KR102175114B1 - 락토바실러스 플란타럼 cjlp475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 cjlp17 균주를 포함하는 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

락토바실러스 플란타럼 cjlp475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 cjlp17 균주를 포함하는 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 출원은 기탁번호 KCCM12287P로 기탁된 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) CJLP475 균주; 및 기탁번호 KCCM12249P로 기탁된 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) CJLP17 균주; 를 포함하는 조성물 및 이의 용도에 관한 것이다. .

Description

락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주를 포함하는 조성물 및 이의 용도{COMPOSITION COMPRISING LACTOBACILLUS PLANTARUM CJLP475 STRAIN AND LACTOBACILLUS PLANTARUM CJLP17 STRAIN AND USE THEREOF}
본 출원은 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) CJLP475 균주; 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주;를 포함하는 내산성, 내담즙성, 항 바이러스성 및 면역증강 활성을 갖는, 조성물에 관한 것이다.
현재 축산업계에서는 전염성이 높은 바이러스성 질환으로 인해 가축들이 폐사하고, 이로 인한 농가의 경제적 피해가 발생하는 경우가 많다. 특히 양돈 산업에서 4대 만성 소모성 질환인 돼지호흡기복합증후군(porcine respiratory disease complex), 이유후 전신소모성 증후군(Postweaning multisystemic wasting syndrome), 돼지 생식기 호흡기 증후군(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome), 및 돼지 유행성 설사병(Porcine epidemic diarrhea)과 같이, 바이러스와 세균에 의한 감염성 질환들에 의해 막대한 경제적 손실이 초래되고 있는 상황이다.
이 중 돼지 유행성 설사병은 코로나바이러스과(corona virus family)에 속하는 돼지유행성설사바이러스(porcine epidemic diarrhea virus, PEDV)의 감염에 의해 발생하는 돼지 소화기성 질병이다. 상기 바이러스는 소장과 대장의 융모세포에서 증식하며 모든 일령의 돼지, 특히 자돈에서 급성 장염, 구토, 수양성 설사를 유발한다. 특히 11 월부터 4 월까지, 주로 동절기에 피해가 심각한데, 생후 1 주령 이내의 포유자돈 폐사율은 약 50 % 수준으로 나타나며, 심할 경우에는 극심한 탈수로 인해 폐사율이 거의 100 %까지 나타나는 것으로 알려져 있다.
PED 바이러스는 1971년 유럽에서 처음 관찰되었으며, 1976년 벨기에에서 G1a type PEDV CV777이 추가적으로 검출 및 분리되었고, 80년대 유럽에서 유행 하다가 90년대 중국, 한국, 일본, 대만 등 동아시아 지역에서 발생 하였다. 또한, 상기 G1a type보다 병원성이 높은 G2b type PEDV가 2010년 중국을 시작으로 발생하였다. 상기 신종 type의 PEDV는 북미지역(미국, 캐나다)뿐만 아니라 동남아시아, 유럽까지 발병하여 큰 피해를 입히고 있다. 2013년 기준으로 미국 양돈산업에서 생산성 손실로 인해 한화 약 2조 2,000억원의 피해가 발생하였으며, 우리나라에서는 현재 연간 20~40%의 농가에서 매년 발생되어, 이로 인해 전체 자돈의 6%가 폐사되는 것으로 보고 되고 있다. 또한, 도축장 출입 차량의 감염율이 약 60%에 달하는 것으로 보고되고 있다 (한국농촌경제연구원, 한국양돈수의사협회).
현재까지 G2b type PED 바이러스에 대한 근본적인 예방은, 철저하게 소독하는 방법이 유일하다. 많은 농장에서 바이러스 질환에 따른 피해를 예방하기 위해 인공감염법을 이용하거나 기존 G1a type PEDV 백신을 접종하고 있으나, G2b type PEDV 감염을 예방하는 데에 한계를 가지고 있다. 또한 신규 개발된 G2b type PEDV 사독 백신도 접종되고 있으나, 생독 백신이 개발되지 않고 사독백신만으로 접종하고 있어 소화기 질병 예방에 대한 사독 백신의 한계를 보이는 등 PEDV 예방대책으로써 여러 문제점들을 가지고 있다. 이러한 문제를 보완하기 위해 PED 바이러스 예방(백신 등) 및 치료(IgY, 정유(Essential oil), 유기산, 프로바이오틱스 등)용 제제의 개발이 활발하게 이루어지고 있으며, 근래에는 특히 항바이러스 효과를 가지면서 생체 내 면역계를 자극하는 기능성 소재를 이용하여 면역을 증진시키는 방법이 연구되고 있다.
면역은 일반적으로 선천성면역(Innate immunity)과 후천성면역(Adaptive immunity)으로 나눌 수 있다. 선천성면역은 병원체 감염을 제 1선에서 즉각적으로 방어하는 체계로, 직접적인 침입인자(항원)에 작용하거나 후천성 면역을 유도한다. 후천성 면역은 보다 더 복잡하고 정밀한 체계로 침입인자를 인지하여 제거하거나, 해당 침입인자에 대한 기억 등의 작용을 하여 선천성면역에 비해 더욱 영구적인 면역 작용을 한다. 선천성면역과 관련된 항원제시세포(Antigen-presenting cells)인 수지상세포 (Dendritic cells, DCs), 대식세포(Macrophages), 자연살해세포(natural killer cells) 등이 직접적인 선천성 면역작용을 하고, 여러 종류의 T세포 활성을 돕는 수용체를 가지고 있으며, 이를통해 사이토카인(cytokines)을 분비한다. 후천성면역은 체내에 침입한 항원에 대한 2차 방어체계로, B림프구, T림프구에 의해 나타나는 특이적 면역반응이다. 항원에 의해 활성화된 T세포의 면역반응은 세포독성 T 세포 반응(Cytotoxic T cell), 도움 T 세포(Helper T cell, Th) 반응 등이 있다. 선천면역에 관계된 수지상세포, 대식세포, 자연살해세포등에서도 외부 침입물질을 인지하여 IL-12나 IL-4 등과 같은 여러 종류의 cytokine들을 분비하여 숙주 동물의 면역을 적절하게 변화시켜 주는 반응을 유도하여 면역 방어기작을 적합한 방향으로 나타내기도 한다. T세포의 전구체 역할을 하는 Na
Figure 112019071781615-pat00001
ive CD4 T 세포는 핵심적인 사이토카인에 의해 분화가 결정되는데, 고농도의 IL-12(interleukin-12) 존재 시 Th1(T helper 1) 세포분화를 촉진시켜서 세포 내 침입물질(intracellular pathogen)을 퇴치하는 CTL(Cytotoxic T lymphocyte) 반응을 유도한다. IL-4(interleukin-4)가 고농도이면 세포 밖 침입물질을 특이적으로 퇴치하는(B 세포의 항체분비) 반응을 유도하게 된다. 또한, 상기에 열거된 면역세포들은 염증반응 같은 과도한 면역반응을 억제하기 위해 TGF-beta(Beta transforming growth factor)과 IL-10을 분비하거나, 과도한 면역 반응을 억제하기 위하여 TGF-beta를 분비하여 이를 통한 regulatory T 세포를 활성시켜 주기도하고, TGF-beta와 IL-6(interleukin-6) 등의 분비로 B 세포를 플라즈마 세포로 변형시켜 항체 생성을 촉진하거나, 잘못된 자가면역과 세포 밖 침입물질들을 퇴치하는 면역 반응(Th17)을 유도하는 등, 정교하고 복잡한 과정을 거쳐 체내로 침입한 인자들에 대해 적절한 방식으로 대응한다. 그러나, 때때로 이와 같은 면역반응은 균형이 불균형해지거나 미흡한 면역반응으로 인해 추가적이고 적절한 면역 증강제를 필요로 한다.
본 발명자들은 상기와 같은 바이러스에 억제 활성을 나타내면서도 면역계를 활성화 할 수 있는 미생물을 분리 및 동정하여 이의 활성을 확인함으로써 본 출원을 완성하였다.
삭제
대한민국 공개특허공보 제10-2012-0064416호 대한민국 공개특허공보 제10-2003-0063961호
본 출원의 하나의 목적은, (a) 기탁번호 KCCM12287P로 기탁된 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) CJLP475 균주; 및 (b) 기탁번호 KCCM12249P로 기탁된 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) CJLP17 균주; 를 포함하는, 조성물을 제공하는 것이다.
본 출원의 하나의 구현예에 따르면 상기 (a) 및 (b)는 균주, 이의 파쇄물, 이의 배양액, 이의 농축액 또는 이의 건조물 형태일 수 있다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은, 상기 조성물을 포함하는, 사료 또는 사료 첨가제를 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은, 상기 조성물을 포함하는, 식품을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은, 상기 조성물을 포함하는, 화장품을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은, 상기 조성물을 포함하는, 의약품을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은, 상기 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 면역증강 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은, 상기 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 바이러스 감염질환의 예방 또는 치료 방법을 제공하는 것이다.
본 출원의 또 다른 하나의 목적은, 상기 조성물의 바이러스 감염 질환의 예방 또는 치료 용도를 제공한다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 출원에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 출원에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 출원의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 출원의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 출원의 하나의 양태는 (a) 기탁번호 KCCM12287P로 기탁된 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) CJLP475 균주; 및 (b) 기탁번호 KCCM12249P로 기탁된 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) CJLP17 균주; 를 포함하는, 조성물을 제공한다.
구체적으로, 상기 조성물은 항 바이러스 성, 내산성, 내담즙성 및 면역증강 활성을 갖는 것일 수 있다.
