CN106962933B - 香水莲花提取物及其组合物在预防肥胖、改善肠道菌群方面的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了香水莲花提取物及其组合物的用途：用于制备抑制胰脂肪酶活性、改善肠道菌群的食品、保健食品、药品；用于制备预防肥胖或减肥降脂的食品、保健食品、药品。预防肥胖或减肥降脂包括抑制胰脂肪酶活性、改善体重、调节血脂以及改善肠道菌群；改善肠道菌群包括增加肠道微生物丰度、多样性、改善肠道菌群结构。香水莲花提取物组合物由香水莲花提取物以及荷叶提取物、绿茶提取物、决明子提取物、葡萄籽提取物中的至少一种组合而成，香水莲花提取物在组合物中的重量含量为≥20％。

Description

香水莲花提取物及其组合物在预防肥胖、改善肠道菌群方面 的用途
技术领域
本发明属于天然产物应用技术领域，具体涉及一种香水莲花提取物及其组合物在预防肥胖方面的用途，其预防肥胖的机理为抑制胰脂肪酶活性、改善肠道菌群。
背景技术
作为一种公共卫生问题，肥胖的发病率随着人们生活水平与生活方式的改变在全球呈不断上升趋势，它已成为危害全人类的慢性非传染性疾病(Non-communicableDiseases，NCD)。从营养学角度看，肥胖是机体营养过剩的表现；从医学角度看，肥胖是脂肪细胞脂肪含量过多或过大的表现。中国把身体指数(Body Mass Index，BMI)超过28的人群定义为肥胖患者，而世界卫生组织(World Health Organization，WHO)把BMI超过30的人群定义为肥胖患者。
2014年，全球中共有13％的成年人(18周岁以上)患有肥胖症，而中国从2010年到2014 年，成年人的平均肥胖率从5.4％上升到7.3％。WHO已经将它定义为二十一世纪的流行病，并极力倡导人们采取各种方式控制它的进一步发展。肥胖不仅影响体型与美观，且与糖尿病、高血压、高血脂、冠心病、阻塞性睡眠呼吸暂停和骨关节炎等疾病息息相关。它由多种复杂因素混合导致，包括遗传、行为、社会、环境等，但根本原因是能量摄入与消耗的不平衡。
2015年，美国内分泌学会发布了首部《肥胖药物治疗指南》，其中指出，截止2015年FDA 共批准六种用于治疗肥胖的药物，包括奥利司他、非处方型奥利司他、氯卡色林、芬特明/托吡酯、环丙甲羟二羟吗啡酮/安非他酮和利拉鲁肽。这些减肥药主要包括两大类：1)作用于中枢的减肥药，用于抑制食欲、增加饱腹感，如氯卡色林；2)作用于外周的减肥药，用于抑制脂肪代谢相关酶活性，如奥利司他。
胰脂肪酶(Pancreatic Lipase，EC 3.1.1.3)在人体中由PNLIP基因编码，是一种由胰腺分泌，负责水解50％～70％膳食脂肪的关键生物酶，它能催化甘油三酯分解生成游离脂肪酸、甘油、单酯和二酯，游离脂肪酸经小肠上皮细胞吸收，重新合成甘油三酯并运输到各器官中进行积累。当胰脂肪酶的代谢失去平衡后，便会产生肥胖及相关的代谢疾病，因此可以通过调节胰脂肪酶的活性来控制膳食脂肪在人体消化道中的分解与吸收，从而起到减肥降脂的作用。
奥利司他作为胰脂肪酶抑制剂，是通过抑制胰脂肪酶活性起到减肥作用，是目前市场上美国FDA批准使用的唯一一种不是作用于中枢神经系统的减肥药。然而，奥利司他的一系列胃肠道副作用也逐渐被揭露，包括胃肠排气增多、脂肪泻、失禁以及肝脏损伤。因此，天然胰脂肪酶抑制剂的开发和应用日益成为健康产业关注的热点。
肠道不仅是人体重要的消化吸收场所，同时它也是人体最大的免疫器官，为数以兆计的肠道微生物提供良好的栖息场所。1958年诺贝尔生理及医学奖获得者JoshuaLederberg将人体比作“超级生物体”，即人体是由真核细胞和与它们共生的微生物共同组成。研究表明，人体肠道微生物的数量可以达到1014，是人体细胞数量的10倍；重量高达2.1kg，接近人体肝脏的重量；包含的编码基因可以达到330万个，是人体基因组所含基因数的150倍。人体肠道微生物大致可分为六大类：厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门 (Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)和梭杆菌门 (Fusobacteria)，其中厚壁菌门与拟杆菌门为主要优势菌门。
近十几年，随着高通量测序技术与宏基因组学的快速发展，肠道菌群与肥胖的关系在学术界引起了研究狂潮。发表于《Nature》上的一篇文章曾对12名肥胖患者进行膳食限制治疗，分别给予碳水化合物限制性饮食与脂肪限制性饮食。在这一年的膳食限制治疗中，肥胖患者的体重有不同程度的降低，肥胖症状均得到缓解。此外，研究者们对肥胖患者的粪便进行了微生物基因组分析，结果表明，无论采取何种膳食限制治疗手段，患者肠道内的拟杆菌门微生物数量上升、厚壁菌门微生物数量下降。此后，人们逐渐发现天然产物可以通过影响肠道微生物的丰度、多样性及菌群结构起到减肥降脂的作用，包括灵芝多糖、藤茶提取物、蓝莓花青素、石榴皮多酚等，其作用机理是增加肠道有益菌的数量(如乳酸杆菌、双歧杆菌、Akk. 菌)，减少肠道有害菌的数量(如脱硫弧菌)，保护肠道屏障等。
