CN113521113A - 使用乳酸菌菌株的液态培养物来抗发炎以及治疗发炎性障碍 - Google Patents
使用乳酸菌菌株的液态培养物来抗发炎以及治疗发炎性障碍 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及使用乳酸菌菌株的液态培养物来抗发炎以及治疗发炎性障碍。本发明揭示乳酸菌菌株的液态培养物可被用来抗发炎。本发明也揭示该乳酸菌菌株的液态培养物可被用来治疗发炎性障碍。
Description
技术领域
本发明是有关于使用乳酸菌菌株的液态培养物(liquid culture of lacticacid bacteria strains)来抗发炎(anti-inflammation)。本发明也有关使用该乳酸菌菌株的液态培养物来治疗发炎性障碍(inflammatory disorders)。
背景技术
发炎(inflammation)意指生物体的免疫系统(immune system)为了抵抗外部压力刺激(external stressful stimuli)或病原体(pathogen)的入侵所产生的一种保护反应。在发炎的过程中，受损伤的细胞或组织会释放出大量的趋化激素(chemokines)，使得免疫细胞(immune cells)[诸如多核白血球(polynuclear leukocytes)、单核球(monocytes)、巨噬细胞(macrophages)以及肥大细胞(mast cells)]往受损伤处聚集，接着被活化并通过促进自身的前发炎性基因(proinflammatory genes)[包括环加氧酶-2基因(cyclooxygenase-2gene,COX-2gene)以及诱导性一氧化氮合成酶基因(inducible nitricoxide synthase gene,iNOS gene)]的表现来生成各种前发炎性细胞激素(proinflammatory cytokines)[诸如介白素-1(interleukin-1,IL-1)、IL-6、IL-12、IL-18、IL-1α、IL-1β、干扰素-γ(interferon-γ,IFN-γ)以及肿瘤坏死因子-α(tumornecrosis factor-α,TNF-α)]，以加强发炎反应。然而，当发炎反应持续过久时会使得这些前发炎性细胞激素累积过多而对细胞或组织造成损害。此时，免疫细胞[诸如调节性T细胞(regulatory T cells,Tregs)]便会通过生成各种抗发炎性细胞激素(anti-inflammatorycytokines)[也被称为免疫调节性细胞激素(immunoregulatory cytokines)][诸如IL-10以及转变生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)]来抑制前发炎性细胞激素的表现，进而维持免疫系统的平衡，而此即为免疫调节(immunoregulation)的重要机制。
然而，当免疫调节失调时会使得生物体因过度的发炎反应而造成发炎性障碍(inflammatory disorders)，常见的发炎性障碍包括自体免疫疾病(autoimmune disease)[诸如全身性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus)、类风湿性关节炎(rheumatoidarthritis)、牛皮癣(psoriasis)、多发性硬化症(multiple sclerosis)、炎症性肠病(inflammatory bowel disease)、格雷氏病(Graves'disease)、乳糜泻(celiac disease)以及第1型糖尿病(type 1diabetes mellitus)]以及过敏(allergy)。
近年来，通过抑制免疫细胞的活化、降低各种前发炎性细胞激素的生成或者刺激各种抗发炎性细胞激素的生成来缓解发炎反应已经成为全球研究抗发炎药物(anti-inflammatory drugs)的重要方向之一。然而，现今西方医学中所使用的免疫抑制药物(immunosuppressive drugs)[诸如环孢素(cyclosporin)]以及抗发炎药物[诸如皮质类固醇(corticosteroids)]在临床应用上存在有疗效不佳以及容易产生副作用(side effect)的问题。因此，本领域的相关研究人员皆致力于发展出可以有效地抗发炎并且不会产生非所欲的副作用的药物。
乳酸菌(lactic acid bacteria,LAB)是属于一般被公认为安全的(generallyrecognized as safe,GRAS)并且是为人所熟悉与广泛使用的益生菌(probiotics)。常见的乳酸菌包括：乳杆菌属(Lactobacillus)、乳球菌属(Lactococcus)、小球菌属(Pediococcus)、肠球菌属(Enterococcus)、链球菌属(Streptococcus)、双歧杆菌属(Bifidobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)以及明串珠菌属(Leuconostoc)等。