본 출원에서 용어 "락토바실러스(Lactobacillus)"는 자연계에 널리 분포하는 호기성, 또는 통성 혐기성의 그람양성 간균 속 미생물이다. 락토바실러스 속에 속하는 미생물에는 락토바실러스 플란타럼 등이 있다. 본 발명자들은 락토바실러스 플란타럼에 속하는 신규한 균주를 각각 기탁번호 KCCM12287P 및 기탁번호 KCCM12249P로 기탁하여 제공하며, 이들은 각각 "락토바실러스 플란타럼 CJLP475" 및 "락토바실러스 플란타럼 CJLP17"로 명명된다. 이들은 프로바이오틱스 균주에 해당하며, 인체에 무해하며, 부작용 없이 사용될 수 있다.
본 출원에서 용어 "프로바이오틱스"는 체내에 들어가서 건강에 좋은 효과를 주는 살아있는 균을 말한다. 현재까지 알려진 대부분의 프로바이오틱스는 락토바실러스 등의 유산균을 이용하여 만들어진 발효유 제품으로 섭취되어 왔으나 최근에는 락토바실러스 이외에 비피도박테리움, 엔티로코커스와 같은 일부 균주 등을 포함한 발효유, 과립, 분말 등의 형태로 판매되고 있다. 본 출원의 상기 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 역시 발효유, 과립, 분말 등의 형태로 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 출원에서 용어 "내산성"은 높은 산도에 견디는 성질을 말한다. 프로바이오틱스가 내산성을 가질 경우, 경구 등을 포함한 다양한 투여 경로를 통해 섭취되어 위장 내 강한 산성 조건에 노출되더라도 분해되거나 손상되는 경우를 방지할 수 있다.
본 출원에서 용어 "내담즙성"은 담즙 내 소화 효소에 대한 저항성을 말한다. 담즙은 간에서 만들어져서 쓸개에 저장되었다가 작은창자 내부의 샘창자에서 지방의 소화작용을 돕는 약 알칼리성의 녹갈색 액체로, 지방질을 유화하여 소화, 흡수를 돕는다. 이러한 담즙은 경구 등을 포함한 다양한 경로를 통해 섭취된 프로바이오틱스에 대해서도 작용함에 따라 프로바이오틱스 투여 효과를 감소시키는 주요 원인 중 하나에 해당한다.
구체적으로 본 출원의 조성물 중, 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주는 전통 발효 식품인 간장으로부터 분리 되었고, 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주는 돼지 유행성 설사 바이러스가 발생한 국내 농장의 모돈, 자돈의 분변 및 초유로부터 분리하여 얻은 것이다. 상기 각 균주의 형태학적 특징은 그람 양성 간균이고, 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주는 서열번호 1의 16s rDNA 염기서열을 가지며, 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주는 서열번호 2의 16s rDNA 염기서열을 가진다. 상기 염기서열을 분석한 결과 각각 락토바실러스 플란타럼과 약 99% 상동성을 가지고 있었다.　이에 본 발명자들은 신규 분리한 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주를 2018년 4월 13일 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국 미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 기탁번호 KCCM12249P로 기탁하였고, 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주를 2018년 07월 11일 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국 미생물보존센터(Korean Culture Center of Microorganisms)에 기탁번호 KCCM12287P로 기탁하였다.
본 출원의 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주와 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주를 장기간 안정적으로 보존하기 위하여, 물에 글리세롤 성분을 일정량 혼합하여 만든 보관용액에 균주를 풀어 -70 ℃에서 보관하거나 멸균된 10 % 탈지유에 현탁하여　동결건조 할 수 있으나, 이에 제한되지 않으며 다양한 공지의 방법에 의해 장기 보존형태가 될 수 있다.
본 출원의 조성물은 적혈구에 대한 용혈성을 나타내지 않는 것일 수 있다. 용혈이란 적혈구가 파괴되어 헤모글로빈이 외부로 유출하는 것을 말하며 생체내 유해균으로부터 생산된 효소에 의해 적혈구가 용혈되는 작용이다. 따라서, 상기 조성물이 생체 내에 투여되더라도, 혈관 내에서 용혈현상을 유발하지 않을 수 있다.
또한, 본 출원의 조성물은 항생제에 대한 내성이 약하거나 없는 것 일 수 있다. 상기 항생제는 구체적으로 암피실린, 클린다마이신, 겐타마이신, 카나마이신, 에리트로마이신, 암피실린/설박탐, 클로람페니콜 또는 스트렙토마이신일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 따라서, 상기 조성물을 의약품, 건강기능식품, 사료 첨가제 등으로 사용하더라도, 항생제에 대한 내성이 없으므로, 그에 따른 약리 효과나 환경적 문제가 발생할 가능성이 낮다.
상기 조성물은 면역세포의 활성화를 촉진하여 사이토카인의 분비량을 증가시키거나, 생체 내에 투여되어 면역기능을 촉진하는 것일 수 있다.
상기 "면역 세포"란 생체 내 면역 기능에 관여하는 모든 세포를 의미하며, 크게 T 세포와 B 세포로 나눌 수 있다. 상기 면역세포에는 Th1 또는 Th2 세포가 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 출원의 상기 조성물은 면역 세포를 자극하여 IL-12, IL-10 또는 TGF-beta와 같은 사이토카인의 분비량을 증가시키는 활성을 가질 수 있다.
일반적으로 높은 폐사율을 보이는 바이러스성 질병에서는, 바이러스에 의한 세포나 조직 자체의 괴사로 인하여, 다른 균주의 2차 감염 및 패혈증, 과도하게 활성화된 면역 반응으로 야기된 염증질환, 또는 식욕저감 및 탈수증이 발생하고 있다. 따라서 바이러스 감염을 억제하는 항바이러스 효능(Th1, Th2 관련)과, 2차 감염과 과도한 염증반응을 조절해 주는 면역 반응(Th2, Antiinflammation)이 동시에 증강될 경우, 효과적인 바이러스성 질병의 예방 및 치료효과를 이끌어낼 수 있다. 이처럼 프로바이오틱스를 통한 면역증강 효능에 있어서 Th1과 Th2를 동시에 증강시키는 방법은 공지되어 있지 않으며, 본 발명자에 의해 새롭게 규명되었다. 아울러, 본 출원의 조성물은 Th1/Th2의 불균형을 조절하는 면역조절력이 있다.
본 출원에서 용어 "사이토카인"은 신체 방어체계를 제어하고 자극하는 신호 물질로 사용되는 당단백질을 의미하며, 예시적으로 IL-12, IL-10 또는 TGF-beta 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 조성물은 개체에 투여 시 개체의 성장을 촉진하거나, 설사 발생율을 감소시키는 것일 수 있다.
본 출원에서 용어 "개체"는 면역이 약화되거나 약화될 가능성이 있는 인간을 포함하는 모든 동물을 의미할 수 있다. 예를 들어, 상기 개체는 인간을 제외한 동물 또는 인간을 포함한 동물을 포함할 수 있다. 상기 동물은 인간뿐만 아니라 상기 효능의 발휘가 필요한 모든 동물을 포함할 수 있으며, 구체적으로 소, 말, 양, 돼지, 염소, 낙타, 영양, 개, 고양이 등의 포유동물일 수 있고, 다른 예시로 가축 또는 애완동물일 수 있다.
상기 투여 방법은 특별히 한정되는 것은 아니나, 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 그 예로 경구 투여일 수 있다.
상기 조성물은 체내의 항체를 증가시키는 것일 수 있다. 이와 같은 면역기능에 관여하는 항체의 분비량을 증가시켜 개체의 면역력을 향상시킬 수 있다. 상기 조성물은 개체에 투여될 수 있으며, 투여 방법은 특별히 한정되는 것은 아니나, 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다. 그 예로 경구 투여일 수 있다. 상기 체내는 혈액 또는 초유 등의 체액일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 항체는 IgG, IgA 또는 중화항체일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 조성물은 개체에 투여 시, 모체이행 항체를 통해, 그 개체로부터 태어난 자녀 개체의 면역력을 향상시키는 것 일 수 있다. 상기의 면역력 향상은 항체 또는 사이토카인 분비량을 증가시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 조성물은 개체에 투여 시, 그 개체로부터 태어난 자녀 개체의 바이러스 감염 증상을 완화시키는 것일 수 있다. 상기 바이러스는 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)일 수 있으나, 본 출원의 조성물에 의해 감염이 억제되는 바이러스는 제한 없이 포함된다. 상기 증상 완화는 소화장기 상태 완화, 정상체온 유지, 설사 감소, 생존율 증가 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 조성물은 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)에 대한 항바이러스 활성을 갖는 것일 수 있다.
본 출원에서 용어 "항 바이러스"는 바이러스 감염을 억제하는 성질을 말한다. 프로바이오틱스는 자체적으로 바이러스를 불활화 시킬 수는 없지만 면역활성을 통하여 바이러스에 감염된 개체의 면역력을 높여 바이러스 감염에 저항할 수 있게 한다.
상기 돼지 유행성 설사 바이러스는 돼지의 소장 세포를 감염시키는 코로나 바이러스로서 심한 설사 및 탈수증이 유발되는 돼지 유행성 설사병을 유발하는 바이러스로, 본 출원의 조성물에 의해 감염이 억제되는 바이러스는 제한 없이 포함된다.
본 출원의 조성물 중, 상기 (a) 및 (b)에 해당하는 각각의 균주는 균주 그 자체, 이의 파쇄물, 이의 배양액물, 이의 농축액 또는 이의 건조물의 형태일 수 있다. 이를 개체에 처리할 경우, 상기 돼지 유행성 설사 바이러스의 활성 및 감염이 현저하게 억제될 수 있으므로, 상기 조성물은 돼지 유행성 설사 바이러스에 대한 항바이러스용 조성물, 돼지 유행성 설사병의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 예방 또는 개선용 기능성식품, 의약외품, 또는 사료 조성물로 활용될 수 있다.
본 출원의 일 구현예에 따르면, 본 출원의 조성물 중, 상기 (a) 및 (b)는 균주, 이의 파쇄물, 이의 배양액, 이의 농축액 또는 이의 건조물의 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 조성물에 관한 보다 상세한 사항은 전술된 내용을 참조할 수 있다.