香水莲花(Nymphaea hybrid)是睡莲科(Nymphaeaceae)睡莲属(Nymphaea)热带大型睡莲，2003年，在《中国花舟园艺》杂志中第一次报道问世。从1970年开始，中国 台湾园林部门在引进美国香莲的基础上经过多年选育，现己培育金、黄、红、紫、蓝、赤、绿等深浅不同的9种花色品种，故亦称之为“九品香莲”。香水莲花具有较好的耐寒性能，在适宜的温度下可全年不间断地开花，花朵硕大、色彩鲜艳、香气宜人，它集当今全球各种珍贵荷花与莲花的优点于一身，具有观赏、医疗、餐饮、美容等作用。新鲜的香水莲花经去除腐烂花、清水冲洗、干燥、冷却等工艺流程可制作出香水莲花茶，该茶是天然绿色食品，经热水冲泡后既拥有了茶的清新爽口，又保留了花的馥郁芳香。
金敬红等对香水莲花安全性进行了测定，小鼠急性经口毒性试验与大鼠长期毒性试验，发现实验老鼠活动、生长、摄食均正常，各类指标测定值均在正常范围内，各类器官病理组织学检查均未显示有异常。香水莲花是一种无毒无害的天然食用花卉，在食品、保健食品领域有广泛的应用空间。
香水莲花富含总酚、黄酮、鞣质、花色苷、生物碱等次生代谢产物。沈建福等研究表明，香水莲花醇提物可以清除DPPH、·过氧化氢及羟自由基，证实了其具有抗氧化能力，且其抗氧化能力与其总酚含量呈正相关性，相关性指数均大于0.9。车璐等发现香水莲花醇提取物对前列腺增生具有良好的改善作用，其作用表现为大鼠前列腺的5α-还原酶与前列腺酸性磷酸酶活性显著降低(p<0.05)，同时血清丙二醛含量显著减低(p<0.05)，大鼠血清内谷胱甘肽过氧化物酶活性显著增加(p<0.05)。孙玉洁采用小鼠B16黑素瘤细胞模型发现60％乙醇提取物能有效抑制黑素瘤细胞增殖，减少黑素合成，在100μg/mL浓度下，细胞增殖率分别下降到84.44 ±1.77％、48.24±3.14％，相对黑素含量减少了30.31％和33.02％，且能有效抑制细胞内酪氨酸酶活性，表明60％醇提物具有较好的美白作用。此外孙玉洁采用体外保湿实验与人体实验，均表明香水莲花的水提物以及子房提取物具有较好的保湿作用。而有关香水莲花提取物抑制胰脂肪酶、预防肥胖、改善肠道菌群功效的研究却无人报道。
荷叶提取物富含荷叶生物碱、荷叶黄酮等次生代谢产物，具有利尿通便、通肠毒、降脂清暑解热等生物学功效。绿茶提取物富含茶多酚、咖啡碱等次生代谢产物，具有抗氧化、降血脂、抑制肿瘤、杀菌解毒、提高机体免疫力等生物学功效。决明子提取物富含大黄素、大黄酚、大黄素甲醚、决明素、钝叶决明素等次生代谢产物，具有清热明目、润肠通便等生物学功效。葡萄籽提取物富含原花青素，具有抗氧化、降低血管粥样硬化、预防癌症、消炎等生物学功效。荷叶提取物、绿茶提取物、决明子提取物、葡萄籽提取物在健康食品的开发应用领域应用广泛。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供了一种香水莲花提取物及其组合物的用途，用于制备具有预防肥胖的食品、保健食品及药品。本发明制备的香水莲花及其组合物是通过抑制胰脂肪酶活性，增加肠道微生物丰度、多样性以及改善肠道菌群结构起到预防肥胖的作用。
为了解决上述技术问题，本发明提供一种香水莲花提取物及其组合物的用途：用于制备抑制胰脂肪酶活性、改善肠道菌群的食品、保健食品、药品。
作为本发明的香水莲花提取物及其组合物的用途的改进：用于制备预防肥胖或减肥降脂的食品、保健食品、药品。
作为本发明的香水莲花提取物及其组合物的用途的进一步改进：所述预防肥胖或减肥降脂包括抑制胰脂肪酶活性、改善体重、调节血脂以及改善肠道菌群。
作为本发明的香水莲花提取物及其组合物的用途的进一步改进：改善肠道菌群包括增加肠道微生物丰度、多样性、改善肠道菌群结构。
作为本发明的香水莲花提取物及其组合物的用途的进一步改进：香水莲花提取物组合物由香水莲花提取物以及荷叶提取物、绿茶提取物、决明子提取物、葡萄籽提取物中的至少一种组合而成，香水莲花提取物在组合物中的重量含量为≥20％。
作为本发明的香水莲花提取物及其组合物的用途的进一步改进：香水莲花提取物、香水莲花提取物组合物由20～100％香水莲花提取物、0～50％荷叶提取物、0～50％绿茶提取物、0～50％决明子提取物、0～50％葡萄籽提取物组成。
作为本发明的香水莲花提取物及其组合物的用途的进一步改进：香水莲花提取物组合物由香水莲花提取物30％、荷叶提取物25％、绿茶提取物15％、决明子提取物15％、葡萄籽提取物15％组成。
上述％为质量％。
本发明提供的一种预防肥胖及改善肠道菌群的物质或组合，可以是香水莲花提取物或香水莲花提取物与荷叶提取物、绿茶提取物、决明子提取物、葡萄籽提取物等其中的一种或几种科学配比。
本发明中，可以直接使用香水莲花提取物及其组合物，也可以将该提取物或组合物与其他药学上可接受的辅料混合制成各种剂型。
在本发明中：香水莲花提取物可按照专利《香水莲花或香水莲花制品的用途》(专利号： 201310059820.3)进行制备；其余成分均能通过市购的方式获得，荷叶提取物的荷叶碱含量为2％～4％，绿茶提取物的茶多酚含量为95％～98％，决明子提取物的总蒽醌含量为1％～5％，葡萄籽提取物的原花青素含量为95％～98％。