已有许多研究指出，乳酸菌具有缓和乳糖不耐症(lactose intolerance)、抗菌(anti-bacterial)、抗疲劳(anti-fatigue)、抗癌(anti-cancer)以及降血压(antihypertension)等功效。例如，申请人于“益生菌：技术及产业化－第十二届益生菌与健康国际研讨会”所发表的研讨会论文[名称：不同乳酸菌代谢化合物对抗阴道病原菌之比较及其女性生殖道抗菌产品之开发(Comparison of the inhibition effect of lacticacid bacteria fermentation metabolites on different vaginal pathogens anddeveloping gynecological probiotic products)]中，谢佩珊等人将不同的乳酸菌菌株{包括植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LPL28以及乳酸双歧杆菌(Bifidobacteriumlactis)CP-9[又被称为动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)CP-9]}的乳清上清液以及发酵液拿来进行关于生殖道病原菌的抗菌能力测试。实验结果显示，这些乳酸菌菌株皆具有良好的抗菌效用。
在Lee M.C.et al.(2019),Nutrients,doi:10.3390/nu11092003中，Lee M.C.等人对小鼠投药以长双歧杆菌长型亚种(Bifidobacterium longum subsp.longum)OLP-01，继而将该小鼠拿来进行身体性能测试(physical performance tests)[包括抓力(gripstrength)以及耐久时间(endurance time)]，并在该小鼠运动后测量其与疲劳(fatigue)和损伤(injury)有关的生化指标(biochemical indicators)[包括乳酸、血尿素氮(bloodurea nitrogen,BUN)以及肌酸激酶(creatine kinase,CK)]的水平。实验结果显示，长双歧杆菌长型亚种OLP-01能够有效地提升小鼠的抓力与耐力，并且也能够降低与疲劳和损伤有关的生化指标的水平，因而具有健康促进(health-promoting)、性能改善(performance-improving)以及疲劳减缓(fatigue-ameliorating)的功效。
在Wong C.B.et al.(2003),J.Funct.Foods,54:506-519中，Wong C.B.等人经由活体内动物实验而发现到长双歧杆菌长型亚种BB536可以有效地刺激前发炎性细胞激素(包括IL-6、IL-1β以及TNF-α)的生成，并借此增强宿主对抗癌细胞的免疫反应，进而达到抗癌的效用。
经研究，申请人意外地发现，植物乳杆菌LPL28(又被称为植物乳杆菌CGMCCNO.17954)、乳酸双岐杆菌CP-9(又被称为动物双歧杆菌乳亚种CCTCC M 2014588)以及长双歧杆菌长型亚种OLP-01(又被称为长双歧杆菌长双歧亚种CGMCC NO.17345)的液态培养物具有优异的抗发炎效用，因而被预期可供用于抗发炎以及治疗发炎性障碍。
发明内容
于是，在第一个方面，本发明提供一种乳酸菌菌株的液态培养物供应用于制备用来抗发炎的医药品的用途，其中该乳酸菌菌株选自于由下列所构成的群组：植物乳杆菌LPL28(CGMCC NO.17954)、动物双歧杆菌乳亚种CP-9(CCTCC M 2014588)、长双歧杆菌长双歧亚种OLP-01(CGMCC NO.17345)，以及它们的组合。
在第二个方面，本发明提供一种用于治疗具有或被怀疑具有发炎的个体的方法，其包括对该个体投予如上所述的乳酸菌菌株的液态培养物。
在第三个方面，本发明提供一种乳酸菌菌株的液态培养物供应用于制备用来治疗发炎性障碍的医药品的用途，其中该乳酸菌菌株选自于由下列所构成的群组：植物乳杆菌LPL28(CGMCC NO.17954)、动物双歧杆菌乳亚种CP-9(CCTCC M 2014588)、长双歧杆菌长双歧亚种OLP-01(CGMCC NO.17345)，以及它们的组合。
在第四个方面，本发明提供一种用于治疗具有或被怀疑具有发炎性障碍的个体的方法，其包含有对该个体投予如上所述的乳酸菌菌株的液态培养物。
本发明所述的用途，该液态培养物是实质上不含有菌体的流体。
本发明所述的用途，该医药品呈供口服投药的剂型。
本发明所述的用途，该医药品呈供局部投药的剂型。
