이해되어서는 아니 된다.
또한, 본 발명은 녹용 및 가시오갈피의 발효 추출물을 포함하는 면역 증강용 식품 조성물에 관한 것이다. 일 구현예에서는 상기 식품 조성물은 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제, 천연 탄수화물, 영양제, 비타민제, 증점제, pH 조절제, 방부제 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 첨가제를 추가로 포함하는 것이다.
또한, a) 녹용 및 가시오갈피의 추출물을 각각 제조하는 단계;
b) 상기 a)단계에서 제조된 추출물을 각각 유산균, 바실러스속 균, 효모균 및 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 발효 균주로 발효시키는 단계;
c) 상기 제조된 발효 추출물을 여과하고 농축하는 단계; 및
d) 상기 c) 단계에서 제조된 녹용 및 가시오갈피의 발효 추출물을 혼합하는 단계;를 포함하는 제조방법에 의해 제조된 녹용과 가시오갈피의 발효 추출물을 유효 성분으로 함유하는 면역 증강용 식품 조성물에 관한 것이다. 일 구현예에서는 상기 추출물은 상기 녹용 및 가시오갈피의 발효 추출물이 건조 중량으로 각각 3:7으로 혼합되는 것이며, 바람직하게는 혼합된 발효 추출물이 150 내지 250 ㎍/ml의 농도로 함유되는 것이며, 가장 바람직하게는 200 ㎍/ml의 농도인 것이다. 일 구현예에서는 상기 식품 조성물은 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제, 천연 탄수화물, 영양제, 비타민제, 증점제, pH 조절제, 방부제 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 첨가제를 추가로 포함하는 것이다.
본 발명의 상기 식품 조성물은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강식품(health food)및 식품 첨가제(food additives)등의 모든 형태를 포함한다. 상기 유형의 식품 조성물은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
예를 들면, 건강 식품으로는 상기 조성물 자체를 차, 주스 및 드링크의 형태로 제조하여 음용하도록 하거나, 과립화, 캡슐화 및 분말화하여 섭취할 수 있다. 또한 기능성 식품으로는 음료(알콜성 음료 포함), 과실 및 그의 가공식품(예: 과일통조림, 병조림, 잼, 마말레이드 등), 어류, 육류, 및 그 가공식품(예: 햄, 소시지 콘비프 등), 빵류 및 면류(예: 우동, 메밀국수, 라면, 스파게티, 마카로니 등), 과즙, 각종 드링크, 쿠키, 엿, 유제품(예: 버터, 치즈 등), 식용식물유지, 마아가린, 식물성 단백질, 레토르트 식품, 냉동식품, 각종 조미료(예: 된장, 간장, 소스 등)등에 추출물을 첨가하여 제조할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물을 식품 첨가제의 형태로 사용하기 위해서는 분말 또는 농축액 형태로 제조하여 사용할 수 있다.
본 발명의 식품용 조성물 중 상기 추출물의 바람직한 함량은 식품용 조성물 총 중량에 대하여 0.001 내지 50% 일 수 있으며, 바람직하게는 0.01 내지 30% 범위로 함유될 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 기능성 식품 조성물은 정제, 환제, 과립제, 분말제, 액제, 경질캅셀제, 연질캅셀제 등과 같은 일반적인 제형으로 제조될 수 있으며, 죽, 빵, 음료, 바, 초콜릿, 쿠키, 차, 드링크제, 비타민 복합제, 육류, 소시지, 캔디, 면, 젤리 등과 같은 임의의 형태로 제조될 수 있다.
상기와 같은 여러 제형 또는 형태를 제조하기 위해, 전술한 부형제들과 같은 식품학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 사용할 수 있으며, 제조하고자 하는 제형 또는 형태의 제조에 당해 기술 분야에서 사용 가능한 것으로 공지되어 있는 임의의 담체 또는 첨가제가 이용될 수 있다.
이하, 발명의 구체적인 실시예를 통해, 발명의 작용 및 효과를 보다 상세하게 설명하기로 한다. 다만, 이러한 실시예는 발명의 예시로 제시된 것에 불과하며, 이에 의해 발명의 권리범위가 정해지는 것은 아니다.
실시예 1-1. 녹용발효추출물의 제조
도 1에 도시된 바와 같이, 녹용의 전지를 건조, 거모 및 마쇄한 후, 10 배수의 물을 가한 후 80~95℃ 에서 3시간동안 열수 추출하여 냉각하였다. 락토바실러스 플랜타룸 GSRB-K8 (Lactobacillus plantarum GSRB-K8, KCCM 12675P) 균주 1 x 109 ~ 1 x 1010 cfu 농도로 접종하여 37℃에서 24시간 동안 발효시킨 후 효소반응을 시켰다. 85℃에서 실활한 후 여과와 농축을 통해 건조하여 분말 형태로 추출물을 수득하였다.
실시예 1-2. 가시오갈피 발효추출물의 제조
도 2에 도시된 바와 같이, 가시오갈피 줄기부분을 마쇄한 후, 10 배수의 물을 가한 후 80~95℃ 에서 3시간동안 1차 추출하고 전사에 또한 10배수의 물을 가하여 2차 추출하였다. 락토바실러스 플랜타룸 GSRB-K8 (Lactobacillus plantarum GSRB-K8, KCCM 12675P) 균주 1 x 109 ~ 1 x 1010 cfu 농도로 접종하여 37℃에서 24시간 동안 발효시킨다. 이들 혼합물을 여과하고 농축한 후 부형제를 첨가하고 살균 후 건조하여 분말 형태로 추출물을 수득하였다.
[비교예1]
비교예 1-1. 녹용 추출물의 제조
도 3에 도시된 바와 같이, 녹용의 전지를 건조, 거모 및 마쇄한 후, 10 배수의 물을 가한 후 80~95℃ 에서 3시간동안 열수 추출하여 냉각 후 효소반응을 시켰다. 85℃에서 실활한 후 여과와 농축을 통해 건조하여 분말 형태로 추출물을 수득하였다.
비교예 1-2. 가시오갈피 추출물의 제조
도 4에 도시된 바와 같이, 가시오갈피의 줄기부분을 마쇄한 후, 10 배수의 물을 가한 후 80~95℃ 에서 3시간동안 1차 추출하고 전사에 또한 10배수의 물을 가하여 2차 추출하였다. 이들 혼합물을 여과하고 농축한 후 부형제를 첨가하고 살균 후 건조하여 분말 형태로 추출물을 수득하였다.
[실험예 1]
상기에서 제조된 실시예 1-1 및 1-2 및 비교예 1-1 및 1-2의 분말을 아래의 표 1의 농도와 같이 다양한 조성과 농도의 추출물을 이용하여 다음과 같이 in-vitro 실험을 수행하였다.
| No. | 시 료 | 농도 (μg/ml) |
| 1 | 녹용 추출물(D) | 50, 200 |
| 2 | 발효 녹용 추출물(FD) | 50, 200 |
| 3 | 가시오갈피 추출물(E) | 50, 200 |
| 4 | 발효 가시오갈피 추출물(FE) | 50, 200 |
| 5 | 녹용+가시오갈피 추출물(DE) (7:3) | 50, 200 |
| 6 | 녹용+가시오갈피 추출물(DE) (5:5) | 50, 200 |
| 7 | 녹용+가시오갈피 추출물(DE) (3:7) | 50, 200 |
| 8 | 발효녹용+발효가시오갈피 추출물(FDE) (7:3) | 50, 200 |
| 9 | 발효녹용+발효가시오갈피 추출물(FDE) (5:5) | 50, 200 |
| 10 | 발효녹용+발효가시오갈피 추출물(FDE) (3:7) | 50, 200 |
| 11 | 홍삼 분말(양성대조군, PC) | 50, 200 |
실험예 1-1. 세포 배양
실험에 사용된 Raw264.7, Yac-1 cell은 American Type Cultured Collection(ATCC; Rockville, MD, USA)에서 분양 받아 실험하였다. 10 % fetal bovine serum (FBS), 1 % penicillin-streptomycin (100 units/mL)이 함유된 Roswell Park Memorial Institue medium (RPMI-1640)배지를 사용하였고, 37 ℃, 5% CO2, 95% humidair로 조절된 배양기(Thermo Fisher Scientific Inc., Pittsburgh, PA, USA)에서 배양하였다.
RAW 264.7 세포는 American Type Cultured Collection(ATCC; Rockuille, MD, USA)에서 분양받아 실험하였다. 10% fetal bovine serum(FBS)(Hycolone laboratories, Logan, Utah, USA), 100mg/L penicillin-streptomycin(Hycolone laboratories, Logan, Utah, USA), 2mmol/L L-glutamine(Hycolone laboratories, Logan, Utah, USA), sodium pyruvate(Hycolone laboratories, Logan, Utah, USA)이 포함된 High-glucose Dulbeco? modified Eagle? medium(DMEM)을 이용하여 37℃, 5% CO2에서 배양하였다.
실험예 1-2. Endotoxin test
각 시료들의 endotoxin을 측정하기 위하여, Esvaran 등(Esvaran M, Conway PL. (2018) Lactobacilli can attenuate inflammation in mouse macrophages exposed to polyethlyene particles in vitro. BMC Res Notes 11: 567.)의 방법을 참고하였고, ToxinSensorTM Chromogenic LAL Endotoxin Assay kit (Genscript, Piscataway, NJ,를 사용하여 USA) 수행하였다. endotoxin-free vial에 standard와 각 시료들을 100μL씩 분주하고, blank well에는 LAL Reagent water 100 μL씩 분주하였다. 각 well에 reconstituted LAL 100 μL씩 분주하고, 잘 섞어주었으며, 37 ℃에서 반응시킨 후, chromogenic substrate solution 100 μL씩 분주하여 잘 섞어 주었다.
