CN114317343A - 一种植物乳杆菌及其在预防和/或治疗中枢神经系统疾病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种植物乳杆菌在缓解和治疗多发性硬化中的应用。本发明分离得到植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Pm005，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2021928。植物乳杆菌Pm005菌经由活体内及体外的相关实验证实，植物乳杆菌Pm005菌对中枢神经系统炎症性脱髓鞘疾病(包括多发性硬化、视神经脊髓炎以及急性散播性脑脊髓炎)具有优异的抵抗力，且无毒副作用，具有重要的应用价值。

Description

一种植物乳杆菌及其在预防和/或治疗中枢神经系统疾病中 的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种植物乳杆菌及其在预防和/或治疗中枢神经系统疾病中的应用。

背景技术

多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是一种以中枢神经系统白质炎性脱髓鞘病变为主要特点的自身免疫病，是由于脊髓和大脑中的神经细胞遭到自身免疫细胞的攻击而产生的与中枢神经系统(CNS)炎症相关的炎症性疾病，以髓鞘崩解和脱失、少突胶质细胞变性增生及血管周围炎性细胞浸润为其主要病理特征，以疲劳、痉挛、共济失调、虚弱、膀胱和肠紊乱、性功能障碍、疼痛、颤动、阵发性表现、视觉障碍、心理问题和认知障碍为其主要临床表现。MS至今尚无有效的治愈方法。

目前用于治疗多发性硬化的药物多为激素类，免疫抑制剂和免疫调节剂，这些药物对MS的重症患者通常无效，另外，激素类的药物副作用较大，会引起水、盐、糖、蛋白质及脂肪代谢紊乱，而且还可能会出现肥胖、多毛、无力等副作用。

专利文件CN113336862A公开了一种抗多发性硬化的重组蛋白及其制备方法和用途，所述重组蛋白包括结核分枝杆菌热休克蛋白65与6段串联重复的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白第33-55位的具有多发性硬化自身免疫抗原特征的抗原表位多肽，通过改变免疫方式及诱导针对性地免疫调节，可以对自身抗原产生免疫耐受的药物成分，用于抗多发性硬化。

专利文件CN111481674A公开了TRPA1的抑制剂在制备治疗多发性硬化症药物中的应用，所述的TRPA1抑制剂可用于制备治疗溶血磷脂酰胆碱(LPC)引起的多发性硬化症药物，通过建立基于OLN-93少突胶质细胞的细胞损伤模型，探究TRPA1参与LPC引起的氧化应激及细胞损伤反应。研究结果表明，可以使用TRPA1的抑制剂来治疗LPC引起的多发性硬化症等脱髓鞘性疾病。

现有技术中有循证医学论据支持的药物相当有限，并且价格昂贵，治疗效果有限且可能带来较大的副作用，而且现有技术并未明确如何通过微生物菌群来治疗和预防MS疾病，因此研究开发能够安全、有效的预防和治疗多发性硬化的药物，以消除患者体内的神经免疫炎症的异常，对于临床治疗多发性硬化具有重要指导意义。

发明内容

本发明克服了现有中枢神经系统疾病治疗药物的缺陷和不足，提供了一种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Pm005在缓解和治疗中枢神经系统疾病应用。

在本发明第一方面，提供一种植物乳杆菌Pm005，其保藏编号为CCTCC NO：M2021928。

在本发明第二方面，提供一种药物组合物，其包含植物乳杆菌Pm005、其培养物、其裂解物或其提取物，以及一种或多种药学上可接受的辅料。

特别是，该药物组合物包含植物乳杆菌Pm005以及一种或多种药学上可接受的辅料。

具体地，在该药物组合物中，植物乳杆菌Pm005为活菌或非活菌，特别是活菌。

具体地，该药学上可接受的辅料可以为，例如，但不限于，填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂、香味剂、着色剂、包衣剂、酸度调节剂、防腐剂、稀释剂、悬浮液稳定剂等中的一种或多种。

具体地，该药物组合物可以为任何合适的剂型，特别是口服剂型，例如，液体制剂(如乳剂、混悬剂、糖浆剂等)、固体制剂(如粉剂、片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊剂、锭剂等)，等。

在本发明的一些实施例中，该药物组合物为液体制剂，其中植物乳杆菌Pm005为活菌，其有效活菌数≥1×10⁹CFU/mL，例如，1×10⁹至10×10⁹CFU/mL，5×10⁹CFU/mL。

在本发明第三方面，提供植物乳杆菌Pm005、其培养物、其裂解物或其提取物在制备预防和/或治疗中枢神经系统疾病的药物中的应用。具体地，该中枢神经系统疾病为中枢神经系统炎症性脱髓鞘疾病。