本发明所述的用途，该医药品进一步包含有至少一种选自于下列群组中的益生菌：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)TYCA06(CGMCC NO.15210)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)GL-104(CCTCC M 209138)、唾液乳杆菌水杨苷亚种(Lactobacillus salivarius subsp.salicinius)AP-32(CCTCC M 2011127)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)F-1(CCTCC M 2011124)、长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)BLI-02(CGMCC NO.15212)，以及它们的组合。
附图说明
下面结合附图及实施例来对本发明进行详细说明，所以本发明在上述以及其他目的与特征，可借由参照下文的描述、随文检附的权利要求书和伴随的图式而变得更为明显，附图中：
图1显示人类PBMCs细胞被处理以不同种的乳酸菌菌株的培养滤液后所测得的IL-10浓度(pg/mL)，其中正常对照组表示未经任何处理的细胞；正对照组表示被处理以200ng/mL的植物血球凝集素(phytohemagglutinin,PHA)的细胞；实验组1至5分别表示被处理以30g/L的植物乳杆菌LPL28(CGMCC NO.17954)、动物双歧杆菌乳亚种CP-9(CCTCC M2014588)、长双歧杆菌长双歧亚种OLP-01(CGMCC NO.17345)、双歧型双歧杆菌gL-306以及短型双歧杆菌gL-57的培养滤液的细胞；以及“***”表示：当与正对照组作比较，p＜0.001；以及
图2显示人类PBMCs细胞被处理以不同种的乳酸菌菌株的培养滤液后所测得的TGF-β浓度(pg/mL)，其中正常对照组表示未经任何处理的细胞；实验组1至5分别表示被处理以30g/L的植物乳杆菌LPL28(CGMCC NO.17954)、动物双歧杆菌乳亚种CP-9(CCTCC M2014588)、长双歧杆菌长双歧亚种OLP-01(CGMCC NO.17345)、双歧型双歧杆菌gL-306以及短型双歧杆菌gL-57的培养滤液的细胞；以及“***”表示：当与正常对照组作比较，p＜0.001。
具体实施方式
为了本说明书的目的，将被清楚地了解的是：文字“包含有(comprising)”意指“包含但不限于”，以及文字“包括(comprises)”具有对应的意义。
除非另外有所定义，在本文中所使用的所有技术性与科学术语具有本领域技术人员所共同了解的意义。本领域技术人员会认知到许多与那些被描述于本文中者相似或等效的方法和材料，它们可被用于实施本发明。当然，本发明决不受到所描述的方法和材料的限制。
在开发可用于抗发炎的药物上，申请人意外地发现，植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)LPL28(CGMCC NO.17954)、动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalissubsp.lactis)CP-9(CCTCC M 2014588)以及长双歧杆菌长双歧亚种(Bifidobacteriumlongum subsp.longum)OLP-01(CGMCC NO.17345)的液态培养物(liquid culture)可以有效地刺激人类周边血液单核细胞(human peripheral blood mononuclear cells,humanPBMCs)分泌抗发炎性细胞激素(anti-inflammatory cytokines)[包括介白素-10(interleukin-10,IL-10)以及转变生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)]来达到抗发炎的效用，且其效用明显优于双歧型双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)gL-306以及短型双歧杆菌(Bifidobacterium breve)gL-57所具有的效用。因此，申请人认为：植物乳杆菌LPL28(CGMCC NO.17954)、动物双歧杆菌乳亚种CP-9(CCTCC M 2014588)以及长双歧杆菌长双歧亚种OLP-01(CGMCC NO.17345)的液态培养物具有发展成为抗发炎药物的高潜力。于是，本发明提供一种乳酸菌菌株的液态培养物供应用于制备用来抗发炎的医药品的用途，其中该乳酸菌菌株选自于由下列所构成的群组：植物乳杆菌LPL28(CGMCCNO.17954)、动物双歧杆菌乳亚种CP-9(CCTCC M 2014588)、长双歧杆菌长双歧亚种OLP-01(CGMCC NO.17345)，以及它们的组合。
依据本发明，该液态培养物通过将植物乳杆菌LPL28(CGMCC NO.17954)、动物双歧杆菌乳亚种CP-9(CCTCC M 2014588)以及长双歧杆菌长双歧亚种OLP-01(CGMCC NO.17345)培养于适于这些菌株生长的液态培养基中而被获得。