37 ℃에서 6분간 방치시킨 후, Color-stabilizer #1 500 μL씩 분주하여 잘 섞어 주었고, 이어서 Color-stabilizer #2 500 μL씩 분주하여 잘 섞어 주었다. Color-stabilizer #3 500 μL씩 분주하여 잘 섞어 준 다음 545nm에서 흡광도를 측정하였다. 그 결과는 도 5에 나타내었다.
상기 녹용, 가시오갈피, 발효녹용, 발효가시오갈피, 녹용+가시오갈피(7:3), 녹용+가시오갈피(5:5), 녹용+가시오갈피(3:7), 발효녹용+발효가시오갈피(7:3), 발효녹용+발효가시오갈피(5:5) 및 발효녹용+발효가시오갈피(3:7) 조성물의 endotoxin을 측정한 결과, 모든 시료에서 <0.006 EU/mL (0.006 이하)로 음성을 나타내었다.
실험예 1-3. 세포 생존율 시험 (WST assay)
각 시료들의 적정 처리농도를 결정하기 위해서 세포 생존율 시험(Water soluble tetrazolium salt; WST assay)을 수행하였고, Chatterjee 등(Chatterjee N, Eom HJ, Choi JH. (2014) A systems toxicology approach to the surface fucnctionality control of graphene-cell interactions. Biomaterials 35: 1109-1127.)의 방법을 참고하였고, EZ-CYTOX (Daeillab service co., Ltd, seoul, Korea)를 사용하여 수행하였다. Raw254.7 세포를 96well plate에 1x104cells/well로 분주하여 24시간 동안 배양한 후, 각 well에 시료를 농도별로 처리하였다. 24시간 후, 각 well ekd EX-Cytox 10μL/ 100 μL를 첨가하여 2시간 incubator에서 반응 시켰다. 흡광도를 측정하기전 1분정도 부드럽게 shaking 하였고, ELISA reader (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA)로 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
실험은 Raw264.7 세포주에 대한 평가를 대표적으로 수행하였는데 Raw264.7 세포주는 대식세포 계열로서 세로의 maintenance와 비활성화된 형태로 유지하기가 매우 까다로울 만큼 예민한 세포이므로 splenocyte에 비해 훨씬 물질에 대한 영향을 많이 받는다. 따라서 유사 면역세포를 대표하여 천연소재에 대한 세포독성을 통해 향후 본 실험에 사용될 적정농도를 판단하고 그 결과를 도 6에 나타내었다.
조성물 1 내지 4의 각각 녹용, 발효녹용, 가시오갈피, 발효가시오갈피는 공통적으로 200 μg/mL 농도까지 세포생존율이 80% 이상으로 세포독성이 나타나지 않았다. 조성물 5 내지 7의 녹용+가시오갈피 7:3, 5:5, 3:7 의 시료들에서는 공통적으로 200 μg/mL 농도까지 세포생존율이 80% 이상으로 세포독성이 나타나지 않았다.
조성물 8 내지 11의 발효녹용+발효가시오갈피 7:3, 5:5, 3:7 의 시료에서는 공통적으로 200 μg/mL 농도까지 세포생존율이 80% 이상으로 세포독성이 나타나지 않았다.
실험예 1-4. 대식세포 성능(phahocytosis) 활성능
Phagocytosis 활성능을 측정하기 위하여 Trivedi 등(Trivedi MK, Jana S. (2019) In vitro evaluation of immunomodulatory effects of the test formulation by the estimation of natural killer cells and phagocytosis activities. Cell Cellular lif Sci J 4(1): 000137.) 의 방법을 참고하였고, Cytoselect 96-well phagocytosis assay(zymosan Substrate) kit (Cell Biolabs, INC, USA)를 사용하였다. Raw464.7 세포를 배양하여 96-well plate의 각 well에 1x104cells/wel로 seeding 하여 24시간 배양한 후, 각 sample을 농도별로 처리하여 37 ℃, 5% CO2에서 24시간 배양하였다. 각 해당 well에 inhibitor 2.5μL와 zymosan 10 μL를 분주하고 37 ℃에서 반응시킨 후, washing 작업을 하였고, fixation solution 100 μL/well 씩 분주하여 실온에서 5분간 방치시켰다. washing 작업 후 blocking reagent 100 μL씩 분주하고 shaker로 잘 섞으면서 1시간동안 방치 시킨후, 상층액 제거하고 washing 작업을 3번 반복하였다. 각 well에 Permeabiliztion solution 100 μL씩 분주 한 후 실온에서 5분간 반응 시키고, washing 작업을 해준 후, Detection reagent 100 μL씩 분주하여 실온에서 1시간 반응시켰다. 상층액을 제거한 후 washing 작업을 3번 반복한 후, Detection buffer 50 μL씩 분주하여 shaker를 사용하여 실온에서 10분간 혼합하였다. 각 well substrate 100 μL 분주하여 20분간 37℃에서 반응 시킨 후 ELISA reader (Bio-Rad)로 415nm에서 흡광도를 측정하였다.
대식세포는 면역반응 세포 젓 하나이며, 혈액, 비장, 간, 임파선등에 널리 분포되어 있으며, 체내의 조직에 대부분 존재하여 외부 항원을 직접 탐식하여 분해, 사멸, 제거하는 phagocytosis기능을 가짐으로 면역반응에 매우 중요한 역할을 담당하는 세포이다 또한 임파구로 하여금 그 . T 항원을 인식하게 하여 면역반응을 유도하고 B임파구로 하여금 항체를 만드는 중요한 역할도 수행하는 세포이기도 하다. 따라서 본 연구에서는 대식세포를 활성화 하는 zymosan과 함께 실험에 사용된 천연소재 및 유산균 및 유산균배양액의 처리가 대식세포주인 Raw264.7 세포의 활성에 미치는 영향을 관찰하였고 그 결과를 도 7에 나타내었다.
Phagocytosis의 활성을 측정한 결과, 양성대조군(PC)인 홍삼의 경우, 대조군(C) 대비 50, 200 μg/mL 두 농도 모두에서 유의성이 나타났고, 농도의존적인 경향을 나타내었다.
비 발효 시료인 녹용(D)의 경우, 대조군(C) 대비 200 μg/mL의 농도에서만 유의성을 나타내었고, 가시오갈피(E)의 경우, 50, 200 μg/mL 두 농도 모두에서 유의성이 나타났다.
발효녹용(FD)과 발효가시오갈피(FE)의 경우, 대조군(C) 대비 50, 200 μg/mL 두 농도 모두에서 유의성이 나타났고, 농도의존적인 경향을 나타냈으며, 발효녹용 보다 발효가시오갈피의 활성이 더 높게 나타났다.
녹용+가시오갈피 혼합조성물(DE)인 DE 7:3, DE 5:5, DE 3:7의 경우, 모두 농도의존적인 경향이 나타났으나, 대조군(C) 대비 200 μg/mL의 농도에서 유의성이 나타났다. 특히 DE 3:7 비율의 혼합조성물에서 가장 활성이 높게 나타났다.
발효녹용+발효가시오갈피 혼합시료(FDE)인 FDE 7:3, FDE 5:5, FDE 3:7의 경우, 50, 200 μg/mL 두 농도 모두에서 유의성이 나타났고, 농도의존적인 경향이 나타났으며, 특히 FDE 3:7 비율의 혼합시료에서 가장 활성이 높게 나타났다.
비발효과 발효시료를 비교할 경우, 비발효보다 발효시료가 특히 FDE 3:7의 시료에서 phagocytosis 활성능이 가장 높게 나타났다.
실험예 1-5. Nitric oxide 생성능
Nitric oxide 생성능을 측정하기 위하여 Ll venes 등(Ll venes P, Balfag n G, Blanco-Riveroa J. (2018) Thyroid hormones affect nitrergic innervation function in rat mesenteric artery: Role of the PI3K/AKT pathway. Vascular Pharmacology 108: 36-45.)의 방법을 참고하였고, Nitric Oxide Assay Kit (abcam, cambridge, MA, USA)를 사용하였다. Raw364.7 cell을 96 well plate에 2X106 cells/well로 분주하여, 24시간동안 37℃, 5% CO2에 배양하였고, Sample을 농도별로로 처리하여 37℃, 5% CO2에서 24시간동안 배양하였다. 세포를 모아 cold PBS로 washing 하여 assay buffer 100μL씩 분주하였고 균질화시켰다. 원심분리기 (4℃, 14000 rpm, 5min)로 상층액을 분리하여 새로운 tube에 옮겨 assay sample로 사용하였다. assay 용 96well plate에 standard, sample을 85 μL 씩 분주하였고, Nitrate reductase와 Enzyme cofactor을 5 μL씩 분주하였으며, plate sealer를 씌워 실온에서 1시간 방치하였다. 각 well에 Enhancer 5 μL씩 분주하여 실온에 10분 더 반응시킨 후, Griess Reagent R1과 R2를 각각 50 μL 씩 분주하여 반응시키며 ELISA reader (Bio-Rad) 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
탐식작용을 하는 동안 대식세포에서는 탐식된 병원균을 죽이기 위하여 다양한 독성 물질들을 생산, 중요한 독성물질 중 하나가 NO이며, 선천 면역과 적응 면역 간 경계에서 중요한 역할을 하여 세균, 바이러스, 미생물 등의 병원균을 사명시키는 매개체로 작용한다. 본 실험에서의 결과는 도 8에 나타내었다.
