KR102383063B1 - 황칠나무와 미나리를 이용한 천연발효식초, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 간 및 신장 기능 보호, 개선 건강식품 - Google Patents

황칠나무와 미나리를 이용한 천연발효식초, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 간 및 신장 기능 보호, 개선 건강식품 Download PDF

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Abstract

본 발명은 천연 식물인 황칠나무 및 미나리를 이용하여 제조한 천연발효식초, 이를 제조하는 방법 및 상기 천연발효식초를 이용한 간 및 신장 기능 보호, 예방 내지 개선 효과가 우수한 건강식품에 관한 것이다.

Description

황칠나무와 미나리를 이용한 천연발효식초, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 간 및 신장 기능 보호, 개선 건강식품{Natural fermentation vinegar using dendropanax morbiferus and dropwort, Manufacturing method thereof, and functional health food for protecting and improving a liver and kidney}
본 발명은 천연 식물을 이용하여 제조한 천연발효식초, 이를 제조하는 방법 및 상기 천연발효식초를 이용한 간 및 신장 기능 보호와 개선 효과가 우수한 건강기능식품에 관한 것이다.
간(liver)은 인체에 있어서 가장 큰 장기 중 하나로서 생활하는데 필수조직이며, 다른 조직의 기능들을 전체적인 맥락에서 조화롭게 관리한다. 그리고 동원 가능한 에너지의 근원을 쉽게 저장, 제공하므로 영양소의 대사기능, 해독기능, 순환 조절 기능에 관여하고 있으며, 간의 화학적 잠재력과 빠른 재생력 등의 이유로 '화학 공장', '저장고', '침묵의 장기'라고도 한다.
간은 지방 성분이 포함된 음식이나 알코올의 과다 섭취, 바이러스의 감염, 각종 약품과 같은 유해물질, 영양 부족 등과 같은 다양한 원인에 의해 급성 또는 만성의 장애가 일어날 수 있다. 또한, 간은 우리 몸이 독성 물질에 노출되었을 때 독을 제거하는 중추적인 역할을 하는 기관으로 독성 물질에 의해 손상될 가능성이 높다. 간의 손상은 독성 물질을 제거하는 해독 기능에 장애를 나타내고, 면역체계에 이상을 가져와 지방간, 간염, 황달, 간경화, 간암 등을 야기 시킬 수 있다.
최근에는 비만인에서 비알코올성 지방간의 발생이 증가하는데, 이것은 식생활과 생활습관의 서구화로 인한 비만 인구의 증가와 밀접한 관련이 있다. 또한 알코올 섭취의 지속적인 증가, 비만 및 스트레스 등을 감안하면 지방간을 비롯한 간 질환의 발병이 급증할 것으로 사료된다. 간 질환의 치료 방법은 식이 요법과 약물 요법이 있으며 약물 요법으로 사용하는 것으로, 우루소데옥시콜린산(ursodeoxycholic acid), 실리마린(silymarin), 비페닐 디메틸 디카복시레이트(biphenyl dimethyl dicarboxylate, DDB), 글루타치온(glutathione), 글리시리진(glycyrrhizin) 등과 같은 간 세포 재생촉진제 및 간 기능 보조제, 아시클로바(acyclovir)와 같은 항바이러스 등의 약물이 사용되고 있다.
신장(kidney, 콩팥)은 아래쪽 배의 등 쪽에 쌍으로 위치하는 장기로, 대사산물 및 노폐물을 걸러서 소변으로 배출하는 배설 기능, 체내 수분량과 전해질, 산성도 등을 좁은 범위 안에서 일정하게 유지하는 생체 항상성 유지, 혈압 유지, 빈혈 교정 및 칼슘과 인 대사에 중요한 여러 가지 호르몬을 생산하고 활성화시키는 내분비 기능을 담당하고 있다. 이러한 신장의 기능이 심하게 저하되거나 소실되면 생명을 유지하기 어렵다.
생약 성분 등을 이용한 다양한 간 및/또는 신장에 대한 기능 개선/보호 천연 소재에 대한 연구, 개발이 진행되고 있는데, 기존의 천연 소재를 이용한 간/신장 기능 개선/보호용 소재는 추출물 또는 분획물 형태로 제조하기 때문에 제조공정이 복잡하여 경제성이 떨어지고, 가공 형태도 한정적인 문제가 있었다.
대한민국 공개특허번호 10-2021-0015272호(2021.02.10) 대한민국 공개특허번호 10-2002-0025146호(2002.04.03)
본 발명자들은 천연 식물을 이용한 새로운 응용제품을 다양하게 연구한 결과, 황칠나무와 미나리를 특정 방법으로 가공하여 식초를 제조하면 간 및 신장을 보호하고 개선시킬 수 있는 성분이 다량 포함할 수 있음을 알게 되어 본 발명을 완성하게 되었다. 즉, 본 발명은 천연발효식초, 이를 제조하는 방법 및 이를 이용한 간 및 신장 기능 보호와 개선 효과가 있는 건강식품을 제공하고자 한다.
상기의 목적을 달성하기 위한, 본 발명은 황칠나무와 미나리를 이용한 천연발효식초에 관한 것으로서, 클로로젠산(chlorogenic acid) 170.00 ~ 250.00 ㎍/㎖ 및 캠퍼롤(kaempferol) 15.00 ~ 20.00 ㎍/㎖을 함유한다.
또한, 본 발명은 상기 천연발효식초를 제조하는 방법에 관한 것으로서, 건조된 황칠나무 및 건조된 미나리를 포함하는 혼합물을 파쇄한 파쇄물, 사과 농축액 및 정제수를 혼합하여 혼합액을 제조하는 1단계; 상기 혼합액에 효모를 접종한 후, 1차 발효시켜서 알코올 농도 5.0 ~ 6.5 부피%로 포함하는 발효물을 제조하는 2단계; 및 상기 발효물에 초산 균주를 접종한 다음, 2차 발효시켜서 산도 4.5 ~ 5.5인 발효식초를 제조하는 3단계;를 포함하는 공정을 수행하여 천연발효식초를 제조할 수 있다.
또한, 본 발명은 간 및 신장 기능 보호, 개선용 건강식품에 관한 것으로서, 상기 황칠나무와 미나리를 이용한 천연발효식초를 유효성분으로 포함한다.
본 발명의 천연발효식초는 천연식물을 추출물로 제조한 후, 이를 가공하는 복잡다단한 공정을 수행하지 않는 바, 경제성이 우수하며, 다량의 클로로젠산 및 캠퍼롤을 함유하여 간 및 신장 보호와 개선 효과가 우수하다. 또한, 본 발명의 천연발효식초는 물에 섞어서 음료수처럼 음용할 수 있으며, 제조한 천연발효식초를 추가적으로 가공하여 분말화, 파우치화, 또는 농축시켜서 분말 타입 또는 농축액 타입의 건강식품을 제공할 수도 있다.
도 1은 실시예 1 ~ 4에서 제조한 천연발효식초를 찍은 사진이다.
도 2a는 실험예 1에서 실시한 실시예 1 ~ 4의 천연발효식초에 대한 간세포 독성 측정 결과이다.
도 2b는 실험예 1에서 실시한 실시예 1 ~ 4의 천연발효식초에 대한 손상된 간세포 보호 평가 측정 결과이다.
도 3은 실시예 5, 비교예 1 ~ 2에서 제조한 천연발효식초, 추출물 및 알코올 발효물의 사진이다.
도 4a는 실험예 2에서 실시한 간세포 독성 평가 결과이고, 도 4b는 간세포 보호 평가 결과이다.