本发明具有以下技术优势：
香水莲花提取物是一种植物来源、安全有效的天然产物，其富含多酚、黄酮、鞣质、花色苷、生物碱等次生代谢产物。香水莲花提取物单独使用或与其他天然产物复配，能有效抑制胰脂肪酶的活性、控制高脂动物体重、降低血脂、改善肝脏氧化应激、缓解脂肪组织慢性炎症及改善肠道菌群结构。
本发明对香水莲花提取物及其组合物在制胰脂肪酶、预防肥胖及改善肠道菌群方面的作用进行了系统的研究，表明其具有抑制胰脂肪酶活性、预防肥胖、改善肝脏氧化应激、缓解脂肪组织慢性炎症的作用，且能改善高脂膳食动物(例如小鼠)肠道微生物的丰度、多样性及菌群结构。
综上所述，可将该香水莲花提取物单独或者复配制备成保健食品或者药品，用于预防肥胖及改善肠道菌群，在保健食品或药品领域具有广泛的前景。
由于香水莲花提取物的成本较高，本发明将香水莲花提取物与其他提取物复配是为了在降低成本的前提下，仍然保留香水莲花提取物的功效，并且能使其效果更加显著。
研究表明，预防肥胖的机理有很多，比如抑制胰脂肪酶活性、抑制脂肪合成酶的活性、抑制食欲、改善肠道菌群等等。胰脂肪酶抑制剂可以预防肥胖，但具有预防肥胖的物质不一定能抑制胰脂肪酶活性。本发明中香水莲花提取物及其组合物能抑制胰脂肪酶的活性，可以减少膳食脂肪的吸收量，增加膳食脂肪的排出量(通过粪便排出)，因而必然可以起到预防肥胖的作用。
在肠道中，优势菌门为厚壁菌门与拟杆菌门，这两种菌门在肠道微生物中所占的比值与肥胖一定的关系。研究表明，厚壁菌门所占比例越大，拟杆菌门所占比例越小，机体体重越大。此外，一些肠道重要的微生物也与肥胖相关，比如Akk.(Akkermansiamuciniphila)与脱硫弧菌(Desulfovibrio)。研究表明，将Akk.菌移植到肥胖小鼠的肠道内，小鼠的肥胖症状得到改善。脱硫弧菌是革兰氏阴性菌，它能分泌内毒素，使机体产生炎症反应，进而导致机体非正常肥胖。在本发明中，香水莲花提取物及其组合物能减少厚壁菌门微生物的数量，增加拟杆菌门微生物的数量，增加有益菌Akk.菌的数量，减少有害菌脱硫弧菌的数量，引起起到预防肥胖的作用。
降血脂是指减少机体血液中甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白的含量，增加高密度脂蛋白的含量；胰脂肪酶抑制剂，通过抑制生物体内胰脂肪酶的活性，减少机体对饮食中油脂的分解和吸收，达到预防肥胖的作用。一般而言，具有抗氧化作用的天然产物在动物实验中均具有降血脂的作用，但不一定有抑制胰脂肪酶活性。胰脂肪酶抑制剂在动物试验中，可以下调体重，通常同时具有降血脂的作用。本发明中，香水莲花提取物及其组合物能通过抑制胰脂肪酶的活性，减少膳食脂肪被机体吸收，因此同时可以起到降低血脂含量，减少机体体重的作用。
本发明在研究过程中将荷叶提取物、绿茶提取物、决明子提取物、葡萄籽提取物与香水莲花提取物配伍，获得性价比较高的具有抑制胰脂肪酶、预防肥胖、改善肠道菌群功效的组合物。
本发明的香水莲花提取物及其组合物用热水冲泡食用，或添加至其他食物中食用，或灌至空胶囊中食用，每日食用量0.5～2.5g。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
图1为PCR扩增结果鉴定胶图；
M、1、2、3、4、5、CK分别为肠道微生物DNA的泳道代号。其中M为PCR Marker 的泳道代号，1-5分别为正常对照组、模型对照组、阳性对照组、实验组1、实验组2小鼠肠道微生物DNA的泳道代号，CK为空白对照组的泳道代号。
图2为香水莲花提取物及其组合物对高脂膳食小鼠体重的影响对比图；
**代表p<0.01，***代表p<0.001。
图3为香水莲花提取物及其组合物对高脂膳食小鼠肠道微生物的影响图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此。
香水莲花提取物可按照专利《香水莲花或香水莲花制品的用途》(专利号：201310059820.3)进行制备；
即，具体如下，香莲提取物的制备方法为以下任意一种：
A、以香水莲花的鲜花为原料，将香水莲花的鲜花粉碎，加入提取剂回流或超声提取 0.5～3h，减压抽滤，得到香莲提取物溶液；料液比为：2～10mL的提取剂/g的香水莲花的鲜花；
B、以香水莲花的干花为原料，将香水莲花的干花粉碎，加入提取剂回流提取0.5～3h，减压抽滤，得到香莲提取物溶液；料液比为：10～30mL的提取剂/g的香水莲花的干花；
所述提取剂为水、乙醇水溶液或乙醇。
下述％均为重量％，实施例中所述香水莲花提取物总酚含量为32.0％、总黄酮含量为 11.5％，荷叶提取物荷叶碱含量2.0％，绿茶提取物茶多酚含量为98.0％，决明子提取物总蒽醌含量为2.0％，葡萄籽提取物原花青素含量为95.0％。
实施例1
本发明中单独使用香水莲花提取物，具有抑制胰脂肪酶活性、预防肥胖及改善肠道菌群功效。
实施例2
本发明中具有抑制胰脂肪酶活性及预防肥胖功效的组合物配方为：香水莲花提取物65％、绿茶提取物35％。
实施例3
本发明中具有抑制胰脂肪酶活性及预防肥胖功效的组合物配方为：香水莲花提取物65％、荷叶提取物35％。
