CN117653668A - 一种布劳特氏菌在制备预防或治疗抑郁症药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种布劳特氏菌在制备预防或治疗抑郁症药物中的应用。本发明建立抑郁小鼠模型，通过对抑郁组和给Blautia.hydrogenotrophica组小鼠进行旷场实验、社交躲避实验、悬尾实验、强迫游泳实验的行为学评价，发现Blautia.hydrogenotrophica菌液可以显著改善小鼠的抑郁、焦虑样行为及改善社交，表明布劳特氏菌Blautia.hydrogenotrophica具有良好的抗抑郁作用。因此，本发明涉及的布劳特氏菌Blautia.hydrogenotrophica可应用于制备预防或治疗抑郁症的药物。

Description

一种布劳特氏菌在制备预防或治疗抑郁症药物中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种布劳特氏菌在制备预防或治疗抑郁症药物中的应用。

背景技术

抑郁症是一种常见的精神疾病，其症状包括情绪低落，精神萎靡，悲观厌世，快感丧失，睡眠障碍、兴趣丧失、精力减退等。抑郁症对个人的生活质量、工作能力以及人际关系产生严重的负面影响。根据世界卫生组织的数据，全球约有3.5亿人患有抑郁症，占全球人口的4.4％，并预计到2030年抑郁症将成为全球第一的致残原因。

抑郁症发病机制复杂，其涉及多种致病因素，如神经生物学、遗传、环境等，尚缺乏一种简单有效的治疗方法。药物治疗是抑郁症的主要治疗方法之一，但目前临床上针对抑郁患者的药物治疗仍然存在副作用大、成瘾性高、疗效不佳、周期长等问题。因此，深入探讨其发生发展的分子机理，寻找新的干预靶点和治疗手段，是目前亟待解决的科学问题。

近年来，越来越多的研究表明抑郁症患者与健康人群相比，肠道菌群的多样性和丰度存在差异，并且发现补充一些特定的益生菌可以促进肠道健康，改善消化和免疫功能，同时也可以调节神经递质水平，改善抑郁症状，这些证据都说明了肠道微生物的多样性、平衡性和丰富性对人体的健康有着重要影响。并且，也有研究发现抑郁症的发生、发展过程中常伴随着严重的中枢神经系统炎症反应，而肠道菌群对大脑的稳态及功能具有重要调节作用。

布劳特氏菌Blautia.hydrogenotrophica作为哺乳动物肠道内重要的核心菌属，可以通过影响肠道菌群的结构与功能，发挥缓解炎症性疾病和代谢疾病的作用。布劳特氏菌通过产生乙酸盐为肠上皮细胞和肌肉、脑组织提供能量来源，同时抑制病原菌，发挥缓解炎症性疾病和代谢疾病的作用。关于布劳特氏菌Blautia.hydrogenotrophica是否参与到抑郁行为的调控尚未见报道。

发明内容

发明目的：本发明目的在于提供一种布劳特氏菌在制备预防或治疗抑郁症药物中的应用。本发明通过相关研究证实，布劳特氏菌Blautia.hydrogenotrophica具有良好的抗抑郁作用，能够有效预防或治疗抑郁症，用药周期较短。因此，本发明涉及的布劳特氏菌Blautia.hydrogenotrophica可应用于预防或治疗抑郁症的药物制备。

技术方案：本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供了一种布劳特氏菌在制备预防或治疗抑郁症药物中的应用，所述布劳特氏菌为Blautia.hydrogenotrophica菌粉DSM 10507，保藏于德国微生物保藏中心Deutsche Sammlungvon Mikroorganismenund Zellkulturen,DSMZ。