도 5a 및 도 5b는 실험예 3에서 실시한 산화적 손상 유도된 간 조직 내 CYP2E1, CYP2A4, PPARγ 단백질 발현 확인을 위한 웨스턴 블롯 측정 결과이다.
도 6a 및 도 6b는 실험예 3에서 실시한 산화적 손상 유도된 간 조직 내 CYP2E1, CYP2A4, PPARγ 의 mRNA 발현 확인을 위한 웨스턴 블롯 측정 결과이다.
도 7a 및 도 7b는 실험예 4에서 실시한 산화적 손상을 유도한 신장 조직 내 Caspase-3, Bcl-2, Bax 단백질 발현 확인을 위해 웨스턴 블롯 측정 결과이다.
도 8a 및 도 8b는 실험예 5에서 실시한 현미경 측정 사진이다.
이하 본 발명의 천연발효식초를 제조하는 방법을 통해 상세히 설명한다.
본 발명의 천연발효식초는 건조된 황칠나무 및 건조된 미나리를 포함하는 혼합물을 파쇄한 파쇄물, 사과 농축액 및 정제수를 혼합하여 혼합액을 제조하는 1단계; 상기 혼합액에 효모를 접종한 후, 1차 발효시켜서 알코올 함유 발효물을 제조하는 2단계; 및 상기 발효물에 초산 균주를 접종한 다음, 2차 발효시켜서 발효식초를 제조하는 3단계;를 포함하는 공정을 수행하여 제조할 수 있다.
1단계의 황칠나무는 두릅나무과에 속하는 상록교모로서, 예로부터 혈액순환에 좋다고 알려졌으며, 특히 숙취해소 등 간질환에 유효하여 애용되었으며, 열전도가 뛰어나 물질을 보존하는데도 매우 유용하게 사용되었으나 성질이 따뜻하고 열성의 기세가 급한 특징이 있다. 본 발명에서 1단계의 황칠나무는 황칠나무의 줄기 및/또는 잎을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 황칠나무 잎을 사용할 수 있다.
1단계의 미나리는 크게 물미나리와 돌미나리의 두 종류로 구분이 된다. 물미나리는 논에서 재배되어 논미나리라고도 하는데, 줄기가 길고 잎이 연하여 상품성이 높다. 이에 비해 돌미나리는 습지 또는 물가에 야생하는 것으로 줄기가 짧고 잎사귀가 많으며 물미나리보다 향이 강하다. 돌미나리는 체내 해독효능과, 각종 물기질의 신진대사 촉진, 이뇨 해열작용과 혈액정화 효능이 있고, 한방에서는 간의 독을 풀어주는 약재로 사용하고 있다. 또한, 미나리는 비타민과 무기질이 풍부하게 함유된 알칼리성 식품으로 고지방 식단으로 인해 산성으로 변한 체질을 중화하는 데 효과가 있다고 알려져 있으며,　또한 칼륨이 많이 함유되어 있어 체내의 중금속과 나트륨 등의 해로운 성분을 배출하는 데 도움을 준다.　미나리의 정유 성분인 이소람네틴과 페르시카린은 염증을 억제하고 알코올을 분해하여 숙취 해소에 효능이 있다.　또한, 한방에서도 미나리는 머리를 맑게 해주고,　장을 잘 통하게 하고 황달,　부인병 등에 효과가 좋다고 알려져 있다.　반면 미나리는 강한 향으로 위를 자극하기 때문에 소화성 궤양 환자에게는 오히려 해로울 수 있으니 주의해야 하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 1단계의 상기 미나리는 물미나리 및/또는 돌미나리를 단독 또는 혼합해서 사용할 수 있으며, 바람직하게는 돌미나리를 사용하는 것이 좋다.
1단계의 혼합물은 앞서 설명한 황칠나무와 미나리의 건조물을 혼합한 것으로서, 건조된 황칠나무 및 건조된 미나리를 1 : 0.35 ~ 1.00 중량비로, 바람직하게는 1 : 0.35 ~ 0.60 중량비로, 더욱 바람직하게는 1 : 0.40 ~ 0.45 중량비로 포함하는 것이 좋다. 이때, 미나리 혼합비가 0.35 중량비 미만이면 미나리에 의한 향미가 떨어지는 문제가 있을 수 있고, 미나리 혼합비가 1.00 중량비를 초과하면 상대적으로 황칠나무 함량이 적어서 간·신장 기능 보호 개선 효과가 떨어질 수 있으므로 상기 범위 내로 혼합하여 사용하는 것이 좋다.
상기 혼합물을 당업계에서 사용하는 일반적인 파쇄 방법을 사용하여 혼합물을 파쇄시켜서 파쇄물을 수득한다.
그리고, 정제수에 상기 파쇄물 및 사과 농축액을 투입 및 혼합하여 혼합액을 제조한다.
상기 혼합액은 상기 파쇄물 18.0 ~ 23.5 중량%, 사과 농축액 15.0 ~ 19.0 중량% 및 잔량의 정제수를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 상기 파쇄물 18.5 ~ 22.5 중량%, 사과 농축액 16.0 ~ 18.5 중량% 및 잔량의 정제수를 포함할 수 있고, 더욱 바람직하게는 상기 파쇄물 19.0 ~ 22.0 중량%, 사과 농축액 16.5 ~ 18.0 중량% 및 잔량의 정제수를 포함할 수 있다.
이때, 혼합액 내 파쇄물 함량이 18.0 중량% 미만이면 제조된 천연발효식초 내 간/신장 기능 보호, 개선 유효성분 함량이 너무 적을 수가 있고, 혼합액 내 파쇄물 함량이 23.5 중량%를 초과하더라도 천연발효식초 내 간/신장 기능 보호, 개선 유효성분 함량 증가가 미비하며, 발효가 잘 되지 않을 수 있으므로 상기 범위 내로 포함하는 것이 좋다. 그리고, 혼합액 내 상기 사과 농축액 함량이 15.0 중량% 미만이거나, 19.0 중량%를 초과하면 2단계의 발효가 잘 되지 않거나, 발효 시간이 너무 길어지거나, 또는 발효물 내 알코올 함량 조절이 어려워지는 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내로 사용하는 것이 좋다.
다음으로, 2단계는 1단계의 혼합액을 발효시켜서 알코올 함유 발효물을 제조하는 공정으로서, 상기 혼합액에 효모를 접종한 후, 1차 발효시켜서 알코올 농도 5 ~ 6 부피%로 포함하는 발효물을 제조한다.
상기 효모는 맥주효모균을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 수탁번호 KCTC 12702BP의 맥주효모군을 사용할 수 있다. 그리고, 효모의 접종량은 상기 혼합액 기준으로 5 ~ 15 중량%, 바람직하게는 8 ~ 12 중량로 접종하는 것이 적절하며, 이때, 효모 접종량이 5 중량% 미만이면 1차 발효가 잘 진행되지 않을 수 있고, 접종량이 15 중량%를 초과하면 과발효가 진행되어 알코올함량이 과생성 되어 초산발효가 잘 진행되지 않는 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내로 효모를 혼합액에 접종하는 것이 좋다.
그리고, 2단계의 1차 발효는 효모 접종 후, 25 ~ 35℃에서 48 ~ 72 시간 동안, 바람직하게는 28 ~ 32℃에서 48 ~ 72 시간 동안 수행하며, 발효물 내 알코올 농도가 5.0 ~ 6.5 부피%를, 바람직하게는 5.0 ~ 6.0 부피%를 만족할 때까지 수행하는 것이 좋다. 이때, 1차 발효 온도가 25℃ 미만이거나, 35℃를 초과하면 발효가 진행되지 않을 수 있거나, 오히려 발효 속도가 너무 느릴 수 있으므로 상기 발효 온도 하에서 수행하는 것이 좋다. 그리고, 발효물 내 알코올 농도가 5 부피% 미만이면 2차 발효가 잘 진행되지 않을 수 있고, 알코올 농도가 6부피%를 초과하면 초산발효가 잘 진행되지 않는 문제가 발생할 수 있으므로, 발효물 내 상기 범위의 알코올 농도가 되도록 1차 발효를 수행하는 것이 좋다.