如本文中所使用的，术语“培养(culturing)”、“发酵(fermentation)”以及“培育(cultivation)”可被交换地使用。
依据本发明，适用于培养这些菌株的液态培养基是熟习此项技艺者所熟知的，这包括，但不限于：MRS肉汤培养基(MRS broth)，以及含有牛奶乳清的培养基(mediumcontaining milk whey,MMW)。
依据本发明，适用于本发明的液态培养基包含有选自于由下列所构成的群组中的碳源(carbon source)：葡萄糖(glucose)、果糖(fructose)、乳糖(lactose)、蔗糖(sucrose)、麦芽糖(maltose)、半乳糖(galactose)、甘露糖(mannose)、海藻糖(trehalose)、淀粉(starch)、糖蜜(molasses)、马铃薯淀粉(potato starch)、玉米淀粉(corn starch)、麦芽萃取物(malt extract)、麦芽糊精(maltodextrin)，以及它们的组合。较佳地，该液态培养基包含有2-5％的葡萄糖-麦芽糊精的混合物。在本发明的一个较佳具体例中，该液态培养基包含有3％的葡萄糖-麦芽糊精的混合物。
依据本发明，适用于本发明的液态培养基包含有选自于由下列所构成的群组中的氮源(nitrogen source)：(NH4)2SO4、(NH4)3PO4、NH4NO3、NH4Cl、酪蛋白胺基酸(casaminoacid)、尿素(urea)、蛋白胨(peptone)、聚蛋白胨(polypeptone)、胰化胨(tryptone)、肉类萃取物(meat extract)、酵母萃取物(yeast extract)、酵母粉(yeast powder)、牛奶、大豆粉(soybean flour)、乳清，以及它们的组合。较佳地，该液态培养基包含有5-30％牛奶以及1-10％大豆粉。
有关培养的操作过程与参数条件等落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。在此方面，可以参考，例如，Hsieh P.S.et al.(2013),New Microbiol.,36:167-179。
依据本发明，该培养在范围落在25℃至40℃内的温度下被进行。在本发明的一个较佳具体例中，该培养于37℃下被进行。
依据本发明，该培养被进行历时一段范围落在20至40小时内的时间。在本发明的一个较佳具体例中，该培养被进行历时24小时。
依据本发明，该液态培养物可含有109CFU/mL以下的菌体。较佳地，该液态培养物是实质上不含有菌体的流体。
如本文中所使用的，术语“实质上不含有(substantially free of)”意指被具体指明的组分缺少有意义的含量。较佳地，该组分的含量对于该液态培养物的性质不具有可测量的影响(measurable effect)。更佳地，该液态培养物完全不含有该组分。
依据本发明，该实质上不含有菌体的流体通过对该液态培养物进行分离处理而被获得。
依据本发明，该分离处理选自于下列所构成的群组：离心处理(centrifugationtreatment)、浓缩处理(concentration treatment)，以及它们的组合。
在本发明的一个较佳具体例中，该不含有菌体的流体是通过对该液态培养物进行离心处理而被获得。
依据本发明，该液态培养物进一步被进行干燥处理，而得到呈粉末状的产物。
依据本发明，该医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成适合于口服投药(oral administration)或局部投药(topical administration)的剂型(dosageform)。
依据本发明，该医药品可进一步包含有被广泛地使用于药物制造技术的药学上可接受的载剂(pharmaceutically acceptable carrier)。例如，该药学上可接受的载剂可包含一种或多种选自于下列的试剂：溶剂(solvent)、缓冲液(buffer)、乳化剂(emulsifier)、悬浮剂(suspending agent)、分解剂(decomposer)、崩解剂(disintegrating agent)、分散剂(dispersing agent)、粘结剂(binding agent)、赋形剂(excipient)、稳定剂(stabilizing agent)、螯合剂(chelating agent)、稀释剂(diluent)、胶凝剂(gellingagent)、防腐剂(preservative)、润湿剂(wetting agent)、润滑剂(lubricant)、吸收延迟剂(absorption delaying agent)、脂质体(liposome)以及类似物。有关这些试剂的选用与数量落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