본 출원의 상기 균주들은 통상적인 락토바실러스 균주의 배양방법을 통해 배양할 수 있다. 배지로는 천연배지 또는 합성배지를 사용할 수 있다. 배지의 탄소원으로는 예를 들어, 글루코오스, 수크로오스, 덱스트린, 글리세롤, 녹말 등이 사용될 수 있고, 질소원으로는 펩톤, 육류 추출물, 효모 추출물, 건조된 효모, 대두, 암모늄염, 나이트레이트 및 기타 유기 또는 무기 질소 함유 화합물이 사용될 수 있으나, 이러한 성분에 한정되는 것은 아니다. 배지에 포함되는 무기염으로는 마그네슘. 망간, 칼슘. 철, 칼륨 등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 상기 탄소원, 질소원 및 무기염의 성분 이외에 아미노산, 비타민, 핵산 및 그와 관련된 화합물들이 배지에 첨가될 수 있다. 본 출원의 조성물의 배양온도 조건은 20~40 ℃의 온도 범위에서 12 시간에서 4 일간 배양할 수 있다.
본 출원에서, 상기 배양액은 배양이 완료된 이후의 조성물을 지칭하는 것일 수 있으며, 보다 구체적으로, 상기 배양액은 균체를 포함하거나, 포함하지 않을 수 있다. 따라서 상기 배양액은 배양 상등액, 배양 상등액이 제거된 조성물, 또는 이들을 농축한 조성물울 포함할 수 있다. 상기 배양액의 조성은 통상의 락토바실러스 배양에 필요한 성분뿐 아니라, 락토바실러스의 생장에 상승적으로 작용하는 성분을 추가적으로 포함할 수 있으며, 이에 따른 조성은 당업계의 통상의 기술을 가진 자에 의하여 용이하게 선택될 수 있다.
또한,　균주의 상태는 액상상태 또는 건조상태일 수 있으며, 건조방법은 통풍건조, 자연건조, 분무건조 및　동결건조가 가능하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 조성물은 (a) 기탁번호 KCCM12287P로 기탁된 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주; 및 (b) 기탁번호 KCCM12249P로 기탁된 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주를 동시에 포함하는 것을 특징으로 하는, 2 종 균주 복합제제 일 수 있다. 상기 조성물은 이에 따라, 상기 (a) 및 (b)에 해당하는 2 종의 균주 그 자체, 이의 파쇄물, 이의 배양액, 이의 농축액 또는 이의 건조물 만으로 구성된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 이 경우 상기 (a) 및 (b)에 해당하는 2 종의 균주는 조성물 내에서 각각 동일한 형태일 필요는 없으며, 필요에 따라 (a)는 균주 그 자체 및 (b)는 균주의 파쇄물 등의 형태로, 각각의 형태의 조합일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 조성물에서 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주의 혼합물의 농도는 이에 제한되지는 않으나, 105 CFU/ml 내지 1010 CFU/ml, 105 CFU/ml 내지 109 CFU/ml, 105 CFU/ml 내지 108 CFU/ml, 105 CFU/ml 내지 107 CFU/ml, 105 CFU/ml 내지 106 CFU/ml, 106 CFU/ml 내지 1010 CFU/ml, 107 CFU/ml 내지 1010 CFU/ml, 108 CFU/ml 내지 1010 CFU/ml, 109 CFU/ml 내지 1010 CFU/ml, 106 CFU/ml 내지 109 CFU/ml, 106 CFU/ml 내지 108 CFU/ml, 106 CFU/ml 내지 107 CFU/ml, 107 CFU/ml 내지 109 CFU/ml, 107 CFU/ml 내지 108 CFU/ml, 또는 108 CFU/ml 내지 109 CFU/ml 일 수 있다.
상기 조성물은 동결보호제 또는 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 상기 동결보호제 또는 부형제는 비자연적으로 발생한(non-naturally occurring) 물질 또는 자연적으로 발생한 물질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또 하나의 구체 예로, 상기 동결보호제 또는 부형제는 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주가 자연적으로 접촉하지 않는 물질, 또는 상기 두 균주와 자연적으로 동시에 포함되지 않는 물질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또 하나의 구체 예로, 상기 조성물은 글리세롤, 트레할로스, 말토덱스트린, 탈지분유 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 동결보호제 및/또는 포도당, 덱스트린 및 탈지우유로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 부형제를 추가로 포함할 수 있다. 본 출원의 동결보호제는 상기 조성물 총 중량에 대하여 0.01 중량% 내지 20 중량%, 0.01 중량% 내지 10 중량% 포함될 수 있고, 구체적으로 상기 글리세롤은 5 중량% 내지 20 중량%, 상기 트레할로스는 2 중량% 내지 10 중량%, 상기 말토덱스트린은 2 중량% 내지 10 중량%, 상기 탈지분유는 0.5 중량% 내지 2 중량%, 상기 전분은 0.1 중량% 내지 1 중량%로 상기 조성물에 포함될 수 있다. 또한, 상기 부형제는 상기 조성물 총 중량에 대하여 75 중량% 내지 95 중량% 또는 85 중량% 내지 95 중량%로 포함할 수 있다.
또한, 상기 조성물을 제조하는 방법은 상기 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주 그 자체, 이의 파쇄물, 이의 배양물, 이의 농축액, 또는 이의 건조물과 첨가제를 혼합하는 단계를 포함할 수 있다. 상기 첨가제는 전술한 동결보호제 또는 부형제일 수 있다.
상기 조성물은 식품용 조성물, 기능성 식품용 조성물, 사료용 조성물, 사료 첨가제용 조성물, 화장품용 조성물, 또는 의약품용 조성물일 수 있다.
상기 조성물은 면역 증강용인 것일 수 있다.
상기 조성물은 항 바이러스용인 것일 수 있다.
다른 양태로서, 본 출원의 조성물을 유효성분으로 포함하는 프로바이오틱스 조성물을 제공한다.
프로바이오틱스는 장내의 소화관 벽에 정착하여 유해균이 정착하지 못하게 하며, 바이러스의 증식을 억제한다. 또한, 프로바이오틱스가 생산하는 유익한 소화효소는 영양소의 흡수와 이용을 용이하게 하여 성장을 촉진시킨다.
상기 프로바이오틱스 조성물을 제조하는 방법은 기탁번호 KCCM12287P로 기탁된 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) CJLP475 균주를 포함하는 조성물 및 기탁번호 KCCM12249P로 기탁된 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) CJLP17 균주를 포함하는 조성물을 각각 준비하는 단계; 및 상기 CJLP475 균주를 포함하는 조성물과 상기 CJLP17 균주를 포함하는 조성물을 혼합하는 단계;를 포함할 수 있다.
하나의 구체 예로, 상기 제조방법은 상기 CJLP475 균주를 포함하는 조성물, 상기 CJLP17 균주를 포함하는 조성물, 또는 상기 프로바이오틱스 조성물 중 어느 하나 이상의 조성물에 첨가제를 투여하는 단계를 포함할 수 있다.
또 하나의 구체 예로, 상기 첨가제는 동결보호제이고, 상기 첨가제 투여 단계 이후 동결 건조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
이??, 상기 동결 건조된 조성물 내 균주는 생균 상태일 수 있다.
또 하나의 구체 예로, 상기 제조방법은 상기 혼합 단계 이후 소정의 함량으로 포장하는 단계를 포함할 수 있다.
이때, 상기 소정의 함량으로 포장하는 단계는 상기 CJLP475 균주 및 상기 CJLP17 균주를 포함하는 균주 총량이 106 CFU/g 이상이 되도록 포장하는 것일 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는, 상기 조성물을 포함하는 사료 또는 사료 첨가제를 제공한다.
상기 조성물에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 구체적으로, 본 출원의 조성물을 성장 촉진, 설사율 감소, 바이러스 활성 억제를 목적으로 사료 첨가제 또는 상기 사료 첨가제를 포함하는 사료 조성물에 첨가할 수 있다.
본 출원에서 용어, "사료 첨가제"는 영양소 보충 및 체중감소 예방, 사료 내섬유소의 소화 이용성 증진, 유질 개선, 번식장애 예방 및 수태율 향상, 하절기 고온 스트레스 예방 등 다양한 효과를 목적으로 사료에 첨가하는 물질을 포함한다. 본 출원의 사료 첨가제는 사료관리법상의 보조사료에 해당하며, 탄산수소나트륨, 벤토나이트(bentonite), 산화마그네슘, 복합광물질 등의 광물질제제, 아연, 구리, 코발트, 셀레늄 등의 미량 광물질인 미네랄제제, 케로틴, 비타민 E, 비타민 A, D, E, 니코틴산, 비타민 B 복합체 등의 비타민제, 메티오닌, 리이산 등의 보호아미노산제, 지방산 칼슘염 등의 보호지방산제, 생균제(유산균제), 효모배양물, 곰팡이 발효물 등의 생균, 효모제 등이 추가로 포함될 수 있다.
출원에서 용어, "사료"는 동물이 먹고, 섭취하며, 소화시키기 위한 또는 이에 적당한 임의의 천연 또는 인공 규정식, 한끼식 등 또는 상기 한끼식의 성분으로, 본 출원에 따른 대사질환의 예방 또는 치료용 조성물을 유효성분으로 포함하는 사료는 당업계의 공지된 다양한 형태의 사료로 제조가능하며, 구체적으로는 농후사료, 조사료 및/또는 특수사료가 포함될 수 있다.
사육 대상은 출원의 사료를 섭취할 수 있는 생명체라면 제한 없이 포함될 수 있으며, 본 출원의 목적상 돼지를 포함할 수 있다.