所述布劳特氏菌作为唯一活性成分制备预防或治疗抑郁症药物。

所述布劳特氏菌与其它药物联合使用制备预防或治疗抑郁症药物。

所述药物包括布劳特氏菌及药学上可接受的辅料。

所述辅料包含乳化剂、增溶剂、防腐剂、抗氧剂、崩解剂、黏合剂或稀释剂中的一种或几种。

所述乳化剂选自吐温类、司盘类、果胶、琼脂、甘油脂肪酸酯类、海藻酸钠或二氧化硅中的至少一种。

所述增溶剂选择吐温类、聚氧乙烯脂肪醇醚类、硫酸化物或磺酸化物中的一种。

所述防腐剂选自苯甲酸及其盐类、山梨酸及其盐类或尼泊金酯类中的至少一种。

所述抗氧剂选自亚硫酸盐、抗坏血酸、亚硫酸氢盐、没食子酸及其脂类中的至少一种。

所述崩解剂选自淀粉、羧甲基淀粉钠、交联聚维酮、低取代羟丙基纤维素或交联聚乙烯吡咯烷酮中的至少一种。

所述黏合剂选自淀粉浆、羧甲基纤维素钠、聚维酮、羟丙基纤维素、甲基纤维素或乙基纤维素中的至少一种。

所述稀释剂选自淀粉类、糖类、纤维素类或无机盐类中的至少一种。

所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、口服液、注射剂或输液剂。

本发明的药物可以采用各种已知的方式施用，例如口服、注射等施用方式。本发明的药物可单独给药也可与其他药物联合用药。口服组合物可以是任何口服可接受的剂型，包含但不限于片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂和口服液。

无菌可注射组合物可按照本领域已知的技术，使用适合的分散剂或润湿剂和助悬剂来配制。可以使用的药学上可接受的载体和溶剂包括水、氯化钠溶液等。

可以改变本发明的药物中活性成分的实际剂量水平以获得对特定患者、组合物和施用方式而言可以有效实现所需治疗响应、对患者无毒的活性成分的量。所选择的剂量水平取决于多种因素，包括施用途径、施用时间、排泄速率、治疗的持续时间、与布劳特氏菌组合使用的其它药物、化合物和/或材料、所治疗的患者的年龄、性别、体重、一般健康状况和既往病史以及医学领域中公知的类似因素。

所述布劳特氏菌Blautia.hydrogenotrophica菌液显著改善小鼠的抑郁、焦虑样行为，并且能改善社交。

所述布劳特氏菌是活细胞形式。

所述药物中布劳特氏菌的有效剂量为1×10⁹CFU/ml。

本发明实验研究发现，Blautia.hydrogenotrophica菌液对抑郁样行为有明显的改善作用。在进行不可预知温和应激(Unpredictable mild stress,UMS)前12天，连续每天单次给予抗生素处理后的伪无菌小鼠(ABX小鼠)灌胃Blautia.hydrogenotrophica菌液(1×10⁹CFU/ml)，并在造模开始后，每天一次于每日应激前30min灌胃给予小鼠。实验结果发现，给菌19天，细菌定植组与抑郁模型组相比，小鼠在旷场实验中，进入中央区域的次数和时间明显增加；在悬尾实验和强迫游泳实验中，不动时间明显缩短；在社交躲避实验中，社交得分明显升高。以上结果表明Blautia.hydrogenotrophica菌液用药周期较短、发挥作用较快，19天就可以显著改善小鼠的抑郁、焦虑样行为，并且能改善社交，说明Blautia.hydrogenotrophica具有一定的抗抑郁作用，能够制备用于预防或治疗抑郁症药物。

有益效果：

发明人通过建立UMS抑郁小鼠模型，通过对抑郁组和给Blautia.hydrogenotrophica组小鼠进行旷场实验、社交躲避实验、悬尾实验、强迫游泳实验的行为学评价，发现Blautia.hydrogenotrophica菌液可以显著改善小鼠的抑郁、焦虑样行为及改善社交，说明Blautia.hydrogenotrophica具有良好的抗抑郁作用。本发明中Blautia.hydrogenotrophica针对抑郁症的治疗见效较快，用药周期较短，且未见明显的毒副作用，安全性较高。将Blautia.hydrogenotrophica应用于预防或治疗抑郁症的药物制备，不仅挖掘出了Blautia.hydrogenotrophica的药用新价值，也具有一定的医用前景和经济价值。