NO의 생성량을 측정한 결과, 양성대조군(PC)인 홍삼의 경우, 대조군(C) 대비 50, 200 μg/mL 두 농도 모두에서 유의성이 나타났고, 농도의존적인 경향을 나타내었다.
비 발효 시료인 녹용(D)의 경우, 대조군(C) 대비 200 μg/mL의 농도에서만 유의성을 나타내었고, 가시오갈피(E)의 경우, 50, 200 μg/mL 두 농도 모두에서 농도 의존적인 경향과 함께 유의성이 나타났다.
발효녹용(FD)의 경우, 대조군(C) 대비 농도의존적인 경향이 나타났으나 200 μg/mL 농도에서 유의성이 나타났고, 발효가시오갈피(FE)의 경우, 대조군(C) 대비 50, 200 μg/mL 두 농도 모두에서 유의성이 나타났고, 농도의존적인 경향을 나타냈으며, 발효녹용보다 발효가시오갈피의 억제능이 더 뛰어났다.
녹용+가시오갈피 혼합시료(DE)인 DE 7:3, DE 5:5, DE 3:7의 경우, 모두 농도의존적인 경향이 나타났으나, DE 7:3와 DE 5:5는 대조군(C) 대비 200 μg/mL 농도에서 유의성이 나타났고, DE 3:7은 50, 200 μg/mL 두 농도 모두에서 유의성이 나타났다.
발효녹용+발효가시오갈피 혼합시료(FDE)인 FDE 7:3, FDE 5:5, FDE 3:7의 경우, 50, 200 μg/mL 두 농도 모두에서 유의성이 나타났고, 농도의존적인 경향이 나타났으며, 특히 FDE 3:7이 억제능이 가장 뛰어났다.
비발효과 발효시료를 비교할 경우, 비 발효보다 발효시료가 특히 FDE 3:7의 시료에서 NO 억제능이 가장 뛰어났다.
실험예 1-6. pro-inflammatory cytokines 측정 (IL-1
, IL-6, TNF-a)
Pro-inflammatory cytokines를 측정하기 위하여 Xu 등(Xu N, An J. (2017) Formononetin ameliorates mast cell mediated allergic inflammation via inhibition of histamine release and production of pro-inflammatory cytokines. Exp Ther Med 14: 6201-6206.)의 방법을 참고하였고, Mouse IL-1
, IL-6, TNF-a ELISA kit (R&D system, Minneapolis, MN, USA)를사용하였다. Assay 하루 전, ELISA용 96well plate에 capture antibody 100 μL씩 분주하여 준비해두고, Cell culture용 96well plate에 Raw264.7 세포를 2X106 cells/well로 분주하여, 24시간 배양시켰으며, Sample을 농도별로로 처리하여 24 시간 더 배양시켰다. 96well plate를 원심분리하여 상층액을 수집하여 assay sample로 사용하였다. capture antibody가 포함된 96well plate를 3번 washing 하여 blocking buffer 300 μL씩 분주하여 실온에서 1시간 방치시켰고, washing 작업 후, standard와 sample을 100 μL씩 분주하여 plate sealer를 씌워 실온에서 2시간 방치시켰다. washing 작업 후, 각 well에 Detection antibody 100 μL씩 분주하여 plate sealer를 씌워 실온에서 2시간 방치시켰으며 washing 작업 후, streptavidin-HRP 100 μL 씩 분주하여 빛을 차단하고 실온에서 20분간 반응시켰다. washing 작업 후, 각 well에 substrate 100 μL씩 분주하였으며 60분간 반응시키면서 ELISA reader (Bio-Rad) 655 nm에서 흡광도를 측정하였다.
활성화된 대식세포는 IL-1
, IL-6, TNF-a등의 cytokines를 분비하여 면역계 세포를 활성화 시키고 적응면역반응을 유발시킴으로서 감연인자를 제거하는 염증반응을 활성화시킨다. 본 실험의 결과는 도 9.에 나타내었다.
IL-1
를 측정한 결과, 양성대조군(PC)인 홍삼의 경우, 대조군(C) 대비 50, 200 μg/mL 두 농도 모두에서 유의성이 나타났고, 농도의존적인 경향을 나타내었다. 비 발효 시료인 녹용(D)과 가시오갈피(E)의 경우, 대조군(C) 대비 농도의존적인 경향이 나타났으나 유의성이 나타나지 않았다.
발효녹용(FD)의 경우, 대조군(C) 대비 농도의존적인 경향이 나타났으나 유의성이 나타나지는 않았고, 발효가시오갈피(FE)의 경우, 대조군(C) 대비 농도의존적인 경향이 나타났으며, 200 μg/mL 농도에서 유의성이 나타났다.
녹용+가시오갈피 혼합시료(DE)인 DE 7:3, DE 5:5, DE 3:7의 경우, 대조군(C) 대비 모두 농도의존적인 경향이 나타났으나, DE 5:5와 DE 3:7의 200 μg/mL 농도에서만 유의성이 나타났다.
발효녹용+발효가시오갈피 혼합시료(FDE)인 FDE 7:3, FDE 5:5, FDE 3:7의 경우, 대조군 대비 모두 (C) 농도의존적인 경향이 나타났으나, 모두 200 μg/mL 농도에서만 유의성이 나타났다.
비발효과 발효시료를 비교할 경우, 비 발효보다 발효시료가 특히 FDE 3:7 200μg/mL 농도에서 IL-1
생성 억제능이 가장 뛰어났다.
IL-6를 측정한 결과, 양성대조군(PC)인 홍삼의 경우, 대조군(C) 대비 50, 200 μg/mL 두 농도 모두에서 유의성이 나타났고, 농도의존적인 경향을 나타내었다.
비 발효 시료인 녹용(D)과 가시오갈피(E)의 경우, 대조군(C) 대비 농도의존적인 경향이 나타났으나 E 200 μg/mL 농도에서만 유의성이 나타났다.
발효녹용(FD)과 발효가시오갈피(FE)의 경우, 대조군(C) 대비 농도의존적인 경향이 나타났으나, 200 μg/mL 농도에서만 유의성이 나타났다.
녹용+가시오갈피 혼합시료(DE)인 DE 7:3, DE 5:5, DE 3:7의 경우, 대조군(C) 대비 모두 농도의존적인 경향이 나타났으나, DE 5:5와 DE 3:7의 200 μg/mL 농도에서만 유의성이 나타났다.
발효녹용+발효가시오갈피 혼합시료(FDE)인 FDE 7:3, FDE 5:5, FDE 3:7의 경우, 대조군(C) 대비 모두 농도의존적인 경향이 나타났으나, 모두 200 μg/mL 농도에서만 유의성이 나타났다.
비발효과 발효시료를 비교할 경우, 비 발효보다 발효시료가 특히 FDE 3:7 200μg/mL 농도에서 IL-6 생성 억제능이 가장 뛰어났다.
TNF-a를 측정한 결과, 양성대조군(PC)인 홍삼의 경우, 대조군(C) 대비 50, 200μg/mL 두 농도 모두에서 유의성이 나타났고, 농도의존적인 경향을 나타내었다.
비 발효 시료인 녹용(D)과 가시오갈피(E)의 경우, 대조군(C) 대비 농도의존적인 경향이 나타났으나 E 200 μg/mL 농도에서만 유의성이 나타났다.
발효녹용(FD)과 발효가시오갈피(FE)의 경우, 대조군(C) 대비 농도의존적인 경향이 나타났으나, 200 μg/mL 농도에서만 유의성이 나타났다.
녹용+가시오갈피 혼합시료(DE)인 DE 7:3, DE 5:5, DE 3:7의 경우, 대조군(C) 대비 모두 농도의존적인 경향이 나타났으나, 200 μg/mL 농도에서만 유의성이 나타났다.
발효녹용+발효가시오갈피 혼합시료(FDE)인 FDE 7:3, FDE 5:5, FDE 3:7의 경우, 대조군(C) 대비 모두 농도의존적인 경향이 나타났으며, FDE 7:3 50 μg/mL농도를 제외한 나머지 모든 농도에서 유의성이 나타났다.
비발효과 발효시료를 비교할 경우, 비 발효보다 발효시료가 특히 FDE 3:7 200μg/mL 농도에서 TNF-a 생성 억제능이 가장 뛰어났다.
실험예 1-7. Yac-1 cell 에 대한 Natural killer cell (NK cell) 활성화 평가 (LDH assay)
분리한 splenocyte를 96well plate에 각 well당 5X105cells/well씩 분주한다. 표적세포는 Yac-1 cell로 1X104cells/well씩 분주한다. Sample을 농도별로로 처리하여 37℃, 5% CO2에서 4시간동안 배양하였다. 배양 후 상층액 50ul을 새로운 plate에 분주하고 Cytotox 96 Non-radioactive Cytotoxicity assay kit (Promega Corporation, Madison, WI, USA)를 이용하여 ELISA reader (Bio-Rad)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 NK cell의 활성도를 측정하였다.
자연살해세포는 과거에 항원을 인식한 적이 없는 상태에서도 활성화되어 반응하기 때문에 선천면역에서 virus에 감염된 세포, 종양세포, 또는 비정상적인 세포를 인지하여 사멸시키는 역할을 하며 IL-2, IL-12, IL-15 등의 대식세포에서 분비되는 cytokines에 의해 자극되어 활성화되며 IFN-γ등의 분비를 증가시킨다.