본 출원에 따른 사료 조성물 내 조성물의 함량은 적용 개체의 종류 및 연령, 적용 형태, 목적하는 효과 등에 따라서 적절하게 조절 가능하며, 예컨대 0.01 내지 20 중량%, 0.01 내지 15 중량%, 0.01 내지 10 중량%, 0.01 내지 5 중량%, 0.01 내지 1 중량%, 1 내지 20 중량%, 1 내지 15 중량%, 1 내지 10 중량%, 1 내지 5 중량%, 5 내지 20 중량%, 5 내지 15 중량%, 5 내지 10 중량%, 10 내지 20 중량%, 10 내지 15 중량%, 또는 15 내지 20 중량%로 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 사료 조성물은 투여를 위해서 추가로 구연산, 푸마르산, 아디프산, 젖산 등의 유기산; 인산칼륨, 인산나트륨, 중합 인산염 등의 인산염; 폴리페놀, 카테친, 토코페롤, 비타민 C, 녹차 추출물, 키토산, 탄니산 등의 천연 항산화제 중 1종 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항인플루엔자제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 또는 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화 할 수 있다.
또한, 본 출원의 사료 조성물은 보조성분으로 아미노산, 무기염류, 비타민, 항산화제, 항진균제, 항균제 등과 같은 각종 보조제 및 분쇄 또는 파쇄된 밀, 보리, 옥수수 등의 식물성 단백질 사료, 혈분, 육분, 생선분 등의 동물성 단백질 사료, 동물성 지방 및 식물성 지방 같은 주성분 이외에도 영양 보충제, 성장 촉진제, 소화 흡수 촉진제, 질병 예방제와 함께 사용될 수 있다.
본 출원의 사료 조성물을 사료 첨가물로 사용할 경우, 상기 사료 조성물을 그대로 첨가하거나 다른성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 사료 조성물의 투여 형태는 비독성 제약상 허용 가능한 담체와 조합하여 즉시 방출 또는 서방성 제형으로 제조할 수 있다. 상기 담체는 비자연적으로 발생한(non-naturally occurring) 물질 또는 자연적으로 발생한 물질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또 하나의 구체 예로, 상기 담체는 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주가 자연적으로 접촉하지 않는 물질, 또는 상기 두 균주와 자연적으로 동시에 포함되지 않는 물질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 이러한 식용 담체는 옥수수 전분, 락토스, 수크로스, 프로필렌 글리콜일 수 있다. 고체형 담체의 경우에는 정제, 산제, 토로키제 등의 투여 형태일 수 있으며 액체형 담체의 경우에는 시럽제, 액체 현탁액제, 에멀젼제, 용액제 등의 투여 형태일 수 있다. 또한, 투여제는 보존제, 윤화제, 용액 촉진제, 안정화제를 함유할 수 있으며 다른 염증 질환 개선제 및 바이러스 예방상 유용한 물질을 함유할 수도 있다.
본 출원에 따른 사료 조성물은 사료에 건조 중량 기준으로 1 ㎏ 당 약 10 내지 500 g, 구체적으로는 10 내지 100 g의 양으로 혼합될 수 있고, 완전히 혼합한 후 매쉬로 공급하거나, 추가 가공 공정을 통하여 팰렛화, 팽창화, 압출 공정을 거칠 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 다른 하나의 양태는, 상기 조성물을 포함하는, 식품 또는 기능성 식품을 제공한다.
구체적으로, 본 출원의 조성물은 성장촉진, 면역촉진, 설사율 감소, 바이러스 활성 억제를 목적으로 식품에 첨가될 수 있다. 조성물에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다. 식품은 식품학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 담체는 비자연적으로 발생한(non-naturally occurring) 물질 또는 자연적으로 발생한 물질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또 하나의 구체 예로, 상기 담체는 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주가 자연적으로 접촉하지 않는 물질, 또는 상기 두 균주와 자연적으로 동시에 포함되지 않는 물질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 식품은 기능성 식품(functional food), 영양 보조제(nutritional supplement), 건강 식품(health food) 및 식품 첨가제(food additive)등의 모든 형태를 포함하며, 상기 유형의 식품은 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 다양한 형태로 제조할 수 있다.
상기 조성물을 식품 첨가물로 사용할 경우, 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효 성분의 혼합양은 사용 목적 (예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조 시에 조성물을 포함하는 원료 조성물 중 0.0001~1 중량%, 구체적으로는 0.001~0.1 중량%의 양으로 첨가된다. 그러나 건강 및 위생을 목적으로 하거나 또는 건강 조절을 목적으로 하는 장기간의 섭취의 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하로도 사용될 수 있다.
상기 식품의 종류에는 특별한 제한은 없다. 상기 물질을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.
본 출원의 건강음료 조성물은 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 슈크로스와 같은 다이사카라이드, 및 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 감미제로서는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제나, 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제 등을 사용할 수 있다. 상기 추가 성분의 비율은 본 출원의 조성물 100 중량부 당 0.01~0.04 중량부, 구체적으로는 0.02~0.03 중량부 일 수 있다.
상기 외에 본 출원의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 출원의 조성물 100 중량부 당 0.01~0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다. 그밖에 본 출원의 조성물은 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 과육의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 출원의 조성물 100 중량부 당 0.01~10 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다. 이들 성분들은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는, 상기 조성물을 포함하는 화장품을 제공한다.
구체적으로, 본 출원의 조성물은 면역 촉진을 통한 항염증 효과, 바이러스 활성 억제 효과를 가지므로, 화장품으로 이용될 수도 있다. 조성물에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 본 출원에 따른 조성물이 화장품으로서 이용될 경우에는 당해 화장품 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 제형의 다양한 화장품으로 제조될 수 있다. 각각의 제형으로 제제화 시, 각각의 제형의 제조에 필요한 화장품의 제조에 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 부가하여 제조할 수 있다. 상기 담체 또는 첨가제는 비자연적으로 발생한(non-naturally occurring) 물질 또는 자연적으로 발생한 물질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또 하나의 구체 예로, 상기 담체 또는 첨가제는 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주가 자연적으로 접촉하지 않는 물질, 또는 상기 두 균주와 자연적으로 동시에 포함되지 않는 물질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 출원의 다른 하나의 양태는, 상기 조성물을 포함하는 의약품을 제공한다. 구체적으로, 본 출원의 조성물은 성장촉진, 설사율 감소, 면역 촉진을 통한 항염증 효과, 바이러스 활성 억제 효과를 가지므로, 의약품으로 이용될 수도 있다. 조성물에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 출원에 따른 조성물이 의약품으로서 이용될 경우에는 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 약제학적 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 의약품은 구체적으로 경구 제형으로 제제화될 수 있으며, 예를 들어 액제, 현탁제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 또는 엑스제와 같은 경구 투여용 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 각각의 제형으로 제제화 시, 각각의 제형의 제조에 필요한 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 첨가제를 부가하여 제조할 수 있다. 상기 담체 또는 첨가제는 비자연적으로 발생한(non-naturally occurring) 물질 또는 자연적으로 발생한 물질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또 하나의 구체 예로, 상기 담체 또는 첨가제는 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주가 자연적으로 접촉하지 않는 물질, 또는 상기 두 균주와 자연적으로 동시에 포함되지 않는 물질일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 대표적으로 경구 투여용 제형으로 제제화 시 상기 담체로서 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제, 및 방부제 중에서 1 종 이상을 선택하여 사용할 수 있으며, 첨가제로는 향료, 비타민류, 및 항산화제 중에서 1 종 이상을 선택하여 사용할 수 있다. 상기 담체 및 첨가제는 약제학적으로 허용 가능한 것은 모두 가능하며, 구체적으로 희석제로는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘 또는 탈크, 결합제로는 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필셀룰로오스가 사용될 수 있다. 또한, 붕해제로는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산나트륨, 폴라크릴린칼륨, 또는 크로스포비돈, 감미제로는 백당, 과당, 솔비톨, 또는 아스파탐, 안정제로는 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 베타-사이클로덱스트린, 백납, 또는 잔탄검, 방부제로는 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 또는 솔빈산칼륨이 사용될 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는, 본 출원의 조성물을 개체에 투여하는 단계를 제공한다. 상기 조성물 및 개체는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 투여에 의해 개체에서 상기 조성물의 효능, 즉, 면역 증강 활성, 항 바이러스 활성 등을 나타낼 수 있다.
상기 투여를 위한 투여량은 이에 제한되지는 않으나, 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주의 혼합물 기준으로 106 CFU/일 이상, 107 CFU/일 이상, 108 CFU/일 이상, 109 CFU/일 이상, 1010 CFU/일 이상 또는 1011 CFU/일 이상 투여하는 것일 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는, 상기 조성물을 이를 필요한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 면역증강 방법을 제공한다. 상기 조성물 및 개체는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 출원에서 사용된 용어, "투여"는 어떠한 적절한 방법으로 개체에게 본 출원의 조성물을 도입하는 것을 의미하며, 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 경구 또는 비경구의 다양한 경로를 통하여 투여될 수 있다.
본 출원의 다른 하나의 양태는, 상기 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 바이러스 감염질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 상기 조성물 및 개체는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 출원에서 사용되는 용어 "예방"은 본 출원의 조성물의 투여로 바이러스 감염질환을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다. 또한, 본 출원에서 사용되는 용어 "치료"는 본 출원의 조성물의 투여로 감염질환의 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 출원의 조성물은 내산성, 내담즙성이 우수하여 프로바이오틱스로 제공 가능하며, 생체 내 면역 세포를 활성화하여 면역기능을 조절하고, 특히 돼지유행성설사바이러스에 대해서도 우수한 감염억제 활성을 나타낸다. 또한, 본 출원의 조성물을 가축에 경구 투여한 후 분만한 자돈에 PED 바이러스를 공격 접종한 경우, 면역조절 효과를 통해 자돈 폐사율이 현저히 낮아지는 효과를 나타낸다. 따라서, 본 출원은 PED 바이러스에 대한 항바이러스 활성, 면역 증진 활성, 증체량 개선 효과 및 가축의 설사 발생율 감소 효과를 갖는, 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 조성물은 사료 또는 사료첨가제용 조성물, 식품 조성물, 화장품 조성물 또는 의약품 조성물로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은, 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주가 용혈성이 없음을 확인한 혈액한천평판배지 사진을 나타낸 것이다.