依据本发明，该医药品可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成适合于口服投药的剂型，这包括，但不限于：无菌的粉末、锭剂(tablet)、片剂(troche)、口含锭(lozenge)、丸剂(pellet)、胶囊(capsule)、分散性粉末(dispersible powder)或细颗粒(granule)、溶液、悬浮液(suspension)、乳剂(emulsion)、糖浆(syrup)、浓浆(slurry)、滴剂(drop)以及类似物。
依据本发明，该医药品也可利用熟习此技艺者所详知的技术而被制造成适合于局部地施用于皮肤上的外部制剂(external preparation)，这包括，但不限于：乳剂(emulsion)、凝胶(gel)、软膏(ointment)、乳霜(cream)、贴片(patch)、擦剂(liniment)、粉末(powder)、气溶胶(aerosol)、喷雾(spray)、乳液(lotion)、乳浆(serum)、糊剂(paste)、泡沫(foam)、滴剂(drop)、悬浮液(suspension)、油膏(salve)以及绷带(bandage)。
依据本发明，该医药品可进一步包含有至少一种选自于下列群组中的益生菌：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)TYCA06(CGMCC NO.15210)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)GL-104(CCTCC M 209138)、唾液乳杆菌水杨苷亚种(Lactobacillus salivarius subsp.salicinius)AP-32(CCTCC M 2011127)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)F-1(CCTCC M 2011124)、长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)BLI-02(CGMCC NO.15212)，以及它们的组合。
本发明也提供一种用于治疗具有或被怀疑具有发炎的个体的方法，其包括对该个体投予(administering)如上所述的乳酸菌菌株的液态培养物。
如本文中所使用的，术语“投予(administering)”以及“投药”可被交换地使用。
如本文中所使用的，“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”意指预防(preventing)、减少(reducing)、减轻(alleviating)、改善(ameliorating)、缓解(relieving)、或控制(controlling)疾病(disease)或障碍(disorder)的一个或多个临床征兆(clinical sign)，以及降低(lowering)、停止(stopping)或逆转(reversing)正在被治疗中的病况(condition)或症状(symptom)的严重性(severity)的进展(progression)。
依据本发明，该乳酸菌菌株的液态培养物的投药剂量与投药次数会视下列因素而变化：要被改善的疾病的严重性，投药途径，以及要被改善的个体的体重、年龄、身体状况与反应。而有关投药剂量与投药次数的选择是落在熟习此项技术的人士的专业素养与例行技术范畴内。
本发明也提供一种乳酸菌菌株的液态培养物供应用于制备用来治疗发炎性障碍(inflammatory disorders)的医药品的用途，其中该乳酸菌菌株选自于由下列所构成的群组：植物乳杆菌LPL28(CGMCC NO.17954)、动物双歧杆菌乳亚种CP-9(CCTCC M 2014588)、长双歧杆菌长双歧亚种OLP-01(CGMCC NO.17345)，以及它们的组合。
依据本发明，该发炎性障碍包括，但不限于：自体免疫疾病(autoimmunedisease)、过敏(allergy)、器官移植排斥(organ transplant rejection)，以及它们的组合。较佳地，该发炎性障碍是选自于由下列所构成的群组中的自体免疫疾病：全身性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)、牛皮癣(psoriasis)、多发性硬化症(multiple sclerosis)、炎症性肠病(inflammatory boweldisease)、格雷氏病(Graves'disease)、乳糜泻(celiac disease)、第1型糖尿病(type1diabetes mellitus)。
本发明也提供一种用于治疗具有或被怀疑具有发炎性障碍的个体的方法，其包含有对该个体投予如上所述的乳酸菌菌株的液态培养物。
依据本发明，该乳酸菌菌株的液态培养物的投药剂型、投药途径以及可供使用的药学上可接受的载剂如上面所述。
本发明将就下面的实施例来做进一步说明，但应了解的是，所述实施例只是供例示说明用，而不应被解释为本发明的实施上的限制。