또한 자연살해세포는 MHC class I 발현의 변화를 인식하여 감염되지 않는 정상세포에 공격을 막음으로 감염된 세포와 결합하여 선택적으로 세포사멸을 유도시킨다. 자연살해세포가 제거할 수 있는 대상은 다양하게 알려져 있지만 자연살해세포의 활성능에 이용되고 있는 세포는 mouse의 경우 Moloney virus-induced lymphoma 세포주인 YAC-1 세포가 가장 널리 알려져 있다. 따라서 본 연구에서는 YAC-1 세포를 target cell로 설정하고 자연살해세포를 effector cell로 설정하여 co-culture하여 천연소재들의 처리가 자연살해세포 활성에 미치는 영향을 관찰하였고 그 결과를 도 10 에 나타내었다.
먼저, Yac-1 세포에 대한 NK cell 의 활성을 검토한 결과 정상적인 반응을 관찰하였다.
양성대조군(PC)인 홍삼의 경우, 정상대조군(NC) 대비 50, 200 μg/mL 두 농도 모두에서 유의성이 나타났고, 농도의존적인 경향을 나타내었다.
비 발효 시료인 녹용(D)과 가시오갈피(E)의 경우, 정상대조군(NC) 대비 농도의존적인 경향이 나타났으나 D 200 μg/mL과 E 50, 200 μg/mL 농도에서 유의성이 나타났다.
발효녹용(FD)과 발효가시오갈피(FE)의 경우, 정상대조군(NC) 대비 농도의존적인 경향이 나타났으며, 50, 200 μg/mL 두 농도 모두에서 유의성이 나타났다.
녹용+가시오갈피 혼합시료(DE)인 DE 7:3, DE 5:5, DE 3:7의 경우, 정상대조군(NC) 대비 모두 농도의존적인 경향이 나타났으며, 50, 200 μg/mL 두 농도 모두에서 유의성이 나타났다.
발효녹용+발효가시오갈피 혼합시료(FDE)인 FDE 7:3, FDE 5:5, FDE 3:7의 경우, 정상대조군(NC) 대비 모두 농도의존적인 경향이 나타났으며, 50, 200 μg/mL 두 농도 모두에서 유의성이 나타났다.
비발효과 발효시료를 비교할 경우, 비 발효보다 발효시료가 특히 FDE 3:7 200μg/mL 농도에서 NK cell의 활성능이 가장 뛰어났다.
실험예 1-8. SC-1/LP-BM5 virus 유전자 복제 억제능 및 감염력 측정
SC-1/LP-BM5 virus 유전자 복제 억제능을 측정하기 위해 SC-1(CRL-1404)와 SC-1(LP-BM5) 세포주를 12well plate에 1X105cells/well씩 co-culture하여 4시간 안정화 후 sample을 농도별로 처리하여 37℃, 5% CO2에서 24시간동안 배양하였다. SC-1/LP-BM5 virus host 침투 억제능 측정의 경우, SC-1(CRL-1404)를 6well plate에 1X106cells/well씩 분주하고 4시간 안정화 시킨 후, SC-1(LP-BM5)를 배양했던 배양액과 sample을 농도별로 처리하여 37℃, 5% CO2에서 24시간동안 배양하였다. 이 두 가지 모델은 RNA 추출을 위하여 RNeasy extraction kit(Qiagen, Gaithersburg, Maryland, USA)로 제조사의 protocol에 따라 실험이 진행되었으며, cDNA 합성을 위하여 iScript cDNA synthesis kit(Bio-Rad)를 사용하였다. 유전자들의 발현을 측정하기 위하여 SYBR Green (iQ SYBR Green Supermix, Bio-Rad )을 이용한 실시간 정량 PCR을 실시하였고, 기기는 CFXConnectTM Real-Time System (Bio-Rad)을 사용하였다. 각각의 유전자에 대한 PCR primer의 염기서열은 아래 표 2와 같다. Real time PCR 반응은 총 20 μL 내에 cDNA 2 μL와 2X SYBR mix 10 μL 첨가하였다. forward, reverse primer는 각각 100 pmol/μL를 1 μL씩 첨가하였으며, 나머지는 H2 O로 채워주었다. 증폭cycle은 40 cycle을 실시하였으며, 증폭 단계는 다음과 같다. Hot start를 위해 95℃에서 10분, 증폭 단계의 denaturation을 95℃에서 15초, annealing을 60℃에서 1분30초, extension을 72℃에서 30초간 반복하며, 각 cycle의 extension 후에 값이 기록되었다. 모든 cycle이 완료된 후 primer의 특이성을 확인하기 위해 melting curve 분석을 실시하였다. 결과의 분석은 Bio-rad에서 제공하는 CFX Manager Software 3.1로 분석하였다.
| Gene | Murine sequences |
| LP-BM5 | F 5'-CCAATGTGTCCATGTCATTT-3' R 5'-GCGATGAGCAGAGAGAGAAAG-3' |
| GAPDH | F 5'-CATGGCCTTCCGTGTTCCTA-3' R 5'-GCGGCACGRCAGATCCA-3' |
GAPDH, glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase
통계처리는 SPSS (Statistical Package for the Social Science) version 22 프로그램을 이용하여 분석하였으며, 모든 측정 결과는 평균(mean)±표준편차(standarddeviation, SD)로 표시하였다. 그룹간의 통계적 유의성을 Duncan? multiple range test를 실시하였으며 p<0.05 수준에서 유의성의 여부를 검증하였다.
LP-BM5 면역결핍바이러스 유전자가 삽입되어 있는 SC-1 세포주를 활성화 시키면 삽입되어 있던 바이러스 유전자도 활성화되어 복제에 필요한 단백질을 만들게 되는데 이때 생성되는 mRNA를 측정함으로서 어느 정도 복제가 일어나는 지 확인할 수 있다. 본 실험에서는 이러한 SC-1 바이러스 삽입 세포주의 특성을 이용해서 천연소재의 바이러스 복제억제능력을 확인하였고, 그 결과는 도 11에 나타내었다. 먼저, 활성화된 세포에서 바이러스 mRNA가 증가하였음을 확인함에 따라 본 실험에 필요한 활성화가 정상적으로 발생하고 있음을 알 수 있었다.
먼저 양성대조군(PC)인 홍삼의 경우, 50-200 ug/mL 범위에서 농도의존적으로 유의적인 바이러스 mRNA 전사를 억제하였음을 확인하였다.
비 발효 시료인 녹용(D)과 가시오갈피(E)의 경우, 대조군(C) 대비 농도의존적인 경향이 나타났으나 200 μg/mL 농도에서만 유의적인 바이러스 mRNA 전사를 억제하였음을 확인하였다.
발효녹용(FD)과 발효가시오갈피(FE) 경우, 대조군(C) 대비 농도의존적인 경향이 나타났으나 200 μg/mL 농도에서만 유의적인 바이러스 mRNA 전사를 억제하였음을 확인하였다.
녹용+가시오갈피 혼합시료(DE)인 DE 7:3, DE 5:5, DE 3:7의 경우, 대조군(C) 대비 모두 농도의존적인 경향이 나타났으며, 200 μg/mL 농도에서 유의적인 바이러스 mRNA 전사를 억제하였음을 확인하였다.
발효녹용+발효가시오갈피 혼합시료(FDE)인 FDE 7:3, FDE 5:5, FDE 3:7의 경우, 대조군(C) 대비 모두 농도의존적인 경향이 나타났으며, FDE 50 μg/mL를 제외한 모든 군에서 유의적인 바이러스 mRNA 전사를 억제하였음을 확인하였다.
비발효과 발효시료를 비교할 경우, 비 발효보다 발효시료가 특히 FDE 3:7 200μg/mL 농도에서 바이러스 mRNA 전사 억제능이 가장 뛰어났다.
LP-BM5 virus 면역결핍바이러스를 이용한 바이러스 host 침투억제 시험을 위하여, LP-BM5 면역결핍바이러스 유전자가 삽입되어 있는 SC-1 세포주를 활성화 시켜 배양하면 복제된 바이러스가 배양액으로 분비되어 나오게 되는데 이 배양액을 바이러스 유전자가 없는 SC-1 세포에 함께 주입을 하게 되면 바이러스가 세포에 침투해서 에 삽입되게 된다 따라서 DNA.삽입된 DNA의 수를 측정하면 실제 세포에 침투한 바이러스를 예측할 수 있음으로 본 실험에서는 특성을 이용해서 천연소재의 바이러스 복제억제능력을 확인하였고 그 결과를 도 12.에 나타내었다.
먼저, 바이러스가 함유된 배양액을 SC-1 에 처리한 결과 DNA 가 삽입되어 약 38% 정도 증가한 것을 확인하였다.
양성대조군(PC)인 홍삼의 경우, 50~200 ㎍/ml 범위에서 유의적으로 바이러스 DNA의 삽입을 억제하였음을 확인하였다.
비 발효 시료인 녹용(D)과 가시오갈피(E)의 경우, 대조군(C) 대비 농도의존적인 경향이 나타났고, 50, 200 μg/mL 두농도 모두에서 유의적인 바이러스 DNA의 삽입을 억제하였고, 고농도에서 보다 효과가 있음을 확인하였다.
발효녹용(FD)과 발효가시오갈피(FE)의 경우역시, 대조군(C) 대비 농도의존적인 경향이 나타났고, 50, 200 μg/mL 두농도 모두에서 유의적인 바이러스 DNA의 삽입을 억제하였고 고농도에서 보다 효과가 있음을 확인하였다.
녹용+가시오갈피 혼합시료(DE)인 DE 7:3, DE 5:5, DE 3:7의 경우, 대조군(C) 대비 모두 농도의존적인 경향이나타났고, 50, 200 μg/mL 두농도 모두에서 유의적인 바이러스 DNA의 삽입을 억제하였고, 고농도에서 보다 효과가 있음을 확인하였다.