도 2는, 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주를 포함하는 조성물이 세포독성이 없음을 확인한 그래프이다.
도 3은, 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주를 포함하는 조성물에 의한 PED 바이러스 감염 억제 효과를 나타낸 현미경사진이다.
도 4는, 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주를 포함하는 조성물이 급이된 모돈의 혈액내 vaccine-specific IgG항체 증가율을 나타낸 그래프이다.
도 5는, 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주를 포함하는 조성물이 급이된 모돈의 혈액내 vaccine-specific IgA항체 증가율을 나타낸 그래프이다.
도 6은 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주를 포함하는 조성물이 급이된 모돈의 초유내 중화항체가를 나타낸 그래프이다.
도 7은, 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주를 포함하는 조성물이 급이된 모돈에서 태어난 포유자돈에게 PED 바이러스 공격접종 후, 자돈 혈액 내 vaccine-specific IgG 항체 함량을 나타낸 그래프이다.
도 8은, 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주를 포함하는 조성물이 급이된 모돈에서 태어난 포유자돈에게 PED 바이러스 공격접종 후 자돈 혈액 내 TGF-beta 함량을 나타낸 그래프이다.
도 9는, 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주를 포함하는 조성물이 급이된 모돈에서 태어난 포유자돈에게 PED 바이러스 공격접종 후 자돈 공장의 V/C ratio를 나타낸 그래프이다.
도 10은, 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주를 포함하는 조성물이 급이된 모돈에서 태어난 포유자돈에게 PED 바이러스 공격접종 후 자돈 결장의 goblet cell을 나타낸 그래프이다.
도 11은, 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주를 포함하는 조성물이 급이된 모돈에서 태어난 포유자돈에게 PED 바이러스 공격접종 후 7일간 평균 체온을 나타낸 그래프이다.
도 12는, 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주를 포함하는 조성물이 급이된 모돈에서 태어난 포유자돈에게 PED 바이러스 공격접종 후 7일간 설사율을 나타낸 그래프이다.
도 13은, 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주를 포함하는 조성물이 급이된 모돈에서 태어난 포유자돈에게 PED 바이러스 공격접종 후 7 일간 생존율을 나타낸 그래프이다.
이하 본 출원을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 출원을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 출원의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 균주 분리 및 선발
1-1. 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주의 시료 확보 및 분리
간장에서 분리한 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주를 1.5 % 한천(agar)이 포함된 MRS 고체 배지(Difco, USA)에 도말하여 37 ℃에서 24 시간 동안 배양하였다. 각 시료에서 분리된 균주들은 새로운 배지에 옮겨 배양하는 방법으로 순수 분리 하였으며, 20 % 글리세롤이 첨가된 영양배지에 순수 분리되어 배양된 균을 담아 영하 70 ℃ 이하에서 보존하였다. 그 결과 총 1,552 종의 균주를 확보하였으며, 이하의 실시예를 통하여 우수한 항바이러스 활성 등을 갖는 균주를 선발하였다.
락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주는 16S rDNA 염기서열 분석 결과 락토바실러스 플람타룸 표준균주(Lactobacillus plantarum NBRC15891, GenBank accession number AB326351)와 가장 높은 상동성(99.9%)을 나타내어 락토바실러스 플란타럼으로 동정하고, "락토바실러스 플란타럼 CJLP475"로 명명하였으며, 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국 미생물보존센터에 2018년 07월 11일자로 기탁하였다(수탁번호 KCCM12287P). 락토바실러스 플란타럼 CJLP475의 분석된 16S rDNA의 염기서열은 서열번호 1과 같다.
한편, 상기 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주는 그람염색 결과 그람 양성이었다. 또한, 생화학적 특성을 분석하기 위하여 API 50CHL system(biomerieux Vitek, Inc., 프랑스)으로 상기 균주의 당 발효 패턴을 분석하였다(표 1).
락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주의 당 발효패턴 분석
균주명 CJLP475 균주명 CJLP475
control - Esculine +
Glycerol - Salicine +
Erythritol - Cellobiose +
D-Arabinose - Maltose +
L-Arabinose + Lactose +
Ribose + Melibiose +
D-Xylose - Saccharose +
L-Xylose - Trehalose +
Adonitol - Inuline -
β Methyl-xyloside - Melezitose +
Galactose + D-Raffinose +
D-Glucose + Amidon -
D-Fructose + Glycogene -
D-Mannose + Xylitol -
L-sorbose - β Gentiobiose +
Rhamnose + D-Turanose +
Dulcitol - D-Lyxose -
Inositol - D-Tagatose -
Mannitol + D-Fucose -
Sorbitol + L-Fucose -
α Methyl-D-mannoside + D-Arabitol -
α Methyl-D-glucoside - L-Arabitol -
N Acetyl glucosamine + Gluconate +
Amygdaline + 2 ceto-gluconate -
Arbutine + 5 ceto-gluconate -
+ 양성, - 음성
1-2. 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주의 시료 확보 및 분리
PEDV가 만성적으로 발생한 국내 농장의 모돈, 자돈의 분변 샘플 및 초유 샘플을 확보하였다. 확보된 시료를 단계적으로 희석하여, MRS 및 BHI 고체배지에 도말한 후 37 ℃에서 48 시간 동안 배양하였다. 각 시료에서 분리된 균주들은 새로운 배지에 옮겨 배양하는 방법으로 순수 분리 하였으며, 20 % 글리세롤이 첨가된 영양배지에 순수 분리되어 배양된 균을 담아 영하 70 ℃ 이하에서 보존하였다. 그 결과 총 1,552 종의 균주를 확보하였으며, 이하의 실시예를 통하여 우수한 항바이러스 활성 등을 갖는 균주를 선발하였다. 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주는 16S rDNA 염기서열 분석 결과 락토바실러스 플란타럼 표준균주(Lactobacillus plantarum NBRC15891, GenBank accession number AB326351)와 가장 높은 상동성(99%)을 나타내어 락토바실러스 플란타럼으로 동정하고, "락토바실러스 플란타럼 CJLP17" 로 명명하였으며, 부다페스트 조약 하의 국제기탁기관인 한국 미생물보존센터에 2018년 4월 13일자로 기탁하였다(기탁번호 KCCM12249P). 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주의 분석된 16S rDNA의 염기서열은 서열번호 2와 같다.
한편, 상기 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주는 그람염색 결과 그람 양성이었다. 또한, 생화학적 특성을 분석하기 위하여 API 50CHL system(biomerieux Vitek, Inc., 프랑스)으로 상기 균주의 당 발효 패턴을 분석하였다(표 2).
락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주의 당 발효패턴 분석
균주명 CJLP17 균주명 CJLP17
control - Esculine -
Glycerol - Salicine +
Ertythritol - Cellobiose +
D-Arabinose - Maltose +
L-Arabinose + Lactose +
Ribose + Melibiose +
D-Xylose - Saccharose +
L-Xylose - Trehalose +
Adonitol - Inuline -
β Methyl-xyloside - Melezitose +
Galactose + D-Raffinose -
D-Glucose + Amidon -
D-Frutose + Glycogene -
D-Mannose + Xylitol -
L-sorbose - β Gentiobiose +
Rhamnose - D-Turanose +
Dulcitol -- D-Lyxose -
Inositol - D-Tagatose -
Mannitol + D-Fucose -
Sorbitol + L-Fucose -
α Methyl-D-mannoside + D-Arabitol -
α Methyl-D-glucoside - L-Arabitol -
N Acetyl gllucosamine + Gluconate +
Amygdaline + 2 ceto-gluconate -
Arbutine + 5 ceto-gluconate -
+ 양성, - 음성
실시예 2: 균주의 내산성 및 내담즙성 평가
프로바이오틱스로 활용 가능한 균주를 선별하기 위해, 상기 확보된 균주들에 대해서 내산성 및 내담즙성에 대한 평가를 실시하였다.
내산성 평가를 위하여 인공위액 배지를 제조하였다. 보다 구체적으로, 상기 인공위액 배지는 MRS 액체배지에 펩신을 첨가하여 pH 2.5가 되도록 조정한 후 멸균하여 준비하였다.
상기 실시예 1의 균주들을 2차 계대배양 후, MRS 액체배지에서 37 ℃, 18 시간 동안 정치배양 하였다. 상기 인공위액 배지에 전배양한 균주를 1 % 접종하여 37 ℃에서 정치배양하였으며, 0 시간 및 3 시간이 되는 시점에 배양액을 샘플링하였다. 샘플링한 배양액을 MRS 고체배지에 단계적으로 희석하여 도말한 후, 37 ℃에서 48 시간 동안 배양하여 생균수를 측정하였다.
내담즙성 평가를 위하여 인공담즙액 배지를 제조하였다. 보다 구체적으로, 상기 인공담즙액 배지는 0.5 % oxgall(황소의 담즙)을 첨가한 MRS 액체배지를 멸균하여 준비하였다.
상기 실시예 1의 균주들을 2차 계대배양 후, MRS 액체배지에서 37 ℃, 18 시간 동안 정치배양 하였다. 상기 인공담즙액 배지에 전배양한 균주를 1 % 접종하여, 37 ℃에서 정치배양하면서 0 시간, 24 시간의 경과 시점에 배양액을 샘플링하였다. 샘플링한 배양액을 MRS 고체배지에 단계적으로 희석하여 도말한 후, 37 ℃에서 48 시간 배양하여 생균수를 측정하였다.
상기 평가를 통하여, 내산성 및 내담즙성이 가장 우수한 균주를 선별하여, 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17로 우선 특정하였다. 상기 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주의 내산성 및 내담즙성을 종래 공지된 균주와 비교하기 위하여, 한국미생물보존센터에서 분양 받은 락토바실러스 플란타럼 표준균주(KCCM12116)의 내산성 및 내담즙성을 상기 방법과 동일한 방법으로 평가하였다.