다음으로, 3단계는 1차 발효를 수행하여 수득한 발효물을 초산균주를 접종 및 2차 발효시켜 발효식초를 수득하는 공정이다.
상기 초산 균주는 인터메디우스형 글루코노박터 인터메디우스(Gluconobacter intermedius)를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 수탁번호 KCTC 12701BP의 인터메디우스형 글루코노박터를 사용할 수 있다. 그리고, 초산균주의 접종량은 상기 발효물 기준으로 5 ~ 15 중량%, 바람직하게는 8 ~ 12 중량% 로 접종하는 것이 적절하며, 이때, 초산균주 접종량이 5 중량% 미만이면 2차 발효가 잘 진행되지 않을 수 있고, 접종량이 15 중량%를 초과하면 경제성이 낮아지는 문제가 있을 수 있으므로 상기 범위 내로 초산균주를 1차 발효물에 접종하는 것이 좋다.
그리고, 3단계의 2차 발효는 초산균주 접종 후, 25 ~ 35℃에서 72 ~ 96 시간 동안, 바람직하게는 28 ~ 32℃에서 72 ~ 96 시간 동안 수행하며, 2차 발효물의 산도가 4.5 ~ 5.5, 바람직하게는 산도가 4.8 ~ 5.2를, 더욱 바람직하게는 4.9 ~ 5.1를 만족할 때까지 수행하는 것이 좋다. 이때, 2차 발효 온도가 25℃ 미만이면 발효가 잘 진행되지 않을 수 있고, 35℃를 초과하면 발효물의 산도가 너무 급격하게 낮아지거나, 발효 식초 내 클로로겐산 및/또는 컴퍼롤 함량이 크게 낮아지는 문제가 있을 수 있으므로 상기 발효 온도 하에서 수행하는 것이 좋다. 그리고, 2차 발효된 발효식초 내 산도가 4.5 미만이면 충분한 유기산이 발생하지 않아 발효가 잘 진행되지 않는 문제가 있을 수 있고, 발효식초 내 산도가 5.5를 초과하면 과발효가 진행되어 경제성이 낮아지는 문제가 발생할 수 있으므로, 발효식초가 상기 범위의 산도를 갖도록 2차 발효를 수행하는 것이 좋다.
본 발명의 천연발효식초 제조방법법은 상기 1 ~ 3단계 공정을 수행하여 제조한 발효식초를 필터링하여 불순물을 제거하는 정제 공정을 더 수행할 수도 있다.
1 ~ 3단계 또는 1 ~ 4단계 공정을 수행하여 제조한 천연발효식초를 음식 등에 그대로 사용하거나, 또는 물 등의 식용 가능한 용액과 혼합한 후 섭취할 수도 있다.
또한, 3단계 또는 4단계 공정을 수행한 발효식초를 건조 및 분말화시키는 5단계; 또는 3단계 또는 4단계 공정을 수행한 발효식초를 농축시켜 농축물을 제조하는 5단계;를 더 수행하여, 분말타입 또는 농축액 타입 제품을 제조할 수도 있다.
앞서 설명한 방법으로 제조한 본 발명의 천연발효식초는 클로로젠산(chlorogenic acid) 170.00 ㎍/㎖ 이상 및 캠퍼롤(kaempferol) 15.00 ㎍/㎖ 이상으로 함유할 수 있으며, 바람직하게는 클로로젠산 170.00 ~ 250.00 ㎍/㎖ 및 캠퍼롤 15.00 ~ 20.00 ㎍/㎖을 함유할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 클로로젠산 185.00 ~ 240.00 ㎍/㎖ 및 캠퍼롤 17.00 ~ 20.00 ㎍/㎖으로 포함할 수 있다.
이러한, 본 발명의 천연발효식초는 간세포 및/또는 신장세포에 대한 독성이 없으면서 손상된 간의 ALT(Alanine transaminase), AST(Aspartate transaminase) 및/또는 MDA(Malondialdehyde)를 감소시키고, 활성산소 제거하며, 손상된 간의 글루타치온(glutathione) 증가 및 SOD 활성 증가 효과가 있는 바, 간 보호, 개선 효과가 우수하다. 또한, 손상된 신장에서 증가된 BUN(blood urea nitrogen) 및 Cre(creatinine) 수치를 크게 감소시킬 수 있는 바, 신장 보호, 개선 효과가 우수하다.
이러한 본 발명의 천연발효식초는 액상, 분말, 파우치 또는 농축액 등 다양한 형태로 응용하여 간 및 신장 기능 보호, 개선용 건강식품으로 제조할 수 있을 뿐만 아니라, 약학적 조성물로도 가공이 가능하다.
파우치의 바람직한 일례를 들면, 천연발효식초를 3.5 ~ 5.0 중량%, 프락토올리고당 10 ~ 20 중량%, 레드자몽농축액 3.50 ~ 7.00 중량%, 폴리덱스트로스 1.5 ~ 5.0 중량%, 사과농축액 1 ~ 4 중량% 및 잔량의 정제수를 포함할 수 있다.
상기 농축액의 바람직한 일례를 들면, 본 발명의 천연발효식초 농축액은 천연발효식초 20 ~ 30중량%, 프락토올리고당 30 ~ 40 중량%, 사과농축액 5 ~ 10 중량%, 레드자몽 농축액 0.5 ~ 2 중량%, 구연산 0.1 ~ 2.0 중량%, 스테비올 배당체 0.001 ~ 0.050 중량% 및 잔량의 정제수를 포함할 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
[실시예]
실시예 1 ~ 4 : 천연발효식초의 제조
(1) 파쇄물 및 혼합액 제조
건조된 황칠나무 잎 및 건조된 돌미나리를 각각 준비한 후, 이들을 하기 표 1과 같은 중량비로 혼합하여 혼합물을 각각 제조하였다. 다음으로, 이들을 파쇄하여 파쇄물을 제조하였다.
다음으로, 상기 파쇄물, 사과농축액 및 정제수를 하기 표 1과 같은 함량으로 혼합하여 혼합액을 각각 제조하였다.
(2) 1차 발효물 제조
상기 혼합액에 효모 균주(Saccharomyces cerevisiae, KCTC 12702BP)를 약 10 중량%를 접종한 후, 30℃의 온도에서 약 58 ~ 64시간 정도 발효하여 발효물 내 알코올 농도가 5~6부피%로 함유한 1차 발효물을 각각 제조하였다.
(3) 2차 발효물(발효식초) 제조
1차 발효물에 초산균주(Gluconobacter intermedius KSH-B1414031, KCTC 12701BP)를 약 10 중량%로 접종한 후, 30℃의 온도에서 약 80 ~ 86시간 동안 2차 발효를 수행하여 산도가 약 5인 천연발효식초를 각각 제조하였다. 그리고, 제조한 천연발효식초 사진을 도 1에 나타내었다.