발효녹용+발효가시오갈피 혼합시료(FDE)인 FDE 7:3, FDE 5:5, FDE 3:7의 경우, 대조군(C) 대비 모두 농도의존적인 경향이 나타났고, 50, 200 μg/mL 두농도 모두에서 유의적인 바이러스 DNA의 삽입을 억제하였고, 고농도에서 보다 효과가 있음을 확인하였다.
비발효과 발효시료를 비교할 경우, 비 발효보다 발효시료가 특히 FDE 3:7 200μg/mL 농도에서 바이러스 DNA의 삽입을 억제능이 가장 뛰어났다.
[실험예 2]
상기에서 제조된 실시예 1-1 및 1-2 및 비교예 1-1 및 1-2의 분말을 상기 표 1의 농도와 같이 다양한 조성과 농도의 추출물을 이용하여 다음과 같이 in-vivo 스크리닝을 위하여 면역저하 동물모델을 이용한 면역증진 유효성 평가를 하였다.
실험예 2-1. 동물모델의 제작
본 실험에서는 ㈜새론바이오(Uiwang-si, Korea)에서 20 g 내외의 4주령 수컷C57BL/6M 마우스를 공급받았다. 명암은 12시간(light/dark cycle), 온도는 23±2℃, 상대습도는 50±5%인 조건에서 1주 동안 적응기를 거쳐 실험에 이용하였다. 도 13과 같은 프로토콜로 진행하였으며, 적응기간 동안 AIN-93G 식이와 음용수는 자유롭게 섭취하도록 하였으며 체중을 측정하여 평균체중에 가까운 개체를 무작위 법으로 8마리씩 7군으로 분리하였다. 각 군의 정보는 표 3에 나타내었다. 적응기간이 끝나고 시료의 섭취는 2주간 경구투여로 진행하였으며, 희생 4일전 첫 강 제수영운동을 실시하였고, 3일간의 휴식기를 거쳐 희생 하루전 2차 강제수영운동을 실시하였으며, 희생당일 3차 강제 수영운동을 실시하였다. 강제수영운동은 한계수영을 기준으로 진행되었다. 실험동물은 12시간 절식시킨 후 마취시켜 개복하여 복대동맥을 통해 채혈하였다. 전혈을 sample로 사용해야하는 경우, 채혈 전 주사기와 tube에 10% EDTA solution을 충분히 적셔 혈액응고를 방지하였고, 장기무게를 측정한 후 실험에 필요한 spleen은 splenocytes로 분리하였다. 본 연구는 경희대학교 동물실험윤리위원회의 승인을 받아 진행하였다(KHUASP-19-409).
| Groups | forced swimming exercise | Oral intake |
| Normal Control | - | AIN 93G diet |
| Control | + | AIN 93G diet |
| Positive control | + | AIN 93G diet + Red ginsend 300 mg/kg b.w. |
| FD 200 | + | AIN 93G diet + FD 200 mg/kg b.w. |
| FE 200 | + | AIN 93G diet + FE 200 mg/kg b.w. |
| FDE (3:7) 50 | + | AIN 93G diet + FDE 50 mg/kg b.w. |
| FDE (3:7) 200 | + | AIN 93G diet + FDE 200 mg/kg b.w. |
실험예 2-2. Weight, Food intake, FER, 장기무게 측정
발효녹용(FD), 발효가시오갈피(FE), 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)를 2주간 경구투여한 마우스를 대상으로 강제수영운동을 진행하여 유도한 면역저하 모델의 weight gain, food intake, FER, 및 장기무게를 측정한 결과는 표 4에 나타내었다.
Weight gain, food intake의 경우 정상대조군(normal control), 강제수영운동대조군(control), 양성대조군(positive control), 발표녹용(FD)200μg/mL, 발효가시오갈피(FE)200μg/mL, 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)50군, 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)200μg/mL에서 모두 유의적인 차이를 나타내지 않았다.
Food efficiency rate 값을 구한 결과, 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)200μg/mL의 경우 강제수영운동대조군(control) 대비 감소하는 경향이 나타났으나 모든 군과 비교 시 유의적인 차이를 나타내지 않았다.
장기무게를 측정한 결과, 비장(spleen)의 경우, 정상대조군(normal control) 대비 강제수영운동대조군(control)에서 증가하는 경향이 나타났으나 유의성이 나타나지는 않았고, 강제수영운동대조군(control) 대비 발효가시오갈피(FE)200 μg/mL, 발효 녹용+발효가시오갈피(FDE)50 μg/mL 및 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)200 μg/mL에서 유의적으로 감소하는 결과가 나타났다.
간(liver)의 경우, 정상대조군(normal control) 대비 강제수영운동대조군(control)에서 증가하는 경향이 나타났으나 유의성이 나타나지는 않았고, 강제수영운동대조군(control) 대비 발효녹용(FD)200 μg/mL, 발효가시오갈피(FE)200 μg/mL, 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)50 μg/mL 및 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)200 μg/mL에서 감소하는 경향이 나타났으나 유의성을 나타내지는 않았다.
신장(kidney)의 경우 정상대조군(normal control) 대비 강제수영운동을 한 모든 군에서 감소하는 경향을 나타냈지만 유의성이 나타나지는 않았다.
| Groups | Forced simming exercise | ||||||
| Normal control | Control | positive control | FD 200 | FE 200 | FDE 50 | FDE 200 | |
| Weight gain(g) | 6.10±0.95a | 6.13±1.16a | 6.08±0.75a | 5.89±0.74ab | 5.75±0.91ab | 5.94±0.78ab | 5.06±0.81a |
| Food intake(g/day/mouse) | 2.74±0.19ns | 2.66±0.17 | 2.88±0.18 | 2.78±0.11 | 2.87±0.05 | 2.85±0.13 | 2.66±0.02 |
| FER ** | 1.98±0.31ab | 2.06±0.39a | 1.88±0.23ab | 1.89±0.24ab | 1.85±0.29ab | 1.86±0.24ab | 1.70±0.27b |
| Tissue weights(g) | |||||||
| Spleen | 0.09±0.01ab | 0.10±0.01a | 0.09±0.01ab | 0.09±0.01ab | 0.08±0.01b | 0.08±0.01b | 0.07±0.01b |
| Liver | 1.28±0.07b | 1.35±0.10ab | 1.46±0.13a | 1.31±0.13b | 1.29±0.06b | 1.26±0.06b | 1.27±0.09b |
| Kidney | 0.30±0.03a | 0.28±0.01b | 0.29±0.01ab | 0.29±0.01ab | 0.28±0.01b | 0.27±0.02b | 0.27±0.02b |
실험예 2-3. 비장세포(splenocytes)분리
비장세포의 분리를 위해 마우스에서 분리한 비장을 10% fetal bovine serum(FBS), 2 mmol/L glutamine, 100 mg/L penicillin-streptomycin을 첨가한 RPMI 1640으로 세척하고 0.45 μm cell strainer를 사용하여 세포 부유액을 만들었다. 원심분리(1600rpm, 5min)하여 Red blood cell lysing buffer (SigmaAldrich Co, St. Louis, MO, USA) 1mL 분주한 후, 5분간 실온에 방치하였으며 다시 원심분리하여 적혈구 용혈작업을 1번 더 반복하였다. 이어서 원심분리하여 배양액으로 한번 더 세척함으로서 비장세포로 분리하였다.
실험예 2-4. MHC Ⅰ, Ⅱ 측정
상기 실험예 2-3에서 분리한 splenocytes를 3X106 cells/tube 으로 분주하였고, 원심분리(1600rpm, 5min)하여 상층액을 제거하고 Flow Cytometry Staining Buffer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA)로 세척하여, MHC class ⅠMonoclonal antibody(Thermo Fisher Scientific), MHC class ⅡMonoclonal antibody (Thermo Fisher Scientific) 및 Tcell marker인 Anti-mouse CD45-PE/CY7 (SouthernBiotech, Birmingham, AL, USA)를 붙이고, 빛을 차단하여 30분간 ice에 보관하였다. Flow Cytometry Staining Buffer로 2번 세척해준 후, Flow Cytometry Staining Buffer 200 μL /tube 씩 분주하여 CytoFLEX(Beckman coulter, Brea, CA, USA)를 사용하여 cell number를 레이져로 counting 하였다. 결과의 분석은 Beckman coulter에서 제공하는 CytExpert 2.2 program을 사용하였다.
항원을 인식하는 antigen presentign cell에서 발현되는 MHC class Ⅱ 및 CD8(+) cell의 성숙과 cell death로 이어지는 MHC class Ⅰ의 수를 측정한 결과는 도 14에 나타내었다.
CD8(+) T cell의 성숙과 관련이 MHC class Ⅰ의 발현을 측정한 결과, 정상 대조군(NC)대비 강제수영운동대조군(C)에서 유의적으로 감소하였고, 양성대조군(PC)의 경우, 강제수영운동대조군(C) 대비 유의적으로 증가하였으며, 발효가시오갈피(FE)200μg/mL과 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)200μg/mL에서는 유의적으로 증가하였다.
CD4(+) T cell의 성숙으로 이어지는 MHC class Ⅱ의 발현을 측정한 결과, 정상대조군(NC)대비 강제수영운동대조군(C)에서 유의적으로 감소하였고, 양성대조군(PC)의 경우, 강제수영운동대조군(C) 대비 유의적으로 증가하였으며, 발효녹용(FD)200μg/mL, 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)50군 및 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)200μg/mL에서는 유의적으로 증가하였다.
MHC class Ⅰ와 Ⅱ의 발현을 비교한 결과, MHC class Ⅰ보다는 MHC class Ⅱ의 발현량이 많았으며, 이는 CD4(+) T cell의 cell number에도 영향을 미칠 것으로 여겨진다.