내산성 평가 (단위: CFU/ml)
0 시간 3 시간
Lactobacillus plantarum CJLP17
(KCCM12249P)		 1.1 x 106 4.0 x 106
Lactobacillus plantarum CJLP475
(KCCM12287P)		 1.1 x 106 1.1 x 107
Lactobacillus plantarum(KCCM12116) 2.3 x 107 1.3 x 107
내담즙성 평가 (단위: CFU/ml)
0 시간 24 시간
Lactobacillus plantarum CJLP17
(KCCM12249P)		 1.3 x 106 1.1 x 107
Lactobacillus plantarum CJLP475
(KCCM12287P)		 1.3 x 108 1.1 x 107
Lactobacillus plantarum(KCCM12116) 2.1 x 107 1.6 x 106
상기 표 3 및 표 4에 따르면, 락토바실러스 플란타럼 표준균주(KCCM12116)는 인공위액 배지 및 인공담즙 배지에서 균주 수가 감소하였다. 이를 통해, 일반적으로 알려진 모든 락토바실러스 플란타럼이 내산성 및 내담즙성을 갖는 것은 아님을 알 수 있다.
반면, 내산성 평가에서 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주와 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주는 균주 수가 오히려 증가하였으므로, 내산성이 뛰어난 균주임을 알 수 있다.
내담즙성 평가에서, 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주는 균주 수가 증가하였고, 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주는 락토바실러스 플란타럼 표준균주(KCCM12116)과 비교하여 균주 수 감소폭이 작으므로, 두 균주 모두 내담즙성이 뛰어난 균주임을 알 수 있다.
또한, 각각의 균주가 내산성 및 내담즙성이 뛰어나므로 상기 두 균주를 모두 포함하는 조성물 또한 내산성 및 내담즙성이 뛰어나다고 할 수 있다.
실시예 3: 균주의 안정성 평가
3-1. 균주의 용혈성 확인
β-용혈이란 적혈구에 의해서 공급되는 인지질이 유해균으로부터 생산된 인지질 효소에 의해 가수분해되어, 결과적으로 적혈구가 용혈되는 작용이다. 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주와 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주의 용혈성을 알아보기 위하여 혈액한천평판배지(sheep blood 5 % agar, (주)한일코메드, 대한민국)를 이용하였다. 준비된 혈액한천평판배지에 각 균주를 선형 접종(streaking)한 후, 37 ℃에서 24 시간 배양하여 용혈 여부를 확인하였다.
그 결과, 도 1에서 알 수 있듯이 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주와 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주는 용혈성을 나타내지 않음을 확인할 수 있었다. 이와 같은 결과는 생체내에서 유해균으로 작용하지 않음을 시사하는 것이다.
3-2. 항생제 감수성 평가
락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주와 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주를 각각 MRS 액체배지에 접종하여, 37 ℃에서 24 시간 정치배양하였다. 배양된 균을 멸균된 면봉에 적셔 Mueller Hinton II 고체배지(Difco)에 도말한 후, 상기 배지 위에 항생제 디스크를 올려 37 ℃에서 24 시간 배양하였다. 항생제 검사를 위한 항생제 디스크로는 Ampicillin, clindamycin, Gentamicin, kanamycin, Erythromycin, Ampicillin/sulbactam, Chloramphenicol 및 Streptomycin 디스크 (Oxoid, 영국)를 준비하여 사용하였다.
락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주와 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주의 항생제 감수성 검사 결과, 각 균주는 상기 항생제들에 대한 내성을 갖지 않는 것으로 확인되었다 (표 5). 따라서, 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주와 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주를 의약품, 건강기능식품, 사료 첨가제 등으로 사용하더라도, 항생제에 대한 내성이 없는 점에서 그에 따른 내성 문제나 환경적 문제는 발생할 가능성이 낮음을 알 수 있다.
항생제에 따른 균주 성장저해도
항생제(Antibiotics) 항생제를 중심으로 한 성장저해영역 반지름(mm)
CJLP475 CJLP17
Amp10 (Ampicillin) 7.5 7.5
C30 (Clindamycin) 7 7
CN120 (Gentamicin) 5 5
K30 (Kanamycin) 1.5 1.5
E15 (Erythromycin) 12 12
SAM20 (Ampicillin/Sulbactam) 7 7
S10 (Chloramphenicol) 3.5 3.5
DA2 (Streptomycin) 4.5 4.5
실시예 4: 세포독성평가
상기 균주들이 세포의 생존에 미치는 영향을 알아보기 위해, MTS 분석방법 (3-(4,5-dimethyl-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium, promega, USA)을 이용하여 IPEC-J2(돼지 장 상피 세포, intestinal pig epithelium cells) 세포 상에서 세포독성 수준을 평가하였다. 각 세포를 96 웰 세포 배양 플레이트에 배양한 후 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주와 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주를 1:1로 혼합한 균주 혼합물을 농도 별(105~107 CFU/ml)로 처리하여 배양하였다. 24 시간 후 세포 배양액에 MTS 용액을 첨가하고 2 시간 동안 배양하였고 마이크로플레이트 리더기로 파장 490nm에서 흡광도를 측정하여 세포 생존율(%)를 계산하였다.
그 결과 도 2에 나타난 바와 같이 3 가지 농도로 처리하였을 때 107 CFU/ml 이하의 농도에서는 세포 사멸이 거의 일어나지 않은 것으로 확인하였다. 따라서, 조성물은 실질적으로 107 CFU/ml 이하의 농도에서 세포 독성을 거의 나타내지 않음을 알 수 있다.
실시예 5: 바이러스 감염 억제 효과
락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주를 포함하는 조성물의 바이러스 감염 억제 효과를 측정하기 위하여, 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)를 준비하였다. 구체적으로는, 상기 바이러스를 Vero(CCL-81, 버빗원숭이 기원 신장상피세포) 세포에서 증식 배양하였으며, 상기 Vero 세포를 배양하기 위한 배지로 MEM(Eagle's Minimum Essential Medium, Gibco BRL, Grand Island, NY, USA), 열처리로 불활화된 10 % FBS(fetal bovine serum, v/v), 1 %(v/v) penicillin/streptomycin을 사용하였다. 상기 Vero 세포를 단층이 되도록 배양한 후 두 차례에 걸쳐 배지로 세척하고 모든 용액을 제거하였다. 5 ㎍/㎖ TPCK(N-tosyl-L-phenylalanine chloromethyl ketone)가 처리된 트립신을 포함하는 FBS 무첨가 MEM에 0.1 MOI(Multiplicity of infection) 수준의 바이러스를 섞고, 이를 준비된 배양 세포에 최소 볼륨으로 처리한 뒤 5 % CO2를 함유한 37 ℃ 세포 배양기에서 2~3 일간 배양하였다.
바이러스의 감염 여부는 바이러스 신시티움(virus syncytium) 형성 여부로 판단하였다. 신시티움이 형성되면 3~6 시간 내에 바이러스 배양액을 수거하고, 원심분리기를 이용하여 세포를 제거한 후, -80 ℃에 보관 하였다. 바이러스의 감염 역가 계산의 경우, 96-well 플레이트에 Vero 세포를 2X104 cell/0.1ml 수준으로 배양하고 세포를 PBS로 세척한 후, 바이러스를 2 배수 연속 희석한 배양액을 넣고 24~48 시간 배양 시켜 바이러스의 감염 유무를 확인한 뒤, Reed & Muench 방법에 의해 바이러스의 감염 역가를 계산하였다.
락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주를 포함하는 조성물의 바이러스 감염억제 효과를 측정하기 위하여, 상기 조성물과 21 일령 이유자돈으로부터 추출된 말초혈액 단핵세포(PBMC, peripheral blood mononuclear cell) 및 장간막 림프절(mLN, lymphocytes in mesenteric lymph nodes)을 20~24 시간 반응 시킨 후, IPEC-J2가 배양된 96-웰 세포배양 플레이트에 각각 처리하고 5 % CO2를 함유한 37 ℃ 세포배양기에서 2~4 시간 배양하였다. 각각의 플레이트에 100 TCID50/ml (50 % of tissue cell infectious dose)의 PED 바이러스(SM98 또는 KPEDV9)를 점적한 후 48 시간 배양하였다. 바이러스 감염 여부를 확인하기 위하여, 배양이 완료된 후 세포배양 플레이트를 메탄올로 고정시키고 크리스탈 바이올렛으로 염색을 한 후, 세포 변성된 웰을 현미경으로 확인하여, 바이러스 감염 여부를 판단 하였다.
각각의 락토바실러스 플란타럼 CJLP475, 락토바실러스 플란타럼 CJLP17을 혼합시 활성화된 면역세포에 의한 PED 바이러스 감역억제 효과
mLN PBMC
PEDV PEDV
음성 대조군 - -
CJLP475 + ++
CJLP17 + ++
CJLP17 및 CJLP475 ++ ++
++ : 완전 억제, + : 부분적 억제, - : 감염됨
그 결과 표 6 및 도 3에 나타난 바와 같이, 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주를 모두 포함하는 조성물을 돼지 면역세포와 함께 처리했을 때, 상기 조성물에 의해 활성된 면역 세포가 돼지 장상피세포(IPEC-J2)의 PED 바이러스 감염을 억제 하는 것으로 판단할 수 있다.
상기 표 6에서 세 실험군(CJLP475, CJLP17, CJLP17 및 CJLP475) 각각의 총 균주 수가 동일한 것을 고려하였을 때, 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주를 모두 포함하는 조성물의 PED 바이러스 감염 억제 효과가 CJLP475 균주, CJLP17 균주 각각을 포함하는 조성물의 PED 바이러스 감염 억제 효과에 비해 현저히 우수한 것을 알 수 있다.