혼합액
(중량%)		 정제수 사과
농축액		 파쇄물 천연발효식초
수율 (%)
함량 황칠: 미나리 (중량비)
실시예 1 72.86 17.14 10 1 : 1 3.38
실시예 2 62.86 17.14 20 1 : 1 3.52
실시예 3 52.86 17.14 30 1 : 1 3.67
실시예 4 72.86 17.14 10 1 : 0.43 4.17
실험예 1 : 간세포 독성 및 손상된 간세포 보호 평가 실험 1
(1) 세포배양
HepG2 세포(hepatoma cell, human)을 한국세포주은행(Seoul, Korea) 또는 ATCC(America Type Culture Collection, USA)에서 구입하여 사용하였다. HepG2 cell은 37℃, 5% CO2 조건에서 10% FBS, 페니실린(penicillin, 100 μg/mL), 스트렙토마이신(streptomycin, 100 μg/mL)이 첨가된 배지로 배양하였다.
(2) 간세포 독성 확인 평가
샘플이 HepG2 세포의 증식에 미치는 효과를 알아보기 위해 MTT assay를 수행하였다. 96-well cell culture plate에 5×104 cells/mL로 접종(seeding)한 후, 24시간 동안 CO2 배양기(incubator)에서 배양하였다.
다음으로, 24시간 후, 실시예 1 ~ 4에서 제조한 발효식초를 각각의 농도를 달리하여(0.5mg/ml, 1mg/ml, 5mg/ml, 10mg/ml) 접종 및 측정한 간세포 독성 측정 결과를 도 2a에 나타내었다.
도 2a 의 Control은 음성대조군으로서 천연발효식초를 접종하지 않은 것이고, Sily.는 양성대조군으로서, 실시예의 천연발효식초 대신 실리마린(Silymarin)을 접종한 것이다.
(3) 손상된 간세포 보호 평가
샘플이 HepG2 세포의 증식에 미치는 효과를 알아보기 위해 MTT assay를 수행하였다. 96-well cell culture plate에 5×104 cells/mL로 접종(seeding)한 후, 24시간 동안 CO2 배양기(incubator)에서 배양하였다.
다음으로, 24시간 후, 실시예 1 ~ 4에서 제조한 발효식초를 각각의 농도를 달리하여(0.5mg/ml, 1mg/ml, 5mg/ml, 10mg/ml) 1시간 전 처리하고, D-갈락토사민(D-galactosamine, 50 mM)을 추가 처리하여 산화적 손상을 유도하였다.
다음으로, 24시간 배양 후, 5 mg/mL의 MTT reagent 20 μl를 처리하고 4시간 반응 후, ELISA reader 기기 (550 nm)로 측정하였으며, 측정 결과를 도 2b에 나타내었다.
도 2b 의 Control은 음성대조군으로서 천연발효식초를 접종하지 않고, D-갈락토사민 접종한 것이고, Sily.는 양성대조군으로서, 실시예의 천연발효식초 대신 실리마린(Silymarin)을 접종한 것이다.
(4) 통계
모든 실험은 3~5 회 반복 시행하였으며, 결과는 평균 ± SEM 또는 SD로 나타니였으며 두 그룹 사이의 유의차는 unpaired Student‘s t-test에 의하여 p±0.05 수준에서 검정하였다.
도 2a의 간세포 독성 평가를 살펴보면, 실시예 1 ~ 4 모두 5 mg/mL 까지는 세포 독성이 나타나지 않았으며, 10 mg/mL의 농도에서는 독성이 다소 나타났다.
그리고, 도 2b의 간세포 보호 평가를 살펴보면, 동일 농도(5 mg/mL)에서 천연발효식초 제조시 사용된 혼합액 내 파쇄물 함량이 증가할수록 간세포 보호 효과가 증가하는 것을 확인하였다. 그리고, 고농도(10 mg/mL)에서는 천연발효식초 자체에 의한 독성으로 인해 오히려 간세포 보호 효과가 감소하는 문제가 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 4에서도 간세포 보호 효과를 나타내므로 발효가 가능한 파쇄물 내 황칠 및 미나리 1:0.43 중량비를 고정하고, 파쇄물 함량을 20 중량%로 하여 발효식초 를 하기와 같이 제조하였다.
실시예 5 : 천연발효식초의 제조
건조된 황칠나무 잎 및 건조된 돌미나리를 1 : 0.43 중량비로 혼합하여 혼합물을 제조한 후, 파쇄하여 파쇄물을 제조하였다.
다음으로, 상기 파쇄물, 사과농축액 및 정제수를 하기 표 2와 같은 함량으로 혼합하여 혼합액을 각각 제조한 후, 실시예 4와 동일한 조건 및 방법으로 천연발효식초를 제조하였다.
비교예 1 : 추출액의 제조
건조된 황칠나무 잎 및 건조된 돌미나리를 1 : 0.43 중량비로 혼합하여 혼합물을 제조한 후, 파쇄하여 파쇄물을 제조하였다.
다음으로, 상기 파쇄물, 사과농축액 및 정제수를 하기 표 2와 같은 함량으로 혼합하여 혼합액을 제조하였다.
다음으로, 상기 혼합액을 필터링하여 추출액을 제조하였다.
비교예 2 : 알코올 발효물의 제조
건조된 황칠나무 잎 및 건조된 돌미나리를 1 : 0.43 중량비로 혼합하여 혼합물을 제조한 후, 파쇄하여 파쇄물을 제조하였다.
다음으로, 상기 파쇄물, 사과농축액 및 정제수를 하기 표 2와 같은 함량으로 혼합하여 혼합액을 각각 제조한 후, 실시예 4와 동일한 조건으로 1차 발효만 수행하여 알코올 5~6 부피% 함유한 1차 발효물(알코올 발효물)을 수득하였다.
혼합액
(중량%)		 정제수 사과
농축액		 파쇄물 수율 (%)
함량 황칠: 미나리
(중량비)
비교예 1
(추출물)		 62.86 17.14 20 1 : 0.43 13.74
비교예 2(알코올 발효물) 62.86 17.14 20 1 : 0.43 3.46
실시예 5(천연발효식초) 62.86 17.14 20 1 : 0.43 3.14
실시예 5, 비교예 1 ~ 2에서 제조한 천연발효식초, 추출물 및 알코올 발효물의 사진을 도 3에 나타내었다.
실험예 2 : 간세포 독성 및 손상된 간세포 보호 평가 실험 2
상기 실험예 1과 동일한 방법으로 실시예 5 및 비교예 1 ~ 2에 대한 간세포 독성 평가 및 손상된 간세포 보호 평가 실험을 수행하였으며, 그 결과를 도 4a(간세포 독성 평가) 및 도 4b(간세포 보호 평가)에 나타내었다.
도 4a를 살펴보면, 실시예 5 및 비교예 1 ~ 2 모두 10 mg/mL의 농도를 제외한 모든 시료에서 세포 독성은 나타나지 않았다.
도 4b를 살펴보면, 각 농도 별로 비교예 1(추출물), 비교예 2(알코올 발효물)과 비교할 때, 실시예 5의 천연발효식초가 상대적으로 높은 간보호 효과가 높은 결과를 보였다. 다만, 10 mg/mL의 농도에서는 세포 독성에 의해 간보호 효과가 오히려 나타나지 않았다.
실시예 6 : 분말(powder)형 천연발효식초 제조
실시예 5에서 제조한 천연발효식초를 동결건조하여 천연발효식초 분말을 제조하였다.
실시예 7 : 천연발효식초 파우치 제조
실시예 5에서 제조한 천연발효식초를 4.5 중량%, 프락토올리고당 16 중량%, 레드자몽농축액 4.33 중량%, 폴리덱스트로스 3 중량%, 사과농축액 2 중량% 및 잔량의 정제수를 혼합하여 천연발효식초 파우치를 제조하였다.