实施例4
本发明中具有抑制胰脂肪酶活性及预防肥胖功效的组合物配方为：香水莲花提取物50％、荷叶提取物25％、葡萄籽提取物25％。
实施例5
本发明中具有抑制胰脂肪酶活性及预防肥胖功效的组合物配方为：香水莲花提取物50％、决明子提取物15％、葡萄籽提取物35％。
实施例6
本发明中具有抑制胰脂肪酶活性及预防肥胖功效的组合物配方为：香水莲花提取物50％、绿茶提取物35％、荷叶提取物15％。
实施例7
本发明中具有抑制胰脂肪酶活性及预防肥胖功效的组合物配方为：香水莲花提取物35％、荷叶提取物25％、绿茶提取物25％、葡萄籽提取物15％。
实施例8
本发明中具有抑制胰脂肪酶活性、预防肥胖及改善肠道菌群功效的组合物配方为：香水莲花提取物30％、荷叶提取物25％、绿茶提取物15％、决明子提取物15％、葡萄籽提取物15％。
对本发明所得的香水莲花提取物及其组合物进行了如下的检测实验：
实验1、香水莲花提取物对胰脂肪酶活性的抑制作用
1.1实验方法
配制浓度为1μmol/mL、2μmol/mL、3μmol/mL、4μmol/mL、5μmol/mL的油酸/苯溶液，分别取4mL于锥形瓶中，加1mL 5％醋酸铜溶液(用吡啶调节至pH＝6.1)，磁力搅拌3分钟后，离心取上层有机相在710nm下测定吸光度，得脂肪酸吸光度工作曲线y＝0.142x+0.022 (R2＝0.999；式中x为油酸浓度，μmol/mL；y为吸光值)。
取3mL 50mmol/L磷酸盐缓冲液(pH按需配置)和1mL橄榄油于25mL锥形瓶中，预热5分钟。然后向锥形瓶中加入0.1mL 0.20mg/mL胰脂肪酶酶溶液分别与0.5mL浓度为1 mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL的香水莲花提取物，37℃下水浴震荡10min，立即加8mL苯，继续震荡2分钟，终止反应。将溶液转移至离心试管中，在4000r/min下离心10分钟，取上层有机相4mL于锥形瓶中，之后重复上述方法测定有机相在710nm波长下的吸光度。
胰脂肪酶的活性以反应液每分钟每毫升体积释放的油酸分子数(μmol)来表达。
香水莲花提取物对胰脂肪酶活性的抑制率按照以下公式进行计算
抑制率/％＝(U1-U2)/U1×100
式中U1、U2分别代表在不添加香水莲花提取物与添加香水莲花提取物情况下胰脂肪酶的活性。
1.2胰脂肪酶抑制剂胰脂肪酶活性抑制的结果
按照1.1方法测定实施例1～8中不同浓度香水莲花提取物、含香水莲花提取物组合物及奥利司他对胰脂肪酶的抑制作用，测定结果用半抑制浓度(IC50)表示(表1)。当IC50越低，则该抑制剂对胰脂肪酶的抑制作用越强；反之，则越弱。
表1、香水莲花提取物、含香水莲花提取物组合物及奥利司他对胰脂肪酶活性的半抑制浓度 (IC50)
抑制剂 IC<sub>50</sub>(mg/mL)
实施例1 4.02±0.36
实施例2 4.26±0.24
实施例3 4.67±0.41
实施例4 5.03±0.35
实施例5 5.32±0.39
实施例6 4.14±0.31
实施例7 4.18±0.29
实施例8 3.81±0.31
奥利司他 0.21±0.08
结果显示：实施例1～8中的香水莲花提取物及其组合物对胰脂肪酶有较强的抑制作用，其中实施例1、实施例8作用效果较为突出。
实验2、香水莲花提取物及其组合物对小鼠高脂膳食诱导肥胖的预防作用
2.1实验方法
2.1.1动物分组饲养
50只鼠龄为8-9周的C57BL/6雄性小鼠在温度为22±2℃，湿度为30-70％的动物房适应性饲养一周后，随机分为5组，每组10只，其中正常对照组小鼠喂养10kcal％低脂饲料，其余4组小鼠(模型对照组、阳性对照组、实施组1、实验组2)喂养60kcal％高脂饲料。在饲养同时，各组小鼠均采用灌胃方式给予样品，灌胃样品由0.5％羧甲基纤维素钠溶液配置而成，具体饲养与灌胃情况见表2。饲养期间每周称一次体重，实验结束前48小时取新鲜粪便，冷冻保存。8周后各组小鼠禁食12h，称重，摘眼球采血，随即颈椎脱臼处死，取肾周及睾丸周围脂肪、肝脏、脾脏、胰腺，称重记录并冷冻。
表2、小鼠预防肥胖模型的试验分组
Figure GDA0002881919340000091
注：LFD为10kcal％低脂饲料；HFD为60kcal％高脂饲料。
2.1.2指标测定
2.1.2.1血清、粪便中脂类含量的测定
血清中脂类含量的测定：小鼠血液3000r/min离心15分钟，分离血清，按照试剂盒方法测定TG、TC含量。粪便中脂类含量的测定：用氯仿/甲醇溶液(2:1，v/v)充分萃取小鼠粪便中的脂类后，5000r/min离心15分钟，取澄清液，离心浓缩仪蒸发有机试剂，用4倍粪便重量的异丙醇复溶后，按照试剂盒方法测定甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)含量。
2.1.2.2胰腺中胰脂肪酶活性的测定
将胰腺剪碎，加入4倍重量预冷的磷酸缓冲液(0.01mol/L，pH为7.4)，高速匀浆1min， 3000r/min离心20min，取上清液，按照试剂盒方法测定胰脂肪酶的活性。