<实施例>
一般实验方法：
1.统计学分析(statistical analysis)：
在下面的实施例中，各组的实验被重复3次，而实验数据以“平均值(mean)±平均值的标准误差(standard error of the mean,SEM)”来表示。所有的数据通过双尾史徒登氏t-试验(two-tailed Student’s t-test)来作分析，用来评估各组间的差异性。若所得到的统计分析结果是p<0.05，这表示有统计学显著性(statistical significance)。
实施例1.乳酸菌菌株的培养滤液(culture filtrate)在活体外抗发炎效用(invitro anti-inflammatory effect)上的评估
在本实施例中，不同种的乳酸菌菌株的培养滤液被拿来与人类周边血液单核细胞(human peripheral blood mononuclear cells,human PBMCs)进行培养，并选用介白素-10(interleukin-10,IL-10)以及转变生长因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)来作为评估抗发炎性细胞激素(anti-inflammatory cytokines)的表现量的指标，进而评估各种乳酸菌菌株的培养滤液在活体外的抗发炎效用。
实验材料：
1.人类PBMCs细胞的制备：
20至40岁的健康人类志愿者是来自于丰华生物科技股份有限公司(GLAC BIOTECHCO.,LTD.)的员工。
对健康人类志愿者进行血液的抽取，并以柠檬酸葡萄糖(ACD)溶液[acid citratedextrose(ACD)solution]作为抗凝血剂(anticoagulants)。接着，添加至Ficoll-PaqueTMPLUS的离心管中并于4℃下以720g来进行密度-梯度离心(density-gradientcentrifugation)历时30分钟，然后收取淋巴细胞层(lymphocyte layer)。之后，以红血球溶解缓冲溶液(RBC lysis buffer)来溶解红血球，继而于4℃下以3,000rpm来进行离心历时10分钟以除去残存的红血球。而由此所得到的人类PBMCs细胞以含有10％FBS的RPMI1640培养基来调整细胞浓度至4×106细胞/mL备用。
2.在下面实验中所使用的乳酸菌菌株已分别被寄存于中国台湾的食品工业发展研究所(Food Industry Research and Development Institute,FIRDI)的生物资源保存及研究中心(Bioresource Collection and Research Center,BCRC)(300新竹市食品路331号，中国台湾)、中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General MicrobiologicalCulture Collection Center,CGMCC)以及中国典型培养物保藏中心(China Center forType Culture Collection,CCTCC)，并且公众可获得。为表清楚，各个乳酸菌菌株的相关资讯(包括：学名、寄存编号以及寄存日期等)已被整合于下面表1中。
表1.各个乳酸菌菌株的寄存编号与寄存日期
3.在下面实验中所使用的双歧型双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)gL-306以及短型双歧杆菌(Bifidobacterium breve)gL-57是申请人从人类的母乳中所分离出。
4.各种乳酸菌菌株的培养滤液的制备：
首先，将上面第2与3项当中所述的5种乳酸菌菌株分别接种至MRS肉汤培养基(MRSbroth)(BD Biosciences)中，并于37℃下进行培养历时约20-24小时，所形成的培养物被使用作为接种源(inoculum)。接着，将各种乳酸菌菌株的接种源分别以约为1-3％(v/v)的接种量接种至添加有5-30％牛奶、1-10％大豆粉以及3％的葡萄糖-麦芽糊精的混合物的MRS肉汤培养基中，并于37℃下进行培养历时24小时。之后，于约3,000-6,000rpm下进行离心历时60分钟使菌体沉淀，然后收集上清液并进行加热灭菌处理，借此而分别得到植物乳杆菌LPL28(CGMCC NO.17954)、动物双歧杆菌乳亚种CP-9(CCTCC M 2014588)、长双歧杆菌长双歧亚种OLP-01(CGMCC NO.17345)、双歧型双歧杆菌gL-306以及短型双歧杆菌gL-57的培养滤液。
在进行下面的实验前，申请人有先对各种乳酸菌菌株的培养滤液进行喷雾干燥处理(spray-drying treatment)，然后以适量的RPMI 1640培养基予以溶解并将浓度调整为30g/L。
实验方法：
A、对人类PBMCs细胞进行乳酸菌菌株的培养滤液的处理：