실시예 8 : 천연발효식초 농축액 제조
실시예 5에서 제조한 천연발효식초를 25중량%, 프락토올리고당 36 중량%, 사과농축액 7 중량%, 레드자몽 농축액 1 중량%, 구연산 0.5 중량%, 스테비올 배당체 0.015 중량% 및 잔량의 정제수를 혼합하여 천연발효식초 농축액을 제조하였다.
실험예 3 : 간 손상 보호, 예방 효과 측정
상기 실험예 1 ~ 2에서 세포 실험을 수행한 액상의 천연발효식초인 실시예 5, 실시예 6의 분말형 천연발효식초, 실시예 7의 천연발효식초 파우치 및 실시예 8의 천연발효식초 농축액에 대한 간 손상 보호, 예방 효과를 하기와 같이 측정하였다.
(1) 동물실험 과정
하나바이오(경기도 성남, 한국)로부터 쥐(Mus musculus, ICR mouse: imprinting control region mouse) 구입하였고, 이를 동물실험하였다.
동물 실험은 7일간의 적용기를 가진 쥐를 8일차에 실험물질인 양조식초(식초 대조군), 실리마린(양성대조군) 실시예 5 ~ 8을 쥐에 하기 표 3의 농도로 쥐 무게에 따라 각각 섭취(또는 투여)시킨 후, 15일 차에 D-갈락토사민(850mg/kg, I.P)을 투여하여 간 손상을 유도한 다음, 16일 차에 간 손상된 쥐로부터 혈액 등을 수득하여 하기 실험을 수행하였다.
하기 모든 실험은 3-5 회 반복 시행할 계획이며, 결과는 평균 ± SEM 또는 SD로 나타낼 것이며 두 그룹 사이의 유의차는 unpaired Student‘s t-test에 의하여 p±0.05 수준에서 검정하였다.
(2) 손상된 간의 ALT(Alanine transaminase), AST(aspartate transaminase) 측정
간 조직 기능 관련 효소의 작용을 확인하기 위해 혈액 내 ALT, AST를 측정하였으며, 혈액을 원심분리하여 혈청을 수득하고 IFCC(International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine) 방법을 기반으로 Agappe Diagnostics에서 제작된 키트로 매뉴얼을 참조하여 340 nm의 파장에서의 ALT, AST 활성도(activity)를 측정하였고, 그 결과를 하기 표 3 에 나타내었다.
구분 ALT (U/L) AST (U/L)
미처리군(Normal) 78.0 ± 8.4 29.2 ± 1.9
음성대조군(D-galactosamine만 처리, 850 mg/kg) 1050.7 ± 122.7# 927.6 ± 150.0#
실리마린(Silymarin 50 mg/kg, 양성대조군) 207.6 ± 28.0*** 150.0 ± 26.1***
식초 대조군(3 mL/kg, 양조식초) 572.3 ± 146.3** 517.7 ± 142.3**
실시예 5 (액상 천연발효식초, 0.08 mL/kg) 1018.6 ± 104.4 1028.1 ± 172.2
실시예 5 (액상 천연발효식초, 3 mL/kg) 577.7 ± 120.6** 572.5 ± 190.2**
실시예 6 (분말형 천연발효식초, 150 mg/kg) 561.9 ± 84.4** 547.2 ± 141.8**
실시예 6 (분말형 천연발효식초, 300 mg/kg) 274.4 ± 68.8*** 297.9 ± 91.2***
실시예 7 (천연발효식초 파우치, 3 mL/kg) 676.2 ± 136.9** 650.1 ± 121.2*
실시예 8 (천연발효식초 농축액, 3 mL/kg) 851.3 ± 103.2* 851.2 ± 153.5
#: Normal과 D-galactosamine 군의 비교 p<0.05,
*: 실험군과 D-galactosamine의 비교 p<0.05,
**: 실험군과 D-galactosamine의 비교 p<0.01,
***: 실험군과 D-galactosamine의 비교 p<0.001
상기 표 3을 살펴보면, D-galactosamine으로 간 손상을 유도하면 ALT와 AST의 수치가 정상 수치보다 약 25배 이상 증가하는 것을 확인할 수 있다. 그리고, 실시예 5 ~ 8의 천연발효식초 섭취량이 증가할수록 ALT와 AST 수치가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해서, 본 발명의 액상, 분말, 파우치 및 농축액 타입의 천연발효식초가 간 보호 효과를 갖는 것을 확인할 수 있었다.
(3) 손상된 간의 글루타치온 레벨(Glutathione lever) 측정
간 조직의 비효소적 항산화 체계를 확인하기 위해 환원형 글루타치온을 측정하였다.
간 조직을 균질하고 0.5 mL의 PBS(phosphate buffer saline)와 0.5 mL의 10% TCA(trichloroacetic acid) 혼합액을 조직에 현탁한 뒤, 원심분리한 다음, 상등액을 버퍼 A(0.1 M sodium phosphate, 5 μM EDTA, 0.6 mM 5,5’-dithio-bis-2-nitrobenzoic acid, 0.2 mM NADPH)와 버퍼 B(10 U/mL, glutathione reductase in 0.1 M sodium phosphate buffer)로 혼합하고 412 nm의 흡광도를 측정하였고, 그 결과를 하기 표 4에 나타내었다.
구분 Glutathione(μmol/mg)
미처리군(Normal) 8.00 ± 0.19
음성대조군(D-galactosamine만 처리, 850 mg/kg) 4.76 ± 0.43
실리마린(Silymarin 50 mg/kg, 양성대조군) 7.14 ± 0.14**
식초 대조군(3 mL/kg, 양조식초) 5.82 ± 1.34
실시예 5 (액상 천연발효식초, 0.08 mL/kg) 5.41 ± 0.43
실시예 5 (액상 천연발효식초, 3 mL/kg) 8.40 ± 0.10***
실시예 6 (분말형 천연발효식초, 150 mg/kg) 7.99 ± 0.12***
실시예 6 (분말형 천연발효식초, 300 mg/kg) 8.65 ± 0.22***
실시예 7 (천연발효식초 파우치, 3 mL/kg) 6.17 ± 0.08*
실시예 8 (천연발효식초 농축액, 3 mL/kg) 6.40 ± 0.03**
#: Normal과 D-galactosamine 군의 비교 p<0.05,
*: 실험군과 D-galactosamine의 비교 p<0.05,
**: 실험군과 D-galactosamine의 비교 p<0.01,
***: 실험군과 D-galactosamine의 비교 p<0.001
상기 표 4를 살펴보면, D-갈락토사민으로 간 손상을 유도하면(음성대조군), 활성산소를 제거하는 역할을 하는 아미노산 복합체인 글루타치온(glutathione)이 정상 수치보다 40.5% 감소하는 것을 확인할 수 있다.
그리고, 실시예 5 ~ 8의 천연발효식초 섭취량이 증가할수록 글루타치온 수치가 증가하는 결과를 보였으며, 특히 실시예 5의 천연발효식초(3 mL/kg) 및 실시예 6의 분말형 천연발효식초(300 mg/kg)의 실험군에서 글루타치온의 수치가 미처리군(normal) 보다 높은 것을 확인할 수 있었다.
이를 통해서, 본 발명의 천연발효식초가 글루타치온 증가를 통한 간 보호 효과를 갖는 것을 확인할 수 있었다.
(4) 손상된 간의 MDA (Malondialdehyde) 함량 측정
지질의 과산화물인 MDA를 에머릿(Emerit) 등의 방법을 이용하여 실험하였다. 간 조직의 10% 균질액 0.2 mL와 0.2N HCl 0.1 mL를 혼합하여 60℃에서 80분간 가열하여 시료를 가수분해시킨 다음, 가수분해한 시료에 0.4 mM 1-메틸-2-페닐인돌(1-methyl-2-phenylindole) 0.65 mL와 37% HCl 0.15 mL를 넣어 혼합시키고 45℃에서 40분 동안 반응시킨 다음 원심분리하여 얻은 상등액의 흡광도를 586 nm에서 측정하였으며, 그 결과를 하기 표 5에 나타내었다.