2.1.2.3肝脏中抗氧化水平的测定
将肝脏剪碎，加入4倍重量预冷的生理盐水，高速匀浆1min，3000r/min离心20min，取上清液，按照试剂盒方法测定谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、蛋白质含量。
2.1.2.4脂肪组织中炎症因子的测定
将附睾脂肪组织剪碎，加入4倍重量预冷的磷酸缓冲液(0.01mol/L，pH为7.4)，高速匀浆1min，5000r/min离心10min，取上清液，按照试剂盒方法测定肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)、单核细胞趋化因子-1(MCP-1)含量。
2.2实验结果
2.2.1香水莲花提取物及其组合物对实验小鼠体重、脏器、摄食的影响
研究表明，高脂膳食会引起机体体重的增加、器官脂肪的积累、摄食量的减少。
香水莲花提取物及其组合物对实验小鼠体重、脏器、摄食量的影响见图2和表3(图2为8周饲养过程中小鼠体重的变化)。在未灌胃之前，各组小鼠的体重无差异，8周后，模型对照组显著高于正常对照组(p<0.05)，说明造模成功。阳性对照组、实验组1、实验组2的小鼠体重显著低于模型对照组(p<0.05)，表明香水莲花提取物及其组合物能有效地控制小鼠的体重，但控制的效果略低于阳性对照组。同时香水莲花提取物及其组合物能显著降低小鼠附睾周围脂肪、肾周围脂肪、肝脏的重量(p<0.05)。此外，与正常对照组相比，高脂饲料会影响小鼠的摄食量(p<0.05)，但其每日能量摄入量却没有显著差异。
表3、香水莲花提取物及其组合物对实验小鼠体重、摄食、脏器的影响
Figure GDA0002881919340000101
注：结果表示为平均值±标准差，n＝10；同一行两两之间若字母完全不同，则两者之间存在显著差异(p<0.05)。
2.2.2香水莲花提取物及其组合物对实验小鼠血清、粪便脂类含量的影响
在体内，摄入的脂类一部分被肠道消化吸收，还有一部分则随着消化道排除体外，而肥胖会导致血脂水平的升高。
香水莲花提取物及其组合物对实验小鼠血清、粪便脂类含量的影响见表4、表5。实验结果表明，香水莲花提取物及其组合物均能显著地降低小鼠血清中TG、TC含量(p<0.05)。此外，香水莲花提取物及其组合物可降低LDL-C含量、提高HDL-C含量，但作用效果不显著。在粪便中，实验组1(香水莲花提取物)、实验组2(含香水莲花提取物的组合物)小鼠粪便脂类含量、TG含量均显著高于模型对照组(p<0.05)，但与阳性对照(奥利司他)组存在显著差异(p<0.05)，而实验组1、实验组2及阳性对照组均不会改变粪便TC的含量。
表4、香水莲花提取物及其组合物对实验小鼠血清中脂类含量的影响
Figure GDA0002881919340000111
注：结果表示为平均值±标准差，n＝10；同一行两两之间若字母完全不同，则两者之间存在显著差异(p<0.05)。
表5、香水莲花提取物及其组合物对实验小鼠粪便中脂类含量的影响
Figure GDA0002881919340000112
注：结果表示为平均值±标准差，n＝10；同一行两两之间若字母完全不同，则两者之间存在显著差异(p<0.05)。
2.2.3香水莲花提取物及其组合物对实验小鼠胰脂肪酶活性的影响
胰脂肪酶由胰腺分泌，它是一种影响膳食脂肪消化吸收的关键酶，其中在膳食脂肪中 50～70％的甘油三酯都由它负责水解。香水莲花提取物及其组合物对实验小鼠胰脂肪酶活性的影响见表6。与正常对照组比较，高脂膳食组(模型对照组、阳性对照组、实验组1、实验组 2)小鼠胰腺中胰脂肪酶活性(p<0.01)极显著增强。而阳性对照组、实验组1、实验组2较模型对照组可极显著降低小鼠胰脂肪酶活性，下降程度分别为41.00％，27.82％、29.70％ (p<0.01)。
表6、香水莲花提取物及其组合物对实验小鼠胰脂肪酶相对活性的影响
Figure GDA0002881919340000121
注：结果表示为平均值±标准差，n＝10；同一行两两之间若字母完全不同，则两者之间存在极显著差异(p<0.01)。
2.2.4香水莲花提取物及其组合物对实验小鼠肝脏抗氧化水平的影响
在正常情况下，人体的抗氧化系统处于平衡状态，各种疾病都会引起机体的氧化水平与抗氧化水平之间的失衡。前人研究表明，肥胖会导致抗氧化水平的降低。
香水莲花提取物及其组合物对实验小鼠肝脏抗氧化水平的影响见表7。模型对照组小鼠肝脏GSH-Px活性、SOD活性均显著低于正常对照组(p<0.05)，MDA含量显著高于正常对照组(p<0.05)。而相比于模型对照组小鼠，香水莲花提取物及其组合物均能显著增强高脂膳食小鼠肝脏SOD活性(p<0.05)，显著降低肝脏MDA含量(p<0.05)，提高肝脏抗氧化能力。然而奥利司他、香水莲花提取物及其组合物对小鼠肝脏GSH-Px活性有增强趋势，但均无显著效果。
表7、香水莲花提取物及其组合物对实验小鼠肝脏抗氧化水平的影响
Figure GDA0002881919340000122