실험예 2-5. CD4(+), CD8(+) 측정
분리한 splenocytes를 3X106 cells/tube 으로 분주하였고, 원심분리(1600rpm, 5min)하여 상층액을 제거하고 Flow Cytometry Staining Buffer (Thermo Fisher Scientific)로 세척하여, Anti-Mouse CD4-FITC (SouthernBiotech), Anti-Mouse CD8a-PE-/CY5.5 (SouthernBiotech) 및 Tcell marker인 Anti-mouse CD45-PE/CY7 (SouthernBiotech)를 붙이고, 빛을 차단하여 30분간 ice에 보관하였다. Flow Cytometry Staining Buffer로 2번 세척해준 후, Flow Cytometry Staining Buffer 200 μL /tube 씩 분주하여 CytoFLEX(Beckman coulter) 를 사용하여 cell number 레이져로 counting 하였다. 결과의 분석은 Beckman coulter에서 제공하는 CytExpert 2.2 program을 사용하였다.
항원을 인식하는 antigen presenting cell에서의 MHC class Ⅱ의 발현과 MHC class Ⅰ은 CD4(+) T cell과 CD8(+) T cell의 활성화와 관련이 있으며, 이를 측정한 결과는 도 15에 나타내었다.
우선, splenocytes 젓에서 T cell marker인 CD45에 염색된 single cell을 sorting하여 positive한 영역에서 나타나는 CD4(+) T cell과 CD8(+) T cell을 다시 sorting하였다.
MHC class Ⅱ의 발현으로부터 성숙되는 CD4(+) T cell의 cell number를 측정한 결과, 정상대조군(NC)대비 강제수영운동대조군(C)에서 유의적으로 감소하였고, 양성대조군(PC)의 경우, 강제수영운동대조군(C) 대비 유의적으로 증가하였으며, 발효녹용(FD)200 μg/mL, 발효가시오갈피(FE)200 μg/mL, 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)50 μg/mL 및 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)200 μg/mL에서는 유의적으로 증가하였다. 특히 발효가시오갈피(FE)200 μg/mL과 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)200 μg/mL에서 정상대조군(NC)에 가까운 수치를 나타내었다.
MHC class Ⅰ의 발현과 관련이 있는 CD8(+) T cell의 cell number를 측정한 결과, 정상대조군(NC)대비 강제수영운동대조군(C)에서 유의적으로 감소하였고, 양성대조군(PC)의 경우, 강제수영운동대조군(C) 대비 유의적으로 증가하였으며, 발효녹용(FD)200 μg/mL, 발효가시오갈피(FE)200 μg/mL, 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)50 μg/mL 및 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)200 μg/mL에서는 유의적으로 증가하였다. 특히 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)군의 경우 농도 의존적인 결과를 나타냈으며, 녹용+발효가시오갈피(FDE)200 μg/mL에서 가장 높은 cell number를 기록하였다.
CD4(+)/CD8(+) ratio의 경우 역시 정상대조군(NC)대비 강제수영운동대조군(C)에서 유의적으로 감소하였고, 나머지 모든 군에서 강제수영운동대조군(C) 대비 유의적으로 증가하였다.
CD4(+) T cell과 CD8(+) T cell의 cell number를 비교한 결과, CD8(+) T cell보다 CD4(+) T cell 수가 더 많았는데, 이는 MHC class Ⅱ의 발현량이 많았던 결과로 부터 도출된 결과임을 짐작할 수 있다.
실험예 2-6. T/B cell proliferation 측정
분리한 splenocytes를 96well plate에 5X105 cells/well 으로 분주하였고, T cell용 plate에는 Con-A (5 μg/mL)를, B cell 용 plate에는 LPS (5 μg/mL)를 분주하여 48시간 배양하였다. EZ-CYTOX (Daeillab service co., Ltd, seoul, Korea)를 사용하여 수행하였으며, 48시간 동안 배양한 후, 각 well에 EX-Cytox 10μL/100 μL를 첨가하여 2시간 incubator에서 반응 시켰다. 흡광도를 측정하기 전 1분정도 부드럽게 shaking 하였고, ELISA reader (Bio-Rad)로 450nm에서 흡광도를 측정하였다.
Antigen presenting cell에서 발현된 MHC class Ⅱ의 변화는 T cell 및 B cell의 proliferation에 영향을 미치며 그 결과는 도 16에 나타내었다.
T cell proliferation을 측정한 결과, 정상대조군(NC)대비 강제수영운동대조군(C)에서 유의적으로 감소하였고, 양성대조군(PC)의 경우, 강제수영운동대조군(C) 대비 유의적으로 증가하였으며, 발효녹용(FD)200μg/mL, 발효가시오갈피(FE)200μg/mL, 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)50군 및 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)200μg/mL에서는 유의적으로 증가하였다. 특히 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)군의 경우 농도 의존적으로 증가하는 경향이 나타났고, 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)200μg/mL에서 양성대조군(PC)에 가까운 수치를 나타내었다.
B cell proliferation을 측정한 결과, 정상대조군(NC)대비 강제수영운동대조군(C)에서 유의적으로 감소하였고, 양성대조군(PC)의 경우, 강제수영운동대조군(C) 대비 유의적으로 증가하였으며, 발효녹용(FD)200 μg/mL, 발효가시오갈피(FE)200 μg/mL, 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)50 μg/mL 및 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)200 μg/mL에서는 유의적으로 증가하였다. 특히 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)군의 경우 농도 의존적으로 증가하는 경향이 나타났고, 정상대조군(NC)와 양성대조군(PC)에 가까운 수치를 나타내었다.
성숙한 T cell은 Th1 및 Th2 cytokines의 변화량과 관련이 있고, antigen 및 target cell을 죽이는데 관여를 하므로 cytokines들의 생성변화량에 영향을 미칠 것이고, B cell은 immunoglobulin의 생성량에 영향을 미칠 것으로 여겨진다.
실험예 2-7. Th1/Th2, IL-12 및 IL-15 cytokine 측정
Th1 cytokine : IL-2, IFN-γ; Th2 cytokine : IL-4, IL-6, IL-10, TNF-a
분리한 splenocytes를 96well plate에 5X105 cells/well 으로 분주하였고, IL-2, IFN-γ, IL-4, IL-10, IL-12, IL-15 용 plate에는 Con-A (5 μg/mL)를, IL-6, TNF-a용 plate에는 LPS (5 μg/mL)를 분주하였다. IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, TNF-a의 경우 24시간 배양하였고, IL-12, IL-15의 경우 48시간 배양하였으며, IFN-γ의 경우 72시간 배양하였다. 각 cytokines는 ELISA kit (R&D system)를 사용하여 측정하였고, 분석 하루 전, ELISA용 96well plate에 capture antibody 100 μL씩 분주하여 준비해두었다. 분석 날 각 96well plate를 원심분리하여 상층액을 수집하여 assay sample로 사용하였다. capture antibody가 포함된 96well plate를 3번 washing 하여 blocking buffer 300 μL씩 분주하여 실온에서 1시간 방치시켰고, washing 작업 후, standard와 sample을 100 μL씩 분주하여 plate sealer를 씌워 실온에서 2시간 방치시켰다. washing 작업 후, 각 well에 Detection antibody 100 μL씩 분주하여 plate sealer를 씌워 실온에서 2시간 방치시켰으며 washing 작업 후, streptavidin-HRP 100 μL 씩 분주하여 빛을 차단하고 실온에서 20분간 반응시켰다. washing 작업 후, 각 well에 substrate 100 μL씩 분주하였으며 60분간 반응시키면서 ELISA reader (Bio-Rad) 655nm에서 흡광도를 측정하였다.
Th1 cytokine 측정결과
성숙한 CD4(+) T cell에서 분비되어 나오는 Th1 cytokines (IL-2, IFN-γ)는 CD8(+) T cell을 활성화시켜 phagocytosis와 antigen death에 영향을 주는 것으로 알려져 있으며, 이를 측정한 결과는 도 17에 나타내었다.(10)
Th1 cytokines 젓 IL-2 생성량을 측정한 결과, 정상대조군(NC)대비 강제수영운동 대조군(C)에서 유의적으로 감소하였고, 양성대조군(PC)의 경우, 강제수영운동대조군(C) 대비 유의적으로 증가하였으며, 발효녹용(FD)200μg/mL, 발효가시오갈피(FE)200 μg/mL, 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)50군 및 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)200 μg/mL에서는 유의적으로 증가하였다. 특히 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)군의 경우 농도 의존적으로 증가하는 경향이 나타났고, 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)200 μg/mL에서 정상대조군(NC)에 가까운 수치를 나타내었다.
IFN-γ 생성량을 측정한 결과, 정상대조군(NC)대비 강제수영운동대조군(C)에서 유의적으로 감소하였고, 양성대조군(PC)의 경우, 강제수영운동대조군(C) 대비 유의적으로 증가하였으며, 발효녹용(FD)200 μg/mL, 발효가시오갈피(FE)200 μg/mL, 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)50군 및 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)200 μg/mL에서는 유의적으로 증가하였다. 특히 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)군의 경우 농도 의존적으로 증가하는 경향이 나타났고, 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)200 μg/mL에서 양성대조군(PC)에 가까운 수치를 나타내었다.
Th2 cytokine 측정결과
B cell을 활성화 시키는 Th2 cytokines (IL-4, IL-6, IL-10, TNF-a)를 측정한 결과는 도 18에 나타내었다.