시료 MDA (nmol/g)
미처리군(Normal) 81.33 ± 6.67
음성대조군(D-galactosamine만 처리, 850 mg/kg) 165.71 ± 5.71
실리마린(Silymarin 50 mg/kg, 양성대조군) 84.63 ± 5.62***
식초 대조군(3 mL/kg, 양조식초) 165.11 ± 9.46
실시예 5 (액상 천연발효식초, 0.08 mL/kg) 140.19 ± 5.84*
실시예 5 (액상 천연발효식초, 3 mL/kg) 67.52 ± 7.37***
실시예 6 (분말형 천연발효식초, 150 mg/kg) 97.55 ± 4.25***
실시예 6 (분말형 천연발효식초, 300 mg/kg) 83.13 ± 4.18***
실시예 7 (천연발효식초 파우치, 3 mL/kg) 122.47 ± 3.63***
실시예 8
(천연발효식초 농축액, 3 mL/kg)		 112.26 ± 9.65**
#: Normal과 D-galactosamine 군의 비교 p<0.05,
*: 실험군과 D-galactosamine의 비교 p<0.05,
**: 실험군과 D-galactosamine의 비교 p<0.01,
***: 실험군과 D-galactosamine의 비교 p<0.001
상기 표 5의 측정결과를 살펴보면, D-갈라토사민으로 간 손상을 유도하면 간 손상의 지표물질인 MDA의 정상 수치보다 약 2배 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
그리고, 실시예 5 ~ 8의 천연발효식초 섭취량이 증가할수록 MDA 수치는 감소하는 결과를 보였다. 특히 실시예 5의 천연발효식초의 3 mL/kg의 섭취군에서 양성대조군인 실리마린(silymarin)보다 더 낮은 MDA 수치를 확인할 수 있었다.
이를 통해서, 본 발명의 천연발효식초가 MDA 감소를 통한 간 보호 효과를 갖는 것을 확인할 수 있었다.
(5) 손상된 간의 SOD (superoxide dismutase) 활성 측정
간 조직 내 SOD 활성은 SOD assay kit (Dojindo Molecular Technologies, Tokyo, Japan)을 이용하여 측정하였으며, 측정결과를 하기 표 6에 나타내었다.
시료 SOD (U/mg)
미처리군(Normal) 57.06 ± 4.46
음성대조군(D-galactosamine만 처리, 850 mg/kg) 28.99 ± 0.40
실리마린(Silymarin 50 mg/kg, 양성대조군) 44.13 ± 6.64
식초 대조군(3 mL/kg, 양조식초) 35.32 ± 0.07**
실시예 5 (액상 천연발효식초, 0.08 mL/kg) 38.37 ± 1.84*
실시예 5 (액상 천연발효식초, 3 mL/kg) 53.51 ± 5.21*
실시예 6 (분말형 천연발효식초, 150 mg/kg) 38.47 ± 4.72
실시예 6 (분말형 천연발효식초, 300 mg/kg) 56.28 ± 3.44*
실시예 7 (천연발효식초 파우치, 3 mL/kg) 39.62 ± 1.26*
실시예 8 (천연발효식초 농축액, 3 mL/kg) 34.78 ± 1.60
#: Normal과 D-galactosamine 군의 비교 p<0.05,
*: 실험군과 D-galactosamine의 비교 p<0.05,
**: 실험군과 D-galactosamine의 비교 p<0.01,
***: 실험군과 D-galactosamine의 비교 p<0.001
표 6의 SOD 활성 측정 결과를 살펴보면, D-갈락토사민(음성대조군)으로 간 손상을 유도하면 신체 내에 항산화 효소인 SOD의 활성이 정상 수치보다 약 50% 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
이에 반해, 실시예 5 ~ 8의 천연발효식초 섭취량이 증가할수록 SOD의 활성이 증가하였다. 그리고, 실시예 5의 천연발효식초 3 mL/kg 및 실시예 6을 300 mg/kg섭위한 군에서 양성대조군(silymarin) 군보다 높은 SOD 활성을 확인할 수 있었다.
이를 통해서, 본 발명의 천연발효식초가 SOD 활성 증가를 통한 간 보호 효과를 갖는 것을 확인할 수 있었다.
(6) CYP2E1, CYP2A4, PPARγ 단백질 발현 확인
D-갈락토사민으로 산화적 손상을 유도한 간 조직 내 CYP2E1, CYP2A4, PPARγ 단백질 발현 확인을 위해 웨스턴 블롯(Western blot)을 수행하였으며, 측정 결과를 도 5a 및 도 5b에 나타내었다.
도 5a 및 도 5b에서 N는 미처리군(normal)이고, C는 음성대조군(D-갈락토사민로만 처리하여 간의 산화적 손상 유도, 850 mg/kg), P.C는 양성대조군(silymarin, 50 mg/kg)이며, V.C는 식초 대조군(양조식초, 3 mL/kg), DEVL는 실시예 5의 액상 천연발효식초(mL/kg), DEVS는 실시예 6의 분말형 천연발효식초(mg/kg), S1은 실시예 7의 천연발효식초 파우치(mL/kg), S2은 실시예 8의 천연발효식초 농축액(mL/kg)이다.
도 5a 및 도 5b의 CYP2E1, CYP2A4, PPARγ의 단백질 발현을 western blot으로 확인한 결과, 미처리군(N)과 비교하여 음성대조군(C)에서 CYP2E1과 CYP2A4는 과발현하고, PPARγ는 감소하는 것을 확인할 수 있었다. PPARγ의 감소는 항산화 단백질의 기전으로 D-갈락토사민의 처리에 의해 감소하는 것으로 알려져 있다.
그리고, 실시예 5 ~ 8의(DEVL. DEVS, S1, S2)의 경우, 음성대조군과 비교할 때, 전반적으로 CYP2E1 및 CYP2A4 발현이 상대적으로 크게 감소하고, PPARγ 발현은 상대적으로 크게 증가하는 경향을 보였다.
특히, DEVL 3.0 mL/kg 및 DEVS 300 mg/kg가 CYP2E1, CYP2A4 단백질 발현 감소 및 PPARγ 단백질 발현이 증가하는 우수한 효과를 보였다.
이를 통해서, 본 발명의 천연발효식초가 간 보호 효과가 산화적 스트레스의 감소에 의해 간 보호 효과를 갖는 것을 확인할 수 있었다.
(7) CYP2E1, CYP2A4, PPARγ 의 mRNA 발현 확인
D-갈락토사민으로 산화적 손상을 유도한 간 조직 내 CYP2E1, CYP2A4, PPARγ 의 mRNA 발현 확인을 위해 웨스턴 블롯(Western blot)을 수행하였으며, 측정 결과를 도 6a 및 도 6b에 나타내었다.
도 6a 및 도 6b에서 N는 미처리군(normal)이고, C는 음성대조군(D-갈락토사민로만 처리하여 간의 산화적 손상 유도, 850 mg/kg), P.C는 양성대조군(silymarin, 50 mg/kg)이며, V.C는 식초 대조군(양조식초, 3 mL/kg), DEVL는 실시예 5의 액상 천연발효식초(mL/kg), DEVS는 실시예 6의 분말형 천연발효식초(mg/kg), S1은 실시예 7의 천연발효식초 파우치(mL/kg), S2은 실시예 8의 천연발효식초 농축액(mL/kg)이다.