具体地，所述中枢神经系统炎症性脱髓鞘疾病为多发性硬化、视神经脊髓炎或急性散播性脑脊髓炎，优选为多发性硬化。

具体地，所述多发性硬化包括复发缓解型MS、继发进展型MS、原发进展型MS和进展复发型MS。

具体地，该多发性硬化的症状选自：疲劳、痉挛、共济失调、虚弱、膀胱和肠紊乱、性功能障碍、疼痛、颤动、阵发性表现、视觉障碍、心理问题和认知障碍中的一种或多种。

具体地，治疗作用可以为，改善上述多发性硬化症状中的一种或多种，降低多发性硬化的复发率，甚至完全治愈多发性硬化。

具体地，预防作用可以为，改善上述多发性硬化症状中的一种或多种，降低多发性硬化的发生率，甚至完全避免多发性硬化。

在本发明第四方面，提供一种预防和/或治疗中枢神经系统疾病的方法，其包括向有此需求的受试者施用植物乳杆菌Pm005、其培养物、其裂解物或其提取物(特别是植物乳杆菌Pm005活菌)，或本发明第二方面所述药物组合物的步骤。

具体地，该中枢神经系统疾病为中枢神经系统炎症性脱髓鞘疾病。

具体地，所述中枢神经系统炎症性脱髓鞘疾病为多发性硬化、视神经脊髓炎或急性散播性脑脊髓炎，优选为多发性硬化。

具体地，所述多发性硬化包括复发缓解型MS、继发进展型MS、原发进展型MS和进展复发型MS。

具体地，该多发性硬化的症状选自：疲劳、痉挛、共济失调、虚弱、膀胱和肠紊乱、性功能障碍、疼痛、颤动、阵发性表现、视觉障碍、心理问题和认知障碍中的一种或多种。

具体地，治疗作用可以为，改善上述多发性硬化症状中的一种或多种，降低多发性硬化的复发率，甚至完全治愈多发性硬化。

具体地，该受试者可以为哺乳动物，例如，人类、家畜(如猪、牛、羊、马、驴、狐、貉、貂、骆驼等)、宠物(如狗、猫、兔、鼠(如豚鼠、仓鼠、沙鼠、龙猫、松鼠等))、实验动物(如猴、狗、兔、猫、鼠(如小鼠、大鼠)等)等，特别是人类。

本发明的植物乳杆菌Pm005对中枢神经系统炎症性脱髓鞘疾病，尤其是多发性硬化、视神经脊髓炎或急性散播性脑脊髓炎具有优异的抵抗力，且无毒副作用，具有重要的应用价值，植物乳杆菌Pm005是肠道分离细菌，是肠道中正常存在的微生物，原料来源广泛，方便易得。研究显示，植物乳杆菌Pm005对于实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)具有明显的治疗和改善作用，这预示植物乳杆菌Pm005菌具有治疗多发性硬化(MS)的前景，本发明为多发性硬化的治疗提供新的药物选择和思路。

本发明中所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Pm005已于2021年7月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉，武汉大学)，保藏编号：CCTCC NO：M2021928。

附图说明

图1为生理盐水-EAE对照组和植物乳杆菌Pm005-EAE处理组小鼠在EAE发病过程中的临床评分。

图2为生理盐水-DSS处理组和植物乳杆菌Pm005-EAE处理组小鼠脊髓组织H&E和Luxol fast blue免疫组织化学染色结果。

图3为生理盐水-DSS处理组和植物乳杆菌Pm005-EAE处理组小鼠脊髓中炎症相关基因mRNA的表达水平结果。

具体实施方式

除非另有定义，本发明中所使用的所有科学和技术术语具有与本发明涉及技术领域的技术人员通常理解的相同的含义。

如本发明中所用，术语“治疗”包括在疾病发作之后，根除、移除、逆转、缓解、改变或控制疾病。

如本发明中所用，术语“预防”指在疾病发作之前，通过治疗以避免、最小化或令疾病或状况难于发作或发展的能力。

如本发明中所用，术语“患者”或“受试者”等等在本文中可交换使用，是指根据本文所述的方法处理的任何动物或其细胞，不论是体外或原位。具体地，前述动物包括哺乳动物，例如，人类、家养动物(即由人类饲养驯化，且可以人为控制其繁殖的动物，用于例如食用、劳役、毛皮、宠物、实验等功能，例如经济动物、宠物、实验动物等)，特别是人类。

本文所引用的各种出版物、专利和公开的专利说明书，其公开内容通过引用整体并入本文。

下面将结合本发明实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：植物乳杆菌Pm005菌可以减轻小鼠EAE模型的表型

(1)准备WT小鼠

从上海灵畅公司购买20只8周龄的野生型BL/C57小鼠，饲养于SPF屏障系统内，适应一周后将小鼠随机分成2组，分别为生理盐水-EAE对照组和植物乳杆菌Pm005菌-EAE组。

(2)植物乳杆菌Pm005菌肠道定植

将植物乳杆菌Pm005菌接种于液态MRS培养基中，于37℃条件下厌氧、静置培养20-22h，然后8000rpm离心5min收集菌体，用生理盐水洗涤两次后，再将细菌重悬于生理盐水中，终浓度约5×10⁹CFU/mL。按照每只小鼠200μL植物乳杆菌Pm002的剂量灌胃处理WT小鼠，隔天重复处理，持续2周，同时生理盐水-DSS组仅进行生理盐水灌胃处理。