IL-4의 생성량을 측정한 결과, 정상대조군(NC)대비 강제수영운동대조군(C)에서 유의적으로 증가하였고, 양성대조군(PC)의 경우, 강제수영운동대조군(C) 대비 유의적으로 감소하였으며, 발효녹용(FD)200 μg/mL, 발효가시오갈피(FE)200 μg/mL, 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)50 μg/mL 및 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)200 μg/mL에서는 유의적으로 감소하였다. 특히 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)군의 경우 농도 의존적으로 감소하는 경향이 나타났고, 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)200 μg/mL에서 정상대조군(NC)에 가까운 수치를 나타내었다.
IL-6의 생성량을 측정한 결과, 정상대조군(NC)대비 강제수영운동대조군(C)에서 유의적으로 증가하였고, 양성대조군(PC)의 경우, 강제수영운동대조군(C) 대비 유의적으로 감소하였으며, 발효녹용(FD)200μg/mL, 발효가시오갈피(FE)200μg/mL, 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)50군 및 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)200μg/mL에서는 유의적으로 감소하였다. 특히 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)군의 경우 농도 의존적으로 감소하는 경향이 나타났고, 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)200μg/mL에서 양성대조군(PC)에 가까운 수치를 나타내었다.
IL-10의 생성량을 측정한 결과, 정상대조군(NC)대비 강제수영운동대조군(C)에서 유의적으로 증가하였고, 양성대조군(PC)의 경우, 강제수영운동대조군(C) 대비 유의적으로 감소하였으며, 발효녹용(FD)200 μg/mL, 발효가시오갈피(FE)200 μg/mL, 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)50 μg/mL 및 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)200 μg/mL에서는 유의적으로 감소하였다. 특히 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)군의 경우 농도 의존적으로 감소하는 경향이 나타났고, 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)200 μg/mL에서 정상대조군(NC) 및 양성대조군(PC)에 가까운 수치를 나타내었다.
TNF-a의 생성량을 측정한 결과, 정상대조군(NC)대비 강제수영운동대조군(C)에서 유의적으로 증가하였고 양성대조군 , (PC)의 경우, 강제수영운동대조군(C) 대비 유의적으로 감소하였으며, 발효녹용(FD)200 μg/mL, 발효가시오갈피(FE)200μ g/mL, 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)50 μg/mL 및 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)200 μg/mL에서는 유의적으로 감소하였다. 특히 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)군의 경우 농도 의존적으로 감소하는 경향이 나타났고, 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)200 μg/mL에서 정상대조군(NC) 및 양성대조군(PC)에 가까운 수치를 나타내었다.
Th2 cytokines의 생성량 변화는 B cell의 활성화에 영향을 미치며 이는 immunoglobulin의 변화량에 영향을 미칠 것으로 예상된다.
IL-12 및 IL-15 cytokine 측정결과
Natural killer cell을 활성화시키는 cytokine인 IL-12와 IL-15의 생성 변화량을 측정한 결과는 도 19에 나타내었다.
IL-12 생성량을 측정한 결과, 정상대조군(NC)대비 강제수영운동대조군(C)에서 유의적으로 감소하였고, 양성대조군(PC)의 경우, 강제수영운동대조군(C) 대비 유의적으로 증가하였으며, 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)200 μg/mL에서 강제수영운동대조군(C) 대비 유의적으로 증가하였다.
IL-15 생성량을 측정한 결과, 정상대조군(NC)대비 강제수영운동대조군(C)에서 유의적으로 감소하였고, 양성대조군(PC)의 경우, 강제수영운동대조군(C) 대비 유의적으로 증가하였으며, 발효녹용(FD)200 μg/mL, 발효가시오갈피(FE)200 μg/mL, 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)50 μg/mL 및 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)200 μg/mL에서는 유의적으로 증가하였다. 특히 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)200μg/mL에서 가장 많은 생성량이 나타났다.
IL-12와 IL-의 생성량 변화는 natural killer cell의 활성화에 영향을 미치며, 이는target cell death로 이어질 것으로 예상된다.(11,12)
실험예 2-8. Yac-1에 대한 NK 세포 활성 측정
분리한 splenocyte를 96well plate에 각 well당 5X105 cells/well씩 분주한다. 표적세포는 Yac-1 cell로 1X104 cells/well씩 분주한다. Sample을 농도별로로 처리하여 37℃, 5% CO2에서 4시간동안 배양하였다. 배양 후 상층액 50ul을 새로운 plate에 분주하고 Cytotox 96 Non-radioactive Cytotoxicity assay kit (Promega Corporation, Madison, WI, USA)를 이용하여 ELISA reader (Bio-Rad)를 이용하여 450nm에서 흡광도를 측정하여 NK cell의 활성도를 측정하였다.
자연살해세포는 과거에 항원을 인식한 적이 없는 상태에서도 활성화되어 반응하기 때문에 선천면역에서 virus에 감염된 세포, 종양세포, 또는 비정상적인 세포를 인지하여 사멸시키는 역할을 하며 IL-2, IL-12, IL-15 등의 대식세포에서 분비되는 cytokines에 의해 자극되어 활성화되며 IFN-γ등의 분비를 증가시킨다.
또한 자연살해세포는 MHC class I 발현의 변화를 인식하여 감염되지 않는 정상 세포에 공격을 막음으로 감염된 세포와 결합하여 선택적으로 세포사멸을 유도시킨다. 자연살해세포가 제거할 수 있는 대상은 다양하게 알려져 있지만 자연살해세포의 활성능에 이용되고 있는 세포는 mouse의 경우 Moloney virus-induced lymphoma 세포주인 YAC-1 세포가 가장 널리 알려져있다. 따라서 본 연구에서는 YAC-1 세포를 target cell로 설정하고 자연살해세포를 effector cell로 설정하여 co-culture하여 천연소재들의 처리가 자연살해세포 활성에 미치는 영향을 관찰하였고 그 결과를 도 20에 나타내었다.
그 결과, 정상대조군(NC)대비 강제수영운동대조군(C)에서 유의적으로 감소하였고, 양성대조군(PC)의 경우, 강제수영운동대조군(C) 대비 유의적으로 증가하였으며, 발효녹용(FD)200 μg/mL, 발효가시오갈피(FE)200 μg/mL, 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)50 μg/mL 및 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)200 μg/mL에서는 유의적으로 증가하였다. 특히 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)200 μg/mL에서 가장 많은 활성이 나타났다.
실험예 2-9. 혈중 NO 생성능 측정
Nitric oxide 생성능을 측정하기 위하여 Ll venes 등의 방법을 참고하였고, Nitric Oxide Assay Kit (abcam, cambridge, MA, USA)를 사용하였다. Assay 용 96well plate에 standard와 분리 한 혈액 serum을 sample로 사용하여 85 μL 씩 분주하였고, Nitrate reductase와 Enzyme cofactor을 5 μL씩 분주하였으며, plate sealer를 씌워 실온에서 1시간 방치하였다. 각 well에 Enhancer 5 μL씩 분주하여 실온에 10분 더 반응시킨 후, Griess Reagent R1과 R2를 각각 50 μL 씩 분주하여 반응시키며 ELISA reader (Bio-Rad) 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
탐식작용을 하는 동안 대식세포에서는 탐식된 병원균을 죽이기 위하여 다양한 독성 물질들을 생산, 중요한 독성물질 젓 하나가 NO이며, 선천 면역과 적응 면역 간 경계에서 중요한 역할을 하여 세균, 바이러스, 미생물 등의 병원균을 사명시키는 매개체로 작용한다. 본 실험에서의 결과는 도 21에 나타내었다.
혈중 NO의 생성량을 측정한 결과, 정상대조군(NC)대비 강제수영운동대조군(C)에서 유의적으로 증가하였고, 양성대조군(PC)의 경우, 강제수영운동대조군(C) 대비 유의적으로 감소하였으며, 발효녹용(FD)200 μg/mL, 발효가시오갈피(FE)200 μg/mL, 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)50 μg/mL 및 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)200 μg/mL에서는 유의적으로 감소하였다 특히 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)200μg/mL에서 양성대조군(PC)에 가까운 수치를 나타내었다.
실험예 2-10. 혈중 면역 글로불린 측정
분리한 혈청으로 Immunoglobulin E (IgE), Immunoglobulin A (IgA), Immunoglobulin G (IgG) mouse ELISA kit (Abcam, Massachusetts, UK)를 이용하
여 ELISA reader (Bio-Rad Laboratories Headquarters, Hercules, CA, USA)로 570 nm에서 흡광도를 측정하였다.
B cell의 활성화로 생성되는 immunoglobulin에는 IgG, IgA, IgE 등이 있으며, 본 실험에서 측정한 결과는 도 22에 나타내었다.
IgE의 생성량을 측정한 결과, 정상대조군(NC)대비 강제수영운동대조군(C)에서 유의적으로 증가하였고, 양성대조군(PC)의 경우, 강제수영운동대조군(C) 대비 유의적으로 감소하였으며 , 발효녹용(FD)200 μg/mL, 발효가시오갈피(FE)200 μg/mL, 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)50 μg/mL 및 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)200 μg/mL에서는 유의적으로 감소하였다.
IgA의 생성량을 측정한 결과, 정상대조군(NC)대비 강제수영운동대조군(C)에서 유의적으로 증가하였고, 양성대조군(PC)의 경우, 강제수영운동대조군(C) 대비 유의적으로 감소하였으며, 발효녹용(FD)200 μg/mL, 발효가시오갈피(FE)200 μg/mL, 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)50 μg/mL 및 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)200 μg/mL에서는 유의적으로 감소하였다.