실시예 6: 모돈의 면역력 및 초유에 미치는 영향 확인
실시예 5에서 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주를 포함하는 조성물의 항바이러스 효과를 확인하였기 때문에, 상기 조성물을 모돈에 급이하였을 때 모돈의 면역력과 초유에 미치는 영향을 확인하기 위하여 다음과 같이 실험을 진행하였다. PED 바이러스가 발생하지 않는 농장에서 같은 시기 분만 예정인 분만 6 주전 모돈을 실험 군당 15 마리씩 임의로 선정하였다. 실험에 사용된 모돈은 모두 PED 바이러스 백신을 분만 8 주, 3 주전에 접종하였으며, 균주를 급여하지 않는 대조군 그룹(control)과 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주를 포함하는 조성물을 급이한 그룹의 총 2개의 실험군으로 나누어 진행하였다. 사료는 항생제가 첨가되지 않은 일반적인 크럼블 사료를 공급하였고, 물은 무제한 급이 하였다. 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주를 동결 건조 분말 형태로 생산하여 냉장 보관 후, 하루에 마리당 1010 CFU 이상/일씩 섭취할 수 있도록 사료 급여 시 탑드레싱하였다. 이와 같이 총 6 주간 급여한 이후, 상기 균주가 모돈의 면역력과 초유에 미치는 영향을 확인하기 위하여, 모돈의 혈액 내 vaccine-specific IgG항체 증가율, vaccine-specific IgA항체 증가율 및 초유 내 중화항체가를 측정하여, 도 4, 도 5 및 도 6에 나타내었다.
이 실험의 결과로 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주를 포함하는 조성물은 대조군에 비해 모돈의 혈액 내 vaccine specific IgG와 IgA를 증가시켰고, 상기 조성물 급이에 따른 분만 시 초유의 중화항체가 변화를 살펴본 결과 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주를 포함하는 조성물이 대조군 보다 더 높은 중화항체가를 보였다.
실시예 7: 모돈의 조성물 급이에 따른 자돈의 면역력 개선효과
락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주를 포함하는 조성물이 급이된 모돈에서 태어난 자돈의 면역력에 미치는 영향을 확인하기 위해 실시예 6과 같이 모돈 실험을 진행한 후, 추가로 그 모돈에서 태어난 자돈으로부터 초유를 섭취한 4 일 후 혈액을 채취하여 IgG ELISA kit를 이용하여 면역학적 분석을 하였다. 상기와 같이 총 6 주간의 모돈에 대한 상기 조성물 급이가 자돈의 면역력에 미치는 영향을 도 7에 나타내었다.
그 결과 자돈 혈액 내 Vaccine specific IgG ?t량은 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주를 포함하는 조성물 급이군에서 모두 대조군 대비 높게 검출되었다(도 7).
이는 모돈의 초유로부터 높은 Vaccine specific IgG를 자돈이 섭취한 것으로, 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주를 포함하는 조성물의 모돈 급이가 자돈의 면역력을 향상 시킴을 알 수 있다.
실시예 8: 조성물을 급이한 모돈으로부터 태어난 포유자돈에게 공격접종 시 미치는 영향
락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주를 포함하는 조성물을 급이한 모돈에서 태어난 자돈이 PED 바이러스에 감염되었을 때, 자돈의 폐사에 미치는 영향을 확인하기 위해 실시예 6과 같이 모돈 실험을 진행하였다. 이 실험은 자돈에 PED 바이러스를 공격접종 해야 하기 때문에, 동물실험윤리위원회 조언에 따라 실험군을 최소화 하여 단독 균주는 진행하지 않고 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주를 포함하는 조성물만 진행하였다.
락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주를 포함하는 조성물이 급이된 모돈의 분만 후 4 일령된 포유자돈을 처리군별로 20 마리씩 선발하여 공격접종을 실시하였다(PEDv QIAP 1401, 100LD50/ml). 공격접종 후 총 7 일 동안 매일 체온측정 및 설사 스코어링을 하였고(0~3, 0: 정상변, 1: 연변, 2: 보통설사, 3: 심한설사), 대용유 및 물은 자유급이 하였으며, 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주를 포함하는 조성물은 대용유에 섞어서 한 마리당 1Х1010 CFU씩 급이 하였다(1 일 1 회). 자돈 폐사시 부검하여 공장결장을 샘플링 하여 중성 포르말린을 이용하여 고정하고 파라핀을 침투시켜 embedding 후 박절처리한 다음 조직절편 탈 파라핀화 후 hydration 하였다. 이후 H&E Staining 하여 융모의 높이와 음와의 깊이의 비를 측정하여 V/C ratio를 확인하였고, 결장의 점막을 샘플링하여 mm2 당 goblet cell개수를 확인하였다. 또한 개체마다 혈액을 채취한 후 혈청을 분리하여 처리군별 염증억제 정도를 비교평가하기 위해 염증 억제 대표인자인 TGF-beta 함량수준을 ELISA(R&D Systems, USA)를 통해 측정하였다. 공격접종 실험 결과를 도 8 내지 도 13에 나타내었다.
자돈의 혈액 내 TGF-beta는 조성물 급이군에서 대조군 대비 높게 검출되었다. 따라서, 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주를 포함하는 조성물 급이군의 항염반응이 더 활성화 되어있음을 확인할 수 있었다 (도 8).
자돈 공장의 V/C ratio는 조성물 급이군이 대조군 대비 더 높게 나타났기 때문에, 바이러스에 의한 융모의 탈락이 대조군보다 완화되었음을 확인할 수 있었다(도 9).
자돈 결장 내 goblet cell은 조성물 급이군이 대조군보다 많았기 때문에, PED 바이러스 감염에 의해 발생하는 장 점막 형성 방해가 유의적으로 적었음을 확인할 수 있었다(도 10).
PED 바이러스 공격접종 이후 자돈의 체온변화를 살펴본 결과, 조성물 급이군은 대조군에 비해 정상범위 내에서 체온이 유지됨을 확인하였다. 특히 5,6,7 dpi에서는 상기 조성물을 급이한 모돈에서 태어난 자돈에서의 체온변화가 대조군에 비해 유의적으로 평균 체온을 유지하였다(도 11).
PED 바이러스에 의한 자돈의 설사지수(clinical significance score)를 확인한 결과 조성물을 급이한 실험군은 6, 7dpi에서 대조군에 비해서 유의적으로 설사 지수가 낮아졌다 (도 12).
PED 바이러스 공격접종 이후 7 일까지 생존율을 확인한 결과 대조군은 55 % 생존율을 보였으며, 조성물을 급이한 모돈에서 태어난 자돈에서는 PED 바이러스에 감염 시 65 %의 생존율을 보여 대조군 보다 우수한 항 바이러스 효과를 보였다 (도 13).
상기의 결과를 보았을 때, 조성물 급이를 통해 모돈의 면역 및 초유 내 항체를 개선시킴으로 인해 자돈의 면역에 영향을 주어 바이러스 감염시 폐사율 감소를 일으켰다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 9: 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주 및 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주를 포함하는 생균제의 제조
상기 실시예 1에서 동정된 프로바이오틱스 락토바실러스 플란타럼 CJLP475 균주와 프로바이오틱스 락토바실러스 플란타럼 CJLP17 균주를 혼합하여 의약품, 식품, 사료, 사료 첨가제, 또는 화장품의 원료로 적용하기 위하여 대량 생산하고 이를 동결 건조하여 생균제화 하였다.
각 균주의 생산을 위하여 상기 각 균주를 MRS 액체배지(Difco)에서 25 % NaOH 용액을 사용하여 pH를 6.0으로 조절하면서 37 ℃에서 약 18 시간 배양을 하고 원심분리를 수행하여 균체를 회수하였다. 회수한 각 균체는 덱스트린 5 %와 탈지우유 10 %를 동결 보호제로 사용하여 -40 ℃에서 동결 후 37 ℃에서 건조한 균체를 믹서로 갈아서 분체화하였다. 분체화된 각 생균을 혼합하여 목표로 하는 균수에 맞추고 보관을 하기 위하여 적당량의 포도당, 유당, 탈지우유 등과 같은 부형제와 혼합하여 밀봉되는 알루미늄 파우치에 담아 포장하였다.