CYP2E1, CYP2A4, PPARγ의 mRNA 발현을 PCR로 증폭하여 확인한 결과, 미처리군(N)과 비교하여 음성대조군(C)에서 CYP2E1과 CYP2A4는 과발현하고, PPARγ는 감소하는 것을 확인할 수 있었다.
그리고, 실시예 5 ~ 8의(DEVL. DEVS, S1, S2)의 경우, 음성대조군과 비교할 때, 전반적으로 CYP2E1 및 CYP2A4의 mRNA 발현이 상대적으로 감소하고, PPARγ의 mRNA 발현은 크게 증가하는 경향을 보였다.
특히, 실시예 6의 분말형 천연발효식초(DEVS)의 3 mL/kg로 처리 후 CYP2E1는 0.73 fold로 감소하였고, CYP2A4는 0.77 fold로 감소하고, PPARγ는 0.79 fold로 증가하는 것으로 나타났다.
이를 통해서, 본 발명의 천연발효식초가 간 보호 효과가 산화적 스트레스의 감소에 의해 간 보호 효과를 갖는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 4 : 신장 손상 보호, 예방 효과 측정
상기 실험예 1 ~ 2에서 세포 실험을 수행한 액상의 천연발효식초인 실시예 5, 실시예 6의 분말형 천연발효식초, 실시예 7의 천연발효식초 파우치 및 실시예 8의 천연발효식초 농축액에 대한 신장 손상 보호, 예방 효과를 측정하였다.
측정 방법은 상기 실험예 4의 동물실험 과정과 동일하며, D-갈락토사민(850mg/kg, I.P)을 투여하여 신장 손상을 유도된 쥐로부터 혈액 등을 수득하여 하기 실험을 수행하였다.
하기 모든 실험은 3-5 회 반복 시행할 계획이며, 결과는 평균 ± SEM 또는 SD로 나타낼 것이며 두 그룹 사이의 유의차는 unpaired Student‘s t-test에 의하여 p ± 0.05 수준에서 검정하였다.
(1) 혈액 내 BUN, Cre 함량 확인 실험
혈액 내 BUN(blood urea nitrogen), Cre(creatinine)의 함량을 mouse BUN, Cre ELISA kit를 사용하여 실험을 수행하였으며, 그 결과를 하기 표 7에 나타내었다.
시료 BUN (mg/dL) Cre (mg/dL)
미처리군(Normal) 42.8 ± 1.9 0.136 ± 0.060
음성대조군
(D-galactosamine만 처리, 850 mg/kg)		 40.5 ± 1.9 0.225 ± 0.072#
실리마린(Silymarin 50 mg/kg, 양성대조군) 30.1 ± 2.3* 0.148 ± 0.012*
식초 대조군(3 mL/kg, 양조식초) 28.9 ± 3.3* 0.134 ± 0.014*
실시예 5 (액상 천연발효식초, 0.08 mL/kg) 22.2 ± 8.7* 0.130 ± 0.049*
실시예 5 (액상 천연발효식초, 3 mL/kg) 26.6 ± 4.9* 0.118 ± 0.075*
실시예 6 (분말형 천연발효식초, 150 mg/kg) 20.2 ± 2.3*** 0.120 ± 0.022*
실시예 6 (분말형 천연발효식초, 300 mg/kg) 31.2 ± 3.3* 0.086 ± 0.051**
실시예 7 (천연발효식초 파우치, 3 mL/kg) 31.8 ± 3.4* 0.116 ± 0.033*
실시예 8
(천연발효식초 농축액, 3 mL/kg)		 35.3 ± 2.7 0.095 ± 0.034*
#: Normal과 D-galactosamine 군의 비교 p<0.05,
*: 실험군과 D-galactosamine의 비교 p<0.05,
**: 실험군과 D-galactosamine의 비교 p<0.01,
***: 실험군과 D-galactosamine의 비교 p<0.001
상기 표 7을 살펴보면, D-갈락토사민으로 신장 손상을 유도된 음성대조군의 경우, 미처리군과 비교할 때, Cre의 수치가 유의적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었다.
이에 반해, 실시예 5 ~ 8의 경우, 섭취량이 증가할수록 BUN과 Cre의 수치가 감소하는 결과를 보였다. 이를 통해서, 본 발명의 천연발효식초가 신장 보호 효과를 갖음을 확인할 수 있었다.
(2) Caspase-3, Bcl-2, Bax 단백질 발현 확인
D-갈락토사민으로 산화적 손상을 유도한 신장 조직 내 Caspase-3, Bcl-2, Bax 단백질 발현 확인을 위해 웨스턴 블롯(Western blot)을 수행하였으며, 측정 결과를 도 7a 및 도 7b에 나타내었다.
도 7a 및 도 7b에서 N는 미처리군(normal)이고, C는 음성대조군(D-갈락토사민로만 처리하여 간의 산화적 손상 유도, 850 mg/kg), P.C는 양성대조군(silymarin, 50 mg/kg)이며, V.C는 식초 대조군(양조식초, 3 mL/kg), DEVL는 실시예 5의 액상 천연발효식초(mL/kg), DEVS는 실시예 6의 분말형 천연발효식초(mg/kg), S1은 실시예 7의 천연발효식초 파우치(mL/kg), S2은 실시예 8의 천연발효식초 농축액(mL/kg)이다.
Caspase-3, Bcl-2, Bax의 단백질 발현을 western blot으로 확인한 결과, 미처리군(N)과 비교하여 음성대조군(C)에서 caspase-3 (1.31 fold)와 Bax (1.33 fold)는 과발현하고, Bcl-2 (0.65 fold)는 감소하는 것을 확인할 수 있으며, Bcl-2의 감소는 D-갈락토사민 처리에 의해 감소하는 것으로 알려져 있다.
이에 반해, 실시예 5 ~ 8의(DEVL. DEVS, S1, S2)의 경우, 음성대조군과 비교할 때, 전반적으로 caspase-3 및 Bax 단백질 발현이 상대적으로 크게 감소하고, Bcl-2 단백질 발현은 크게 증가하는 경향을 보였다.
특히, DEVL, DEVS의 경우, caspase-3 (DEVS 3 mL/kg, 0.47 fold)와 Bax (DEVS 3 mL/kg, 0.30 fold)는 감소하고, Bcl-2 (DEVS 3 mL/kg, 1.55 fold)는 증가하는 것으로 나타났으며, 이를 통해서, 본 발명의 천연발효식초가 신장 보호 효과를 갖는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 5 : 간, 신장 조직의 현미경 측정
상기 실험예 3 및 실험예 4의 실험에 사용된 각 시료를 섭취한 쥐의 간 및 신장 조직을 떼어내어 H&E(헤마톡실린 및 에오신) 염색 처리하여, 조직을 현미경으로 관찰하였으며, 그 결과를 도 8a 및 도 8b에 나타내었다.
도 8a 및 도 8b는 실시예 5 ~ 실시예 8의 천연발효식초(액상, 분말, 파우치, 농축액)을 쥐에 미리 경구투여하여 간 및 신장을 보호한 후 D-갈락토사민 850 mg/kg로 유도된 급성 간/신장 손상으로 인해 간 조직의 파괴 및 신장 조직의 이상 병변 등이 예방이 되는지 확인한 결과로서, H&E 염색을 통해 간의 조직학적 형태 변화를 관찰한 결과이다.
음성대조군(D-galatosamine만 처리)은 간 조직과 간 중심 정맥의 손상 및 간 병변을 확인하였으며 D-갈락토사민 투여로 인해 마우스 간 조직에서 간 문맥(PV) 주위의 림프구 침투, 조직 괴사, 약한 정도의 복합적 염증 발생 등의 조직적 손상이 관찰됨을 확인할 수 있다.