Figure GDA0002881919340000131
注：结果表示为平均值±标准差，n＝10；同一行两两之间若字母完全不同，则两者之间存在显著差异(p<0.05)。
2.2.5香水莲花提取物及其组合物对实验小鼠脂肪组织慢性炎症的影响
脂肪组织是一个能分泌众多脂肪细胞因子的内分泌器官，因此研究脂肪组织中慢性炎症因子的分泌水平能在一定程度上反映出机体慢性炎症的程度。同时，脂肪组织的慢性炎症是联系肥胖与其他疾病(如二型糖尿病、动脉粥样硬化、脂肪肝等)的关键因素。肥胖能提高脂肪组织促炎症因子的分泌水平，如TNF-α、IL-6、MCP-1，而这些促炎症因子能导致器官非正常的脂肪积累，如肝脏、骨骼肌、胰腺等，最终影响这些器官的正常运作。
脂肪组织是一个能分泌众多脂肪细胞因子的内分泌器官，因此研究脂肪组织中慢性炎症因子的分泌水平能在一定程度上反映出机体慢性炎症的程度。香水莲花提取物及其组合物对实验小鼠脂肪组织慢性炎症水平的影响见表8。由表可知，高脂膳食会导致小鼠脂肪组织炎症因子TNF-α、IL-6、MCP-1含量的显著增加(p<0.01)，而相比于模型对照组，奥利司他、香水莲花提取物及其组合物均能极显著地降低上述炎症因子水平(p<0.01)。实验条件下香水莲花提取物及其组合物的作用与奥利司他的作用效果相当。
表8、香水莲花提取物及其组合物对实验小鼠脂肪组织炎症水平的影响
Figure GDA0002881919340000132
注：结果表示为平均值±标准差，n＝10；同一行两两之间若字母完全不同，则两者之间存在极显著差异(p<0.01)。
实验3、香水莲花提取物对高脂膳食小鼠肠道菌群的影响
3.1实验方法
3.3.1实验动物肠道内容物取样
按照2.1.1方法饲养实验小鼠，在第8周将其颈椎脱臼处死，每组随机取5只，开腹取结肠内容物混合于保存管中，于-80℃冰箱中冷冻保存。
3.3.2Illumina PE250测序
Illumina PE250测序的实验流程为基因组DNA提取、设计并合成引物接头、PCR扩增、 PCR产物定量和均一化、Illumina PE250文库制备、Illumina PE250高通量测序。
3.3.2.1肠道微生物DNA提取
取混合均匀的粪便，使用粪便DNA提取试剂盒，按照说明书方法进行粪便DNA提取。DNA提取步骤为细胞壁与细胞膜的裂解、蛋白质等杂质的去除、DNA的沉淀与纯化。
3.3.2.2引物设计与PCR扩增
引物设计如表9所示。
表9、PCR扩增引物的设计
Figure GDA0002881919340000141
PCR采用TransStart Fastpfu DNA Polymerase，20μl反应体系：5×FastPfuBuffer 4μl，2.5 mM dNTPs 2μl，Forward Primer(5μM)0.8μl，Reverse Primer(5μM)0.8μl，FastPfu Polymerase 0.4μl，Template DNA 10ng，添加ddH2O至20μl。PCR反应参数如下：
a.1×(5minutes at 95℃)；
b.27×(30seconds at 95℃，30seconds at 55℃，45seconds at 72℃)；
c.10minutes at 72℃，10℃until halted by user。
全部样本按照以上实验条件进行，每个样本3个重复，将同一样本的PCR产物混合后用 2％琼脂糖凝胶电泳检测，使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒切胶回收PCR产物，Tris-HCl 洗脱，2％琼脂糖电泳检测。参照电泳初步定量结果，将PCR产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统进行检测定量，之后按照每个样本的测序量要求，进行相应比例的混合。
3.3.2.3 Illumina PE250文库构建
Illumina PE250文库构建的步骤包括1)连接“Y”字形接头；2)使用磁珠筛选去除接头自连片段；3)利用PCR扩增进行文库模板的富集；4)氢氧化钠变性，产生单链DNA片段。
3.3.2.4 Illumina PE250测序
Illumina PE250测序的步骤包括(1)DNA片段的一端与引物碱基互补，固定在芯片上； (2)另一端随机与附近的另外一个引物互补，也被固定住，形成“桥(bridge)”；(3)PCR扩增，产生DNA簇；(4)DNA扩增子线性化成为单链；(5)加入改造过的DNA聚合酶和带有4种荧光标记的dNTP，每次循环只合成一个碱基；(6)用激光扫描反应板表面，读取每条模板序列第一轮反应所聚合上去的核苷酸种类；(7)将“荧光基团”和“终止基团”化学切割，恢复3’端粘性，继续聚合第二个核苷酸；(8)统计每轮收集到的荧光信号结果，获知模板DNA片段的序列。
3.2实验结果
3.2.1 PCR扩增结果
小鼠肠道微生物DNA的PCR扩增结果鉴定图见图1，结果表明PCR产物目的条带大小正确，浓度合适，可进行后续实验。
3.2.2香水莲花提取物及其组合物对肠道微生物多样性的影响