附图说明

图1为给药流程图；

图2为定植第12天各组小鼠粪便中Blautia.hydrogenotrophica代表性基因表达分析统计图；

图3为旷场实验小鼠运动总距离、进入中央区域的次数、在中心停留的时间统计图和旷场实验中小鼠运动轨迹图；

图4为社交实验小鼠运动轨迹热图和社交得分统计图；

图5为悬尾实验小鼠的不动时间统计图；

图6为强迫游泳实验小鼠的不动时间统计图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道购买得到的常规产品。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售产品。

实施例1伪无菌小鼠体内定植Blautia.hydrogenotrophica

菌株：Blautia.hydrogenotrophica菌粉(DSM 10507)购自德国微生物保藏中心。

小鼠：C57BL/6J小鼠(雄性，5周龄)，16～21g，购买于北京维通利华实验动物技术有限公司。

图1为给药流程图。具体步骤如下：

(1)伪无菌小鼠构建

在C57BL/6J小鼠适应性喂养7天后，第8-16天，通过称取氨苄青霉素钠67mg、硫酸新霉素67mg、盐酸万古霉素33.5mg、甲硝唑67mg，加超纯水定容至10mL，超声至溶液澄清，配制成抗生素溶液，再给予小鼠抗生素溶液灌胃来构建伪无菌小鼠(ABX小鼠)，灌胃量为0.2ml/只，每两天一次，共五次，随后正常饮水2天(wash time)后可进行单菌定植。

(2)伪无菌小鼠体内定植Blautia.hydrogenotrophica

将伪无菌小鼠根据随机分为4组，分别为对照组(Control组，n＝12)、不可预知温和应激模型组(Unpredictable mild stress,UMS组，n＝13)、模型+Blautia.hydrogenotrophica活菌组(UMS+B.h组，n＝13)、模型+Blautia.hydrogenotrophica灭活菌组(UMS+Pasteurized组，n＝13)。

在第19-30天进行为期12天的Blautia.hydrogenotrophica定植，活菌组每只小鼠每天灌胃一次0.2ml(10⁹CFU/ml)的Blautia.hydrogenotrophica菌液；灭活菌组每只小鼠每天灌胃一次0.2ml(10⁹CFU/ml)121℃高温高压灭菌(TOMY SX-700高压灭菌锅，日本)的Blautia.hydrogenotrophica菌液。对照组和UMS组小鼠每天接受相同体积的预还原的无菌生理盐水(预还原生理盐水：将生理盐水于121℃高温高压灭菌，然后冷却，放入厌氧箱预还原24h)。

(3)Blautia.hydrogenotrophica培养

准备1L锥形瓶，称量10.08g DSMZ Medium 104培养基粉末(山东拓普生物工程有限公司)和150mg L-无水巯基丙氨酸盐酸盐后倒入其中，随后分别加入1.5mL1mg/mL氯化血红素、1.5mL 0.2mg/mL维生素K1和300mL去离子水，121℃高压灭菌后，Blautia.hydrogenotrophica培养基就配制完成。

装有Blautia.hydrogenotrophica菌粉的安瓿瓶在厌氧箱中打开瓶口，注意密闭操作，防止空气进入破坏无氧环境。加入1mL放入厌氧箱预还原24h后的无菌生理盐水与菌粉混合制成菌混悬液，准备装有10mL菌培养基的15mL离心管，将菌混悬液吸入其中进行培养。在菌生长到平台期后进行传代。进入小鼠体内定植Blautia.hydrogenotrophica阶段时，将菌液在室温下4000rpm离心20min，吸出上清后用预还原的无菌生理盐水重悬，制备成1×10⁹CFU/ml的菌液用于对小鼠灌胃。