2周的灌胃处理结束后，小鼠即可进行诱导EAE实验。

(3)建立小鼠EAE模型

在弗氏不完全佐剂(IFA)中加入结核分枝杆菌(TB)配成终浓度为5mg/mL的完全弗氏佐剂(complete Freundadjuvant,CFA)，髓鞘少突胶质细胞糖蛋白_35-55(MOG_35-55)肽段用PBS配成5mg/mL。CFA和MOG_35-55溶液按水和油体积比1∶1混合，用注射器反复抽推制成油包水样乳白色混悬液。抗原乳剂按0.4mL/只分4点脊柱两侧皮下注射，免疫当天记录为免疫后第0天。各组小鼠于免疫当天和48h分别尾静脉注射200ng/只PTX作为免疫增强剂。

EAE的临床评分标准为：0分，无症状；1分，尾巴无力；2分，尾麻痹及轻微后肢无力；3分，尾麻痹及重度后肢无力；4分，尾麻痹及四肢麻痹；5分，濒死或死亡。临床评分对比如图1所示。

(4)染色分析

小鼠麻醉后1×PBS灌注，解剖取出小鼠的脑与脊髓腰部膨大处，4％多聚甲醛固定，30％蔗糖脱水，冰冻切片，NG2抗体免疫组织化学染色；主动免疫MOG_35-55或过继转移Th1/Th17后第20天，EAE小鼠麻醉后1×PBS灌注，解剖取出小鼠脊髓腰部膨大处，4％多聚甲醛固定，石蜡包埋做病理切片，进行HE染色、勒克司坚牢蓝(Luxolfast blue,LFB)染色。组织化学染色分析对比如图2所示。

(5)qPCR检测

EAE小鼠麻醉后1×PBS灌注，解剖取出小鼠脊髓，TRIzol裂解，提取总RNA，再用PrimeScrip RT reagent Kit反转录成cDNA，SYBR Green Master Mix进行real-time PCR(测定基因引物见表1)。炎症因子基因qPCR分析对比如图3所示。

表1 qPCR引物序列

本发明建立了多发性硬化的动物模型EAE小鼠，通过分析小鼠EAE发病过程中的临床评分、组织化学和炎症相关基因mRNA的表达水平等指标，证明植物乳杆菌Pm005能有效缓解动物模型EAE小鼠的发病程度及降低发病率。根据图1-3显示，生理盐水-EAE对照组小鼠高峰临床得分显著高于植物乳杆菌Pm005菌-EAE组小鼠；H&E染色结果发现生理盐水-EAE对照组小鼠和植物乳杆菌Pm005菌-EAE组小鼠均有不同程度的炎症细胞浸润，但对照组小鼠较严重；LFB染色结果显示生理盐水-EAE对照组小鼠较植物乳杆菌Pm005菌-EAE组小鼠脱髓鞘严重。以上结果说明Pm005可以减轻小鼠EAE模型的表型，即改善EAE模型小鼠尾巴或四肢出现的无力或麻痹症状，减轻炎症细胞对小鼠的侵害，缓解EAE模型小鼠的脱髓鞘疾病症状，总的来说，植物乳杆菌Pm005能够有效缓解多发性硬化动物模型EAE小鼠的发病程度以及显著降低动物模型EAE小鼠的发病率，进而使小鼠的脱髓鞘疾病症状得到有效改善。这是首次发现植物乳杆菌有效缓解动物模型EAE小鼠的发病程度的功能。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换等，均应包含在本发明的保护范围之内。

本发明中描述的前述实施例和方法可以基于本领域技术人员的能力、经验和偏好而有所不同。

本发明中仅按一定顺序列出方法的步骤并不构成对方法步骤顺序的任何限制。

Claims (10)

1.一种植物乳杆菌Pm005，其保藏编号为CCTCC NO：M 2021928。

2.一种药物组合物，其包含权利要求1所述的植物乳杆菌Pm005、其培养物、其裂解物或其提取物，以及一种或多种药学上可接受的辅料。

3.如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含植物乳杆菌Pm005活菌，以及一种或多种药学上可接受的辅料。

4.如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述药学上可接受的辅料选自：填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂、香味剂、着色剂、包衣剂、酸度调节剂、防腐剂、稀释剂、悬浮液稳定剂中的一种或多种。

5.如权利要求2所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为口服剂型，选自：乳剂、混悬剂、糖浆剂、粉剂、片剂、丸剂、颗粒剂、胶囊剂和锭剂中的一种；

优选地，所述药物组合物为液体制剂，其中植物乳杆菌Pm005为活菌，其有效活菌数≥1×10⁹CFU/mL。

6.权利要求1所述的植物乳杆菌Pm005、其培养物、其裂解物或其提取物在制备预防和/或治疗中枢神经系统疾病的药物中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述中枢神经系统疾病为中枢神经系统炎症性脱髓鞘疾病。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述中枢神经系统炎症性脱髓鞘疾病为多发性硬化、视神经脊髓炎或急性散播性脑脊髓炎。

9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述中枢神经系统疾病为多发性硬化。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述多发性硬化包括复发缓解型多发性硬化、继发进展型多发性硬化、原发进展型多发性硬化和进展复发型多发性硬化。

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