样本多样性分析(Alpha-diversity)可以反映肠道微生物的丰度与多样性。其中OTU (Operational Taxonomic Units，操作分类单位)是在系统发生学或群体遗传学中，人们根据某一个分类水平设置的标志，在本实验中把有效序列相似性在97％以上的归为1个OTU； Chao与Ace是反映肠道微生物丰度的指数，Chao值与Ace值越大，说明肠道微生物丰度越高；Shannon(香农指数)与Simpson(辛普森指数)是反映肠道微生物多样性的指数，Shannon 数值越大，说明肠道微生物多样性越高，而Simpson数值越大，说明肠道微生物多样性越低； Coverage(测序覆盖度)则是反映测序深度的指数，其数值越大，说明越能反映肠道微生物的真实情况。
高脂膳食小鼠在食用香水莲花提取物及其组合物后肠道微生物丰度与多样性的变化情况见表10。在本次实验中，各组Coverage值均大于0.99，表示本次实验能反映小鼠肠道微生物的真实情况。由Ace值与Chao值可知，高脂膳食会导致小鼠肠道微生物丰度降低，而香水莲花提取物及其组合物均使高脂膳食小鼠肠道微生物丰度升高。由Shannon值与Simpson 值可知，高脂膳食会导致小鼠肠道微生物多样性减少，而香水莲花提取物及其组合物均使高脂膳食小鼠肠道微生物多样性增加。此外，Orlistat虽能使高脂膳食小鼠体重下降，却严重导致高脂膳食小鼠肠道微生物丰度与多样性的降低。
表10、肠道微生物多样性指数
Figure GDA0002881919340000151
Figure GDA0002881919340000161
3.2.3香水莲花提取物及其组合物对肠道微生物菌群结构组成的影响
厚壁菌门(Firmicutes)与拟杆菌门(Bacteroidetes)的比值(F/B值)与肥胖有着密切的关系，F/B值与个体体重呈正相关。肠道内各菌门在肠道微生物中所占比例以及厚壁菌门与拟杆菌门比值(F/B值)的变化情况见表11、图3。从菌群结构中可知，每组小鼠肠道内包含的主要肠道微生物菌门均为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、变形菌门 (Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、脱铁杆菌门(Deferribacteres)和疣微菌门 (Verrucomicrobia)，其中优势菌群均为Firmicutes与Bacteroidetes，这与前人报道一致。然而五组小鼠肠道微生物菌群在门分类水平上的比例分布有较大的差异。相比于正常对照组，高脂膳食能使F/B值增加6倍。而相对模型性对照组，香水莲花提取物及其组合物能减小F/B 值。因此，推测香水莲花提取物及其组合物能通过调节肠道微生物菌群结构来起到减肥降脂作用。
此外，西药奥利司他严重扰乱了小鼠肠道微生物菌群结构，它导致阳性对照组小鼠肠道内放线菌门微生物数量猛增，其比例高达11.00％(正常对照组为2.75％)；变形菌门微生物数量提高，可达到4.49％(正常对照组为0.54％)。前人研究表明克罗恩病和溃疡性结肠炎等肠道疾病患者微生物多样性降低，放线菌门与变形菌门微生物增多。虽然在抑制胰脂肪酶活性与控制体重方面，奥利司他的作用效果强于香水莲花提取物及其组合物，但是奥利司他却严重降低机体肠道菌群的丰度、多样性以及紊乱肠道菌群结构，进而使机体产生胃肠道疾病。因此香水莲花提取物及其组合物的安全性远高于西药奥利司他。
表11、香水莲花提取物及其组合物对肠道微生物菌群分布(门分类水平)的影响
Figure GDA0002881919340000162
Figure GDA0002881919340000171
天然产物能通过改变肠道微生物的菌群构成(包括肠道有益菌与肠道有害菌)对健康产生积极作用。香水莲花提取物及其组合物对几种常见肠道有益菌及有害菌的影响见表12，其中乳酸杆菌(Lactobacillus)、双歧杆菌(Bifidobacterium)、Akk.(Akkermansiamuciniphila)是肠道益生菌，脱硫弧菌(Desulfovibrio)是肠道有害菌。乳酸杆菌(Lactobacillus)是肠道益生菌，因能发酵糖产生大量乳酸得名，它能通过释放抗菌物质(乳酸、过氧化氢、细菌素)，竞争黏附位点、竞争营养物质，诱导黏液素分泌、保护上皮细胞，调控肠道免疫功能来改善宿主健康。双歧杆菌(Bifidobacterium)是人体肠道内重要的益生菌，它不产生内毒素、治病物质以及有害气体，具有调节肠道菌群、降低胆固醇、抗肿瘤、延迟集体衰老等作用。Akkermansia muciniphila是肠道益生菌，它寄居在宿主肠道粘液层并能降解黏蛋白。前人研究发现该菌能使肥胖小鼠在不改变膳食的前提下，改善小鼠代谢紊乱状况，包括减少脂肪量，代谢内毒素及改善脂肪组织炎症与胰岛素抵抗等。脱硫弧菌(Desulfovibrio)是肠道有害菌，它能在宿主体内代谢硫酸盐产生硫化氢，过量的硫化氢会使肠上皮粘膜受到损害，且它能产生内毒素造成机体炎症反应，而机体炎症与肥胖有极大的相关性。