首先，将依据上面“实验材料”的第1项当中所得到的人类PBMCs细胞分成7组，其中包括1个正常对照组(normal control)、1个正对照组(positive control)以及5个实验组(也就是实验组1至5)。将各组细胞分别以1×105细胞/孔的数量培养于含有0.2mL的RPMI1640培养基[添加有10％FBS以及1％盘尼西林-链霉素(penicillin-streptomycin,PS)]的96-孔培养盘(96-well plate)中，并在培养箱(37℃，5％CO2)中进行培养历时48小时。
接着，将这些实验组的培养基更换以添加有30g/L的如下面表2所示的乳酸菌菌株的培养滤液的RPMI 1640培养基。至于正对照组的培养基则被更换以添加有200ng/mL的植物血球凝集素(phytohemagglutinin,PHA)的RPMI 1640培养基，而正常对照组的培养基则被更换以无添加的RPMI 1640培养基。
表2.各个实验组的细胞培养物所处理的乳酸菌菌株的培养滤液
各组细胞在培养箱(37℃，5％CO2)中进行培养历时48小时后，将所形成的培养物于3,000rpm下进行离心历时10分钟，继而收取上清液并将之拿来进行下面第B与C项的分析。
B、IL-10的浓度测定：
有关正常对照组、正对照组以及各个实验组的上清液的IL-10浓度测定是使用IL-10ELISA试剂盒(Cat.No.88-7106-88,eBioscience)并依据制造商的操作指南来进行。各组所测得的吸光值分别根据预先以具有不同已知浓度的IL-10标准品相对于它们自身的吸光值所作出的标准曲线而被换算成其浓度(pg/mL)。
之后，依照上面“一般实验方法”的第1项“统计学分析”当中所述的方法来分析所得到的实验数据。
C、TGF-β的浓度测定：
有关正常对照组以及各个实验组的上清液的TGF-β浓度测定是使用TGF-βELISA试剂盒(Cat.No.88-8350-88,eBioscience)并依据制造商的操作指南来进行。各组所测得的吸光值分别根据预先以具有不同已知浓度的TGF-β标准品相对于它们自身的吸光值所作出的标准曲线而被换算成其浓度(pg/mL)。
之后，依照上面“一般实验方法”的第1项“统计学分析”当中所述的方法来分析所得到的实验数据。
结果：
A、IL-10的浓度测定：
图1显示人类PBMCs细胞被处理以不同种的乳酸菌菌株的培养滤液后所测得的IL-10浓度。从图1可见，与正常对照组相较下，实验组1至3的IL-10浓度皆有明显的升高并且显著高于正对照组所具有的浓度，至于实验组4与5的IL-10浓度皆有明显的降低。这个实验结果显示：只有植物乳杆菌LPL28(CGMCC NO.17954)、动物双歧杆菌乳亚种CP-9(CCTCC M2014588)以及长双歧杆菌长双歧亚种OLP-01(CGMCC NO.17345)的培养滤液能够有效地活化人类PBMCs细胞而刺激其分泌IL-10。
B、TGF-β的浓度测定：
图2显示人类PBMCs细胞被处理以不同种的乳酸菌菌株的培养滤液后所测得的TGF-β浓度。从图2可见，与正常对照组相较下，实验组1至3的TGF-β浓度皆有显著的升高，而实验组4与5的TGF-β浓度则没有显著的差异性。这个实验结果显示：只有植物乳杆菌LPL28(CGMCC NO.17954)、动物双歧杆菌乳亚种CP-9(CCTCC M 2014588)以及长双歧杆菌长双歧亚种OLP-01(CGMCC NO.17345)的培养滤液能够有效地活化人类PBMCs细胞而刺激其分泌TGF-β。
综合以上的实验结果可知，植物乳杆菌LPL28(CGMCC NO.17954)、动物双歧杆菌乳亚种CP-9(CCTCC M 2014588)以及长双歧杆菌长双歧亚种OLP-01(CGMCC NO.17345)的培养滤液可有效地刺激人类PBMCs细胞分泌IL-10以及TGF-β，进而通过免疫调节来达到优异的抗发炎效用。因此，申请人认为：植物乳杆菌LPL28(CGMCC NO.17954)、动物双歧杆菌乳亚种CP-9(CCTCC M 2014588)以及长双歧杆菌长双歧亚种OLP-01(CGMCC NO.17345)的培养滤液具有发展成为抗发炎药物的高潜力，而被预期可供应用于治疗发炎性障碍(inflammatorydisorders)。
于本说明书中被引述的所有专利和文献以其整体被并入本申请作为参考资料。若有所冲突时，本申请详细说明(包含界定在内)将占上风。
虽然本发明已参考上述特定的具体例被描述，明显地在不背离本发明的范围和精神下可作出很多的修改和变化。因此意欲的是，本发明只受如随文检附的权利要求书所示者的限制。
生物材料保藏信息说明
保藏编号：CCTCC NO：M 209138
分类命名：罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)GL-104
保藏日期：2009年8月7日
保藏单位：中国典型培养物保藏中心
保藏单位地址：中国武汉
保藏编号：CCTCC NO：M 2011124
分类命名：鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)F-1