이에 비해 실시예 5 ~ 실시예 8은 음성대조군에 비해 손상 부위가 현저히 감소한 것을 확인할 수 있었다.
이는 앞서 간 독성 지표로 확인한 혈청 내의 ALT, AST 결과와 일치하는 결과로 일정 농도의 본 발명읜 천연발효식초 투여 또는 섭취는 간 조직에 긍정적인 영향을 미치는 것으로 확인할 수 있다.
반면, 신장 조직에서는 독성 물질 투여 이후 24시간 절식 과정에서의 눈에 띄는 변화는 확인할 수 없었다.
실험예 6 : 주요 성분 분석
상기 실시예 5(천연발효식초), 비교예 1(추출물) 및 비교예 2(알코올 발효물) 각각에 대한 주요성분분석을 수행하였고, 그 결과를 하기 표 8에 나타내었다.
구분 chlorogenic acid (μg/mL) β-sitosterol
(μg/mL)		 caffeic acid
(μg/mL)		 kaempferol (μg/mL) quercetin
(μg/mL)
비교예 1
(황칠/미나리 추출물)		 144.16 N.D. N.D. 5.98 N.D.
비교예 2
(황칠/미나리 알코올 발효물)		 165.80 N.D. N.D. 17.88 N.D.
실시예 5
(황칠/미나리 천연발효식초)		 197.83 N.D. N.D. 17.54 N.D.
N.D.(Not detect) : 발견 안됨
상기 표 8의 주요성분 분석 결과를 살펴보면, 실시예 5의 천연발효식초가 추출물인 비교예 1에 비해 37% 이상으로 클로로젠산(chlorogenic acid) 을 포함하며, 1차 발효된 알코올 발효물인 비교예 2에 비해 19.0% 이상으로 클로로젠산을 포함하는 결과를 보였다.
또한, 실시예 5의 천연발효식초는 추출물인 비교예 1에 비해 190% 이상으로 캠퍼롤(kaempferol)을 더 함유하는 결과를 보였다.
이를 통해서, 1차 알코올 발효 및 2차 발효시켜 제조한 본 발명의 천연발효식초가 클로로젠산 및 캠퍼롤을 고함량으로 포함하고 있음을 확인할 수 있었다.
상기 실시예 및 실험예를 통하여, 황칠나무 및 미나리를 이용하여, 본 발명의 방법으로 제조한 이용하여 천연발효식초가 간 및/또는 신장 손상에 대한 보호, 개선 및/또는 예방 효과가 있음을 확인할 수 있었으며, 본 발명의 천연발효식초를 액상, 분말, 파우치 또는 농축액 등 다양한 형태로 가공하여 제공할 수 있음을 확인할 수 있었다.
한국생명공학연구원 생물자원센터 KCTC12702BP 20141107 한국생명공학연구원 생물자원센터 KCTC12701BP 20141107

Claims (7)

  1. 건조된 황칠나무 및 건조된 미나리를 포함하는 혼합물을 파쇄한 파쇄물, 사과 농축액 및 정제수를 혼합하여 혼합액을 제조하는 1단계;
    상기 혼합액에 효모를 접종한 후, 1차 발효시켜서 알코올 농도 5.0 ~ 6.5 부피%로 포함하는 발효물을 제조하는 2단계; 및
    상기 발효물에 초산 균주를 접종한 다음, 2차 발효시켜서 산도 4.5 ~ 5.5인 발효식초를 제조하는 3단계;
    를 포함하는 공정을 수행하는 것을 특징으로 하는 황칠나무와 미나리를 이용한 천연발효식초의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, 1단계의 상기 혼합물은 황칠나무 및 미나리를 1: 0.35 ~ 1.00 중량비로 포함하고,
    1단계의 상기 혼합액은 파쇄물 18.0 ~ 23.5 중량%, 사과 농축액 15.0 ~ 19.0 중량% 및 잔량의 정제수를 포함하는 것을 특징으로 하는 황칠나무와 미나리를 이용한 천연발효식초의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, 1단계의 상기 황칠나무는 황칠나무 잎을 포함하고, 상기 미나리는 돌미나리를 포함하는 것을 특징으로 하는 황칠나무와 미나리를 이용한 천연발효식초의 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 1차 발효는 25 ~ 35℃에서 48 ~ 72 시간 동안 발효를 수행하며, 상기 효모는 맥주효모균을 포함하고,
    상기 2차 발효는 25 ~ 35℃에서 72 ~ 96 시간 동안 발효를 수행하며, 상기 초산 균주는 인터메디우스형 글루코노박터 인터메디우스(Gluconobacter intermedius)를 포함하는 것을 특징으로 하는 황칠나무와 미나리를 이용한 천연발효식초의 제조방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중에서 선택된 어느 한 항의 방법으로 제조된 천연발효식초이며,
    천연발효식초 내 클로로젠산(chlorogenic acid) 170.00 ~ 250.00 ㎍/㎖ 및 캠퍼롤(kaempferol) 15.00 ~ 20.00 ㎍/㎖을 함유하고 있는 것을 특징으로 하는 황칠나무와 미나리를 이용한 천연발효식초.
  6. 제5항의 천연발효식초를 유효성분으로 포함하는 간 및 신장 기능 보호, 개선용 건강식품.
  7. 제6항에 있어서, 상기 천연발효식초는 액상, 분말, 파우치 또는 농축액인 것을 특징으로 간 및 신장 기능 보호, 개선용 건강식품.
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Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20020025146A (ko) 2002-02-27 2002-04-03 이종선 느릅나무, 인진쑥환을 주제로 한 건강식품
KR20130117052A (ko) * 2012-04-17 2013-10-25 계명대학교 산학협력단 미나리 발효초 및 이를 이용한 음용식초
KR20170115265A (ko) * 2016-04-07 2017-10-17 주식회사 에이치씨바이오텍 황칠나무 추출액을 이용한 발효식초 및 그 제조방법
KR101917115B1 (ko) * 2018-03-12 2019-01-24 김미자 발아 현미 여주 흑초 제조 방법
KR102108486B1 (ko) * 2018-06-28 2020-05-13 농업회사법인 주식회사 생생초 금강송 발효식초 및 유산균 발효액을 함유하는 음료의 제조방법 및 상기 제조방법으로 제조된 음료
KR20210015272A (ko) 2019-08-01 2021-02-10 비알 컨설팅 인코포레이티드 간 및 신장 기능 개선용 황칠계 복합 추출물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 건강기능식품

Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20020025146A (ko) 2002-02-27 2002-04-03 이종선 느릅나무, 인진쑥환을 주제로 한 건강식품
KR20130117052A (ko) * 2012-04-17 2013-10-25 계명대학교 산학협력단 미나리 발효초 및 이를 이용한 음용식초
KR20170115265A (ko) * 2016-04-07 2017-10-17 주식회사 에이치씨바이오텍 황칠나무 추출액을 이용한 발효식초 및 그 제조방법
KR101917115B1 (ko) * 2018-03-12 2019-01-24 김미자 발아 현미 여주 흑초 제조 방법
KR102108486B1 (ko) * 2018-06-28 2020-05-13 농업회사법인 주식회사 생생초 금강송 발효식초 및 유산균 발효액을 함유하는 음료의 제조방법 및 상기 제조방법으로 제조된 음료
KR20210015272A (ko) 2019-08-01 2021-02-10 비알 컨설팅 인코포레이티드 간 및 신장 기능 개선용 황칠계 복합 추출물, 이의 제조방법 및 이를 포함하는 건강기능식품

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