相对于正常对照组，高脂膳食导致小鼠肠道乳酸杆菌、双歧杆菌数量减少，Akk.菌无法检出，脱硫弧菌数量增多。而相对于模型对照组，香水莲花提取物及其组合物能提高高脂膳食小鼠肠道内乳酸杆菌、Akk.菌数量，减少脱硫弧菌数量，但对双歧杆菌数量作用不大。
表12、香水莲花提取物及其组合物对几种常见肠道有益菌及有害菌的影响
Figure GDA0002881919340000172
结论：香水莲花提取物及其组合物具有抑制胰脂肪酶、预防肥胖、改善肝脏氧化应激、缓解脂肪组织慢性炎症的作用，且能改善高脂膳食小鼠肠道微生物的丰度、多样性及菌群结构，而此处香水莲花提取物抑制胰脂肪酶活性功效、改善肠道菌群功效与它的预防肥胖功效有一定的关系。
实验4、
将如下表13所述配方的组合物设置成相应的实验组，按照上述实验2、实验3所述方法进行实验。
表13、香水莲花提取物组合物配方
Figure GDA0002881919340000181
主要实验性能数据如表14、表15、表16所显示。结果表明，香水莲花组合物A、B、 C、D均能表现出控制体重增长、抑制胰腺中胰脂肪酶活性、改善肠道菌群的功效，但作用效果不如实施例8的配方(香水莲花提取物30％、荷叶提取物25％、绿茶提取物15％、决明子提取物15％、葡萄籽提取物15％)。
表14、香水莲花提取物组合物对实验小鼠体重的影响
指标 A B C D
初体重(g) 21.65±0.63<sup>a</sup> 21.24±0.46<sup>a</sup> 22.01±0.44<sup>a</sup> 21.73±0.64<sup>a</sup>
终体重(g) 40.68±1.49<sup>b</sup> 37.82±1.68<sup>a</sup> 38.71±1.03<sup>ab</sup> 37.91±1.72<sup>a</sup>
注：结果表示为平均值±标准差，n＝10；同一行两两之间若字母完全不同，则两者之间存在显著差异(p<0.05)。
表15、香水莲花提取物组合物对实验小鼠胰脂肪酶相对活性的影响
Figure GDA0002881919340000182
注：结果表示为平均值±标准差，n＝10；同一行两两之间若字母完全不同，则两者之间存在显著差异(p<0.05)。
表16、香水莲花提取物组合物对肠道微生物菌群F/B的影响
指标 A B C D
F/B 1.23 0.86 0.89 0.75
最后，还需要注意的是，以上列举的仅是发明的若干个具体实施例。显然，发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。领域的普通技术人员能从发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是发明的保护范围。
<110> 浙江芸麒龙祥生物技术有限公司
<120> 香水莲花提取物及其组合物在预防肥胖、改善肠道菌群方面的用途
<160> 1
<210> 1
<211> 16
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物515F
<400> 1
gtgccagcmg ccgcgg 16

Claims (4)

1.香水莲花提取物的用途，其特征是：用于制备预防肥胖或减肥的保健食品、药品；
所述预防肥胖或减肥包括抑制胰脂肪酶活性、改善体重以及改善肠道菌群；
香水莲花提取物的制备方法为以下任意一种：
A、以香水莲花的鲜花为原料，将香水莲花的鲜花粉碎，加入提取剂回流或超声提取0.5~3h，减压抽滤，得到香水莲花提取物溶液；料液比为：2~10mL的提取剂/g的香水莲花的鲜花；
B、以香水莲花的干花为原料，将香水莲花的干花粉碎，加入提取剂回流提取0.5~3h，减压抽滤，得到香水莲花提取物溶液；料液比为：10~30mL的提取剂/g的香水莲花的干花；
所述提取剂为水、乙醇水溶液或乙醇。
2.根据权利要求1所述的香水莲花提取物的用途，其特征是：所述改善肠道菌群包括增加肠道微生物丰度、多样性、改善肠道菌群结构。
3.香水莲花提取物组合物的用途，其特征是：用于制备预防肥胖或减肥降脂的保健食品、药品；
所述预防肥胖或减肥降脂包括抑制胰脂肪酶活性、改善体重、调节血脂以及改善肠道菌群；
香水莲花提取物组合物由香水莲花提取物30%、荷叶提取物25%、绿茶提取物15%、决明子提取物15%、葡萄籽提取物15%组成；
香水莲花提取物的制备方法为以下任意一种：
A、以香水莲花的鲜花为原料，将香水莲花的鲜花粉碎，加入提取剂回流或超声提取0.5~3h，减压抽滤，得到香水莲花提取物溶液；料液比为：2~10mL的提取剂/g的香水莲花的鲜花；
B、以香水莲花的干花为原料，将香水莲花的干花粉碎，加入提取剂回流提取0.5~3h，减压抽滤，得到香水莲花提取物溶液；料液比为：10~30mL的提取剂/g的香水莲花的干花；
所述提取剂为水、乙醇水溶液或乙醇。
4.根据权利要求3所述的香水莲花提取物组合物的用途，其特征是：所述改善肠道菌群包括增加肠道微生物丰度、多样性、改善肠道菌群结构。
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