保藏日期：2011年4月10日
保藏单位：中国典型培养物保藏中心
保藏单位地址：中国武汉
保藏编号：CCTCC NO：M 2011127
分类命名：唾液乳杆菌水杨苷亚种(Lactobacillus salivariussubsp.salicinius)AP-32
保藏日期：2011年4月10日
保藏单位：中国典型培养物保藏中心
保藏单位地址：中国武汉
保藏编号：CCTCC NO：M 2014588
分类命名：动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalis subsp.lactis)CP-9
保藏日期：2014年11月24日
保藏单位：中国典型培养物保藏中心
保藏单位地址：中国武汉
保藏编号：CGMCC No.15210
分类命名：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)TYCA06
保藏日期：2018年1月15日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：中国北京
保藏编号：CGMCC No.15212
分类命名：长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)BLI-02
保藏日期：2018年1月15日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：中国北京
保藏编号：CGMCC No.17345
分类命名：长双歧杆菌长双歧亚种(Bifidobacterium longum subsp.longum)OLP-01
保藏日期：2019年3月18日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：中国北京
保藏编号：CGMCC No.17954
分类命名：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LPL28
保藏日期：2019年6月18日
保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏单位地址：中国北京
Claims (6)
1.一种乳酸菌菌株的液态培养物供应用于制备用来抗发炎的医药品的用途，其特征在于：所述乳酸菌菌株选自于由下列所构成的群组：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)LPL28(CGMCC NO.17954)、动物双歧杆菌乳亚种(Bifidobacterium animalissubsp.lactis)CP-9(CCTCC M 2014588)、长双歧杆菌长双歧亚种(Bifidobacteriumlongum subsp.longum)OLP-01(CGMCC NO.17345)，以及它们的组合。
2.一种乳酸菌菌株的液态培养物供应用于制备用来治疗发炎性障碍的医药品的用途，其特征在于：所述乳酸菌菌株选自于由下列所构成的群组：植物乳杆菌LPL28(CGMCCNO.17954)、动物双歧杆菌乳亚种CP-9(CCTCC M 2014588)、长双歧杆菌长双歧亚种OLP-01(CGMCC NO.17345)，以及它们的组合。
3.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述液态培养物是实质上不含有菌体的流体。
4.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述医药品呈供口服投药的剂型。
5.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述医药品呈供局部投药的剂型。
6.根据权利要求1或2所述的用途，其特征在于：所述医药品进一步包含有至少一种选自于下列群组中的益生菌：嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)TYCA06(CGMCCNO.15210)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)GL-104(CCTCC M 209138)、唾液乳杆菌水杨苷亚种(Lactobacillus salivarius subsp.salicinius)AP-32(CCTCC M2011127)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)F-1(CCTCC M 2011124)、长双歧杆菌婴儿亚种(Bifidobacterium longum subsp.infantis)BLI-02(CGMCC NO.15212)，以及它们的组合。
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