이와 같이 제조된 생균제는 사료에 원료로 쓰이는 곡물가루와 혼합하여 사료용 생균제로 활용하거나, 담체 또는 첨가제 등을 혼합하여 정제, 캡슐 등의 의약품, 식품용 생균제로 활용하거나, 화장품에 사용되는 원료에 일정량을 혼합함으로써 화장품용 생균제로 활용하는 등 의약품, 식품, 사료, 사료첨가제, 화장품 등 다양한 분야에 당해 기술분야에서 통상적인 방법에 따라 활용할 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 출원이 속하는 기술분야의 당업자는 본 출원이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 출원의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위, 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 출원의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국미생물보존센터(국외) KCCM12249P 20180413 한국미생물보존센터(국외) KCCM12287P 20180711
<110> CJ CheilJedang Corporation <120> COMPOSITION COMPRISING LACTOBACILLUS PLANTARUM CJLP475 STRAIN AND LACTOBACILLUS PLANTARUM CJLP17 STRAIN AND USE THEREOF <130> KPA180753-KR-P1 <150> KR 10-2018-0081909 <151> 2018-07-13 <160> 2 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1454 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Lactobacillus plantarum CJLP475 <400> 1 acgaactctg gtattgattg gtgcttgcat catgatttac atttgagtga gtggcgaact 60 ggtgagtaac acgtgggaaa cctgcccaga agcgggggat aacacctgga aacagatgct 120 aataccgcat aacaacttgg accgcatggt ccgagtttga aagatggctt cggctatcac 180 ttttggatgg tcccgcggcg tattagctag atggtggggt aacggctcac catggcaatg 240 atacgtagcc gacctgagag ggtaatcggc cacattggga ctgagacacg gcccaaactc 300 ctacgggagg cagcagtagg gaatcttcca caatggacga aagtctgatg gagcaacgcc 360 gcgtgagtga agaagggttt cggctcgtaa aactctgttg ttaaagaaga acatatctga 420 gagtaactgt tcaggtattg acggtattta accagaaagc cacggctaac tacgtgccag 480 cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggatt tattgggcgt aaagcgagcg 540 caggcggttt tttaagtctg atgtgaaagc cttcggctca accgaagaag tgcatcggaa 600 actgggaaac ttgagtgcag aagaggacag tggaactcca tgtgtagcgg tgaaatgcgt 660 agatatatgg aagaacacca gtggcgaagg cggctgtctg gtctgtaact gacgctgagg 720 ctcgaaagta tgggtagcaa acaggattag ataccctggt agtccatacc gtaaacgatg 780 aatgctaagt gttggagggt ttccgccctt cagtgctgca gctaacgcat taagcattcc 840 gcctggggag tacggccgca aggctgaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc 900 ggtggagcat gtggtttaat tcgaagctac gcgaagaacc ttaccaggtc ttgacatact 960 atgcaaatct aagagattag acgttccctt cggggacatg gatacaggtg gtgcatggtt 1020 gtcgtcagct cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttatta 1080 tcagttgcca gcattaagtt gggcactctg gtgagactgc cggtgacaaa ccggaggaag 1140 gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgacctgg gctacacacg tgctacaatg 1200 gatggtacaa cgagttgcga actcgcgaga gtaagctaat ctcttaaagc cattctcagt 1260 tcggattgta ggctgcaact cgcctacatg aagtcggaat cgctagtaat cgcggatcag 1320 catgccgcgg tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacac catgagagtt 1380 tgtaacaccc aaagtcggtg gggtaacctt ttaggaacca gccgcctaag gtgggacaga 1440 tgattagggt gaag 1454 <210> 2 <211> 1333 <212> DNA <213> Unknown <220> <223> Lactobacillus plantarum CJLP17 <400> 2 gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg tattcaccgc ggcatgctga tccgcgatta 60 ctagcgattc cgacttcatg taggcgagtt gcagcctaca atccgaactg agaatggctt 120 taagagatta gcttactctc gcgagttcgc aactcgttgt accatccatt gtagcacgtg 180 tgtagcccag gtcataaggg gcatgatgat ttgacgtcat ccccaccttc ctccggtttg 240 tcaccggcag tctcaccaga gtgcccaact taatgctggc aactgataat aagggttgcg 300 ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac gacacgagct gacgacaacc atgcaccacc 360 tgtatccatg tccccgaagg gaacgtctaa tctcttagat ttgcatagta tgtcaagacc 420 tggtaaggtt cttcgcgtag cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc 480 ccgtcaattc ctttgagttt cagccttgcg gccgtactcc ccaggcggaa tgcttaatgc 540 gttagctgca gcactgaagg gcggaaaccc tccaacactt agcattcatc gtttacggta 600 tggactacca gggtatctaa tcctgtttgc tacccatact ttcgagcctc agcgtcagtt 660 acagaccaga cagccgcctt cgccactggt gttcttccat atatctacgc atttcaccgc 720 tacacatgga gttccactgt cctcttctgc actcaagttt cccagtttcc gatgcacttc 780 ttcggttgag ccgaaggctt tcacatcaga cttaaaaaac cgcctgcgct cgctttacgc 840 ccaataaatc cggacaacgc ttgccaccta cgtattaccg cggctgctgg cacgtagtta 900 gccgtggctt tctggttaaa taccgtcaat acctgaacag ttactcttaa atatgttctt 960 ctttaacaac agagttttac gagccgaaac ccttcttcac tcacggggcg ttgctccatc 1020 agactttcgt ccattgtgga agattcccta ctgctgcctc ccgtaggagt ttgggccgtg 1080 tctcagtccc aatgtggccg attaccctct caggttggct acgtatcatt gccatggtga 1140 gccgttacct caccatctag ctaatacgcc gcgggaccat ccaaaagtga tagccgaagc 1200 catctttcaa actcggacca tgcggtccaa gttgttatgc ggtattagca tctgtttcca 1260 ggtgttatcc cccgcttctg ggcaggtttc ccacgtgtta ctcaccagtt cgccactcac 1320 tcaaatgtaa atc 1333

Claims (28)

  1. (a) 기탁번호 KCCM12287P로 기탁된 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) CJLP475 균주; 및
    (b) 기탁번호 KCCM12249P로 기탁된 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) CJLP17 균주; 를 포함하는, 면역 증강용 약학 조성물.
  2. (a) 기탁번호 KCCM12287P로 기탁된 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) CJLP475 균주; 및
    (b) 기탁번호 KCCM12249P로 기탁된 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) CJLP17 균주; 를 포함하는, 항바이러스용 약학 조성물.
  3. (a) 기탁번호 KCCM12287P로 기탁된 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) CJLP475 균주; 및
    (b) 기탁번호 KCCM12249P로 기탁된 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) CJLP17 균주; 를 포함하는, 사료 또는 사료첨가제용 조성물.
  4. (a) 기탁번호 KCCM12287P로 기탁된 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) CJLP475 균주; 및
    (b) 기탁번호 KCCM12249P로 기탁된 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) CJLP17 균주; 를 포함하는, 식품용 조성물.
  5. (a) 기탁번호 KCCM12287P로 기탁된 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) CJLP475 균주; 및
    (b) 기탁번호 KCCM12249P로 기탁된 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) CJLP17 균주; 를 포함하는, 화장품용 조성물.
  6. (a) 기탁번호 KCCM12287P로 기탁된 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) CJLP475 균주; 및
    (b) 기탁번호 KCCM12249P로 기탁된 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) CJLP17 균주; 를 포함하는, 프로바이오틱스 조성물.
  7. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 내산성, 내담즙성 및 면역증강 활성을 가지며, 면역 세포의 활성화를 촉진하여 사이토카인의 분비량을 증가시키는 것인, 면역 증강용 약학 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 사이토카인은 IL-10, IL-12 및 TGF-beta로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 면역 증강용 약학 조성물.
  9. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 돼지 유행성 설사 바이러스(PEDV)에 대한 항바이러스 활성을 갖는 것인, 항바이러스용 약학 조성물.
  10. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 개체에 투여 시 면역을 증강시키는 것인, 면역 증강용 약학 조성물.
  11. 제10항에 있어서, 상기 개체는 가축 또는 애완동물인 것인, 면역 증강용 약학 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 개체에 투여 시 체내의 항체를 증가시키는 것인, 면역 증강용 약학 조성물.
  13. 제1항에 있어서, 상기 조성물은 개체에 투여 시 그 개체로부터 태어난 자녀 개체의 면역력을 향상시키는 것인, 면역 증강용 약학 조성물.
  14. 제2항에 있어서, 상기 조성물은 개체에 투여 시 그 개체로부터 태어난 자녀 개체의 바이러스 감염 증상을 완화시키는 것인, 항바이러스용 약학 조성물.
  15. 제1항에 있어서, 상기 (a) 및 (b)는 균주 그 자체, 이의 파쇄물, 이의 배양액, 이의 농축액 또는 이의 건조물 형태인, 면역 증강용 약학 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 조성물은 동결보호제 또는 부형제를 추가로 포함하는 것인, 면역 증강용 약학 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 동결보호제는 글리세롤, 트레할로스, 말토덱스트린, 탈지분유 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이고,
    상기 부형제는 포도당, 덱스트린 및 탈지우유로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 면역 증강용 약학 조성물.
  18. 제2항에 있어서, 상기 (a) 및 (b)는 균주 그 자체, 이의 파쇄물, 이의 배양액, 이의 농축액 또는 이의 건조물 형태인, 항바이러스용 약학 조성물.
  19. 제18항에 있어서, 상기 조성물은 동결보호제 또는 부형제를 추가로 포함하는 것인, 항바이러스용 약학 조성물.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 동결보호제는 글리세롤, 트레할로스, 말토덱스트린, 탈지분유 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이고,
    상기 부형제는 포도당, 덱스트린 및 탈지우유로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 항바이러스용 약학 조성물.
  21. 제3항에 있어서, 상기 (a) 및 (b)는 균주 그 자체, 이의 파쇄물, 이의 배양액, 이의 농축액 또는 이의 건조물 형태인, 사료 또는 사료첨가제용 조성물.
  22. 제21항에 있어서, 상기 조성물은 동결보호제 또는 부형제를 추가로 포함하는 것인, 사료 또는 사료첨가제용 조성물.
  23. 제22항에 있어서,
    상기 동결보호제는 글리세롤, 트레할로스, 말토덱스트린, 탈지분유 및 전분으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상이고,
    상기 부형제는 포도당, 덱스트린 및 탈지우유로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인, 사료 또는 사료첨가제용 조성물.
  24. 제1항, 제7항, 제8항, 제10항 내지 제12항, 및 제15항 내지 제17항 중 어느 한 항의 조성물을 인간을 제외한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 면역증강 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 개체는 가축 또는 애완동물인 것인, 개체의 면역증강 방법.
  26. 제2항, 제9항, 및 제18항 내지 제20항 중 어느 한 항의 조성물을 인간을 제외한 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체의 바이러스 감염질환의 예방 또는 치료 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 개체는 가축 또는 애완동물인 것인, 개체의 바이러스 감염질환의 예방 또는 치료 방법.
  28. 기탁번호 KCCM12287P로 기탁된 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) CJLP475 균주를 포함하는 조성물 및 기탁번호 KCCM12249P로 기탁된 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum) CJLP17 균주를 포함하는 조성물을 각각 준비하는 단계;
    상기 CJLP475 균주를 포함하는 조성물과 상기 CJLP17 균주를 포함하는 조성물을 혼합하는 단계;를 포함하는 프로바이오틱스 조성물을 제조하는 방법.
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