IgG의 생성량을 측정한 결과, 정상대조군(NC)대비 강제수영운동대조군(C)에서 유의적으로 증가하였고, 양성대조군(PC)의 경우, 강제수영운동대조군(C) 대비 유의적으로 감소하였으며, 발효녹용(FD)200 μg/mL, 발효가시오갈피(FE)200 μg/mL, 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)50 μg/mL 및 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)200 μg/mL에서는 유의적으로 감소하였다. 특히, 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)200μg/mL에서 양성대조군(PC)과 유사한 수준의 결과가 나타났다.
실험예
2-11. 혈중 Leukocytes 측정
10% EDTA solution이 첨가된 syringe를 사용해 수집한 전혈을 10% EDTA이 첨가된 tube에 모아 250 μL를 500 μL의 DPBS tube에 분주하여 혼합하였고, 500μL의 Histopaque 시약이 분주되어있는 tube에 분주를 하였다. 이때 histopaque 시약의 표면위에 조심히 띄워 올려야 하며 원심분리 (556 ⅹg, 20min) 후, 중간층인 leukocytes만을 분리하였고, 1 mL의 DPBS와 혼합하여 다시 원심분리(16000rpm, 20min, 4 ℃)하였다. 상층액을 제거 후 PBS 50 μL 분주하여 잘 혼합하여준 후, trypan blue 시약을 사용하여 세포 수를 측정하였다.
Leukocyte는 생체 내 침입한 세균이나 이물질을 잡아먹는 식균작용을 하는 세포로 세균에 감염되면 그 수가 늘어나는 것으로 알려져 있으나 면역저하모델에서는 감소할것으로 예상된다. 그 결과는 도 23에 나타내었다.
Leukocyte의 수를 측정한 결과, 정상대조군(NC)대비 강제수영운동대조군(C)에서 유의적으로 감소하였고, 양성대조군(PC)의 경우, 강제수영운동대조군(C) 대비 유의적으로 증가하였으며 , 발효녹용(FD)200 μg/mL, 발효가시오갈피(FE)200 μg/mL, 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)50 μg/mL 및 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)200 μg/mL에서는 유의적으로 증가하였다. 특히, 발효녹용+발효가시오갈피(FDE)200 μg/mL에서 정상대조군(PC)과 유사한 수준의 결과가 나타났다.
통계처리
본 연구는 SPSS (Statistical Package for the Social Science) version 22 프로그램을 이용하여 분석하였으며, 모든 측정 결과는 평균(mean)±표준편차(standard deviation, SD)로 표시하였다. 그룹간의 통계적 유의성을 Duncan? multiple range test를 실시하였으며 p<0.05 수준에서 유의성의 여부를 검증하였다.
상기 실험들을 통하여 녹용(D), 가시오갈피(E), 발효녹용(FD), 발효가시오갈피(FE) 및 혼합물(FDE)의 면역증진 유효성 평가를 위해 in vitro 및 in vivo 시험을 진행하였다. 녹용과 가시오갈피 추출물의 in vitro screening 연구에서는 발효에 의한 면역증강 활성능 변화를 확인하고자 하였다. 그 결과, 녹용보다는 가시오갈피 추출물에서, 비 발효 추출물들 보다는 발효 추출물에서, 그리고, 혼합물들에서는 가시오갈피의 함량이 높은 3:7 비율의 시료군에서 phagocytosis 활성능이 가장 높게 나타났고, pro-inflammatory cytokinese들과 NO의 생성 억제능이 뛰어났으며, Yac-1 cell에 대한 NK cell 활성능에서도 가장 뛰어난 효과를 나타내었다. 또한, LP-BM5 virus 면역결핍바이러스를 이용한 바이러스 host 내에서의 복제 억제 시험 및 host 침투억제 시험에서도 발효녹용+발효가시오갈피 3:7 비율의 샘플군에서 각각 LP-BM5 mRNA와 DNA의 발현을 유의적으로 감소시켰다. 따라서, in vivo 연구에서는 발효녹용+발효가시오갈피 3:7 비율의 시료를 소재로 결정하여 진행하였다.
강제수영운동(한계수영)으로 면역저하가 유도된 동물모델에서 면역증진 유효성 평가 (in vivo) 연구결과, 발효녹용+발효가시오갈피 3:7 혼합시료는 면역저하로 감소된 MHC class Ⅰ 및 MHC class Ⅱ의 발현뿐만 아니라 CD4(+) 및 CD8(+) T cell의 성숙을 유의적으로 증가시켰다. 이러한 결과는 면역저하로 감소하였던 Th1 cytokines (IL-2, IFN-γ, IL-12, IL-15)의 생성량을 증가시켜 T cell을 activation시켰으며 NK cell 의 활성화를 통해 antigen death를 유도하였음을 짐작할 수 있다. 또한 면역저하로 증가하였던 Th2 cytokines (IL-4, IL-6, IL-10, TNF-a)의 생성량을 감소시켰고, B cell 증식능에 영향을 미쳐 immunoglobulin (IgG, IgA, IgE)의 생성을 대조군대비 감소시켰다. 따라서, in vitro screening 연구에서 면역증진 활성에 대한 유효성이 확인된 발효녹용과 발효가시오갈피 3:7 혼합물 (FDE 3:7)은 강제수영운동(한계수영)으로 면역저하가 유도된 동물모델에서도 Th1 및 Th2 cytokines들의 균형을 조절하여 항원을 처리하고, memory B cell의 성숙과 분화에 관여하여 항체생성에도 관여할 것으로 기대되며, 면역증진 및 면역계를 조절하는 기능이 있는 것으로 예상되어 기능성 식품소재로서의 개발 가능성을 충분히 확인하였다.
Claims (19)
- 녹용 및 가시오갈피의 열수 추출물을 락토바실러스 플랜타룸 GSRB-K8 (Lactobacillus plantarum GSRB-K8)균주로 발효하는 발효 추출물을 포함하면서, 상기 발효 추출물이 녹용 및 가시오갈피가 건조 중량으로 각각 3:7으로 혼합되는 것인 면역 증강용 조성물.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 발효는 20 내지 60 ℃의 온도 조건 하에서 12 내지 48시간 동안 이루어지는 것인 조성물.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 상기 비율로 혼합된 발효 추출물이 150 내지 250 ㎍/ml의 농도인 것인 조성물.
- a) 녹용 및 가시오갈피의 추출물을 각각 열수 추출방법으로 제조하는 단계;
b) 상기 a)단계에서 제조된 추출물을 각각 락토바실러스 플랜타룸 GSRB-K8 (Lactobacillus plantarum GSRB-K8)균주로 발효시키는 단계;
c) 상기 제조된 발효 추출물을 여과하고 농축하는 단계; 및
d) 상기 c) 단계에서 제조된 녹용 및 가시오갈피의 발효 추출물이 건조 중량으로 각각 3:7으로 혼합하는 단계;를 포함하는 면역 증강용 조성물의 제조방법. - 삭제
- 제8항에 있어서, 상기 추출은 80 내지 95℃에서 3시간 동안 가열하여 추출하는 열수 추출한 것인 제조방법.
- 제8항에 있어서, 상기 b)단계의 발효는 20 내지 60 ℃의 온도 조건 하에서 12 내지 48시간 동안 이루어지는 것인 제조방법.
- 삭제
- 제8항에 있어서, 상기 c)단계이후에 각 농축된 발효 추출물을 건조시키는 단계를 추가로 포함하는 것인 제조방법.
- 삭제
- 제8항에 있어서, 상기 혼합된 녹용 및 가시오갈피의 발효 추출물이 150 내지 250 ㎍/ml의 농도인 것인 제조방법.
- 녹용 및 가시오갈피의 열수 추출물을 락토바실러스 플랜타룸 GSRB-K8 (Lactobacillus plantarum GSRB-K8)균주로 발효하는 발효 추출물을 유효성분으로 함유하면서, 상기 발효 추출물이 녹용 및 가시오갈피가 건조 중량으로 각각 3:7으로 혼합되는 것인 면역 증강용 식품 조성물.
- 삭제
- 제16항에 있어서, 상기 비율로 혼합된 발효 추출물이 150 내지 250 ㎍/ml의 농도로 함유되는 것인 조성물.
- 제 16항에 있어서, 상기 식품 조성물은 향미제, 풍미제, 착색제, 충진제, 안정화제, 천연 탄수화물, 영양제, 비타민제, 증점제, pH 조절제, 방부제 및 이들의 혼합물로 이루어지는 군으로부터 선택되는 첨가제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| KR1020200070843A KR102176839B1 (ko) | 2020-06-11 | 2020-06-11 | 녹용 및 가시오갈피의 추출물을 포함하는 면역 증강용 조성물 및 그 제조방법 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020200070843A KR102176839B1 (ko) | 2020-06-11 | 2020-06-11 | 녹용 및 가시오갈피의 추출물을 포함하는 면역 증강용 조성물 및 그 제조방법 |
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| KR102176839B1 true KR102176839B1 (ko) | 2020-11-10 |
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20170104051A (ko) * | 2016-03-03 | 2017-09-14 | 주식회사 한국인삼공사 | 발효 녹용 추출물 또는 그의 분획물을 함유하는 면역 강화용 조성물 |
| KR20200040986A (ko) * | 2018-10-11 | 2020-04-21 | 몸엔용바이오 농업회사법인 주식회사 | 녹용 및 가시오가피로 구성된 복합생약 추출물을 함유한 면역증강용 조성물 |
-
2020
- 2020-06-11 KR KR1020200070843A patent/KR102176839B1/ko active IP Right Grant
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| KR20200040986A (ko) * | 2018-10-11 | 2020-04-21 | 몸엔용바이오 농업회사법인 주식회사 | 녹용 및 가시오가피로 구성된 복합생약 추출물을 함유한 면역증강용 조성물 |
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