(4)粪菌DNA提取与荧光定量PCR

小鼠接受菌定植12天后的第31天，分别用1.5ml ep管收集各组小鼠2-3粒新鲜粪便，并立即放置于冰上暂存，随后选用德国QIAGEN公司DNA Stool Mini Kit试剂盒，按说明书程序对小鼠粪便的DNA进行提取，并使用Nanodrop 2000检测DsDNA浓度和纯度，将所有样本DNA浓度统一定量为40ng/μl，再根据Thermal Cycler DiceTM Real TimeSystem(TaKaRa Code：TP800)使用说明书要求进行PCR实验操作，反应体系如表1所示。

表1PCR反应体系

反应程序：

(1)95℃条件下进行预变性反应90s。

(2)PCR反应(95℃条件下持续30s，退火温度60℃条件下持续30s，72℃条件下持续30s)，共40个循环。

(3)以0.5℃/5s的升温速度从65℃升温至95℃，进行融解曲线分析。

引物来自上海生工生物，引物序列为：

正向引物(5’-3’)：ACGTAAGGGGCAAGCGTTAT；

反向引物(5’-3’)：TTGAGCCCATGCCTTTCACA。

图2为定植第12天各组小鼠粪便中Blautia.hydrogenotrophica代表性基因表达分析统计图。从图中可以看出：Blautia.hydrogenotrophica定植提高了其在小鼠肠道中的丰度。

实施例2不可预知温和应激抑郁小鼠模型的建立

为了验证Blautia.hydrogenotrophica对小鼠抑郁样行为的改善作用，本实施例建立了不可预知温和应激抑郁小鼠模型。

给予Blautia.hydrogenotrophica定植处理后小鼠每天多种不同的刺激方式，持续刺激1周(第31天至37天)以建立小鼠不可预知温和刺激(Unpredictable mild stress,UMS)抑郁小鼠模型，小鼠接受的不可预知温和刺激情况见表2。

造模7天结束后在第38天和39天分别进行旷场、悬尾和社交躲避、游泳测试。

表2小鼠接受的不可预知温和刺激情况

实施例3旷场测试(Open field test)

为了降低试验动物由于外界条件的改变而产生的应激对试验结果的影响，在实验开始前，提前将测试房间的温度与饲养室的室温调至稳定一致，在试验前1小时将试验动物放入试验室以使其适应，确保每次实验的起始时间、光照条件保持一致。在实验过程中，要尽可能地减少噪声的产生，保证实验过程安静且稳定。

旷场测试实验准备阶段，首先调试摄像头，使之垂直于地面拍摄，使拍摄视野足够涵盖整个旷场箱，且光线均一，无明显明暗角。利用行为学分析Anymaze软件，定义旷场箱底面(40cm×40cm)中央矩形区域(20cm×20cm)为中央区(Central area)，其他区域为外周区(Periphery area)。实验开始时，将待测小鼠沿旷场箱底面一侧中心，并面朝中央区轻柔放下，随后立即开启摄像头记录小鼠在旷场箱内运动8min的活动轨迹，待测试结束后将受试小鼠移出。每次放入受试动物前用75％酒精擦拭旷场箱底部及边缘区域，以避免前一次测试中小鼠气味的干扰。

根据计算机软件分析测试阶段内受试动物的总运动距离，在中央区停留的时间(Central duration)及进入中央区次数(Central entries)，进入中央区次数越少和在中央区停留时间越短的小鼠，被认为焦虑程度更高。

实验数据以Mean±SEM表示，并采用GraphPad Prism 8软件对结果进行分析处理，数据采用t-test进行分析，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001，*p<0.05表示数据差异具有统计意义。

实验结果：

图3A为旷场实验小鼠运动总距离，图3B为小鼠进入中央区域的次数，图3C为小鼠在中心停留的时间统计图，图3D为旷场实验中小鼠运动轨迹图。

由图可知，在旷场实验中，与对照组相比，UMS模型组小鼠在旷场中心区进入次数以及停留时间显著降低(**p<0.01，*p<0.05)，而给予Blautia.hydrogenotrophica活菌菌液后，能够显著升高小鼠在中心区域进入次数以及停留时间(*p<0.05，*p<0.05)，给予灭活菌液后小鼠在中心区域进入次数以及停留时间无显著变化，表明Blautia.hydrogenotrophica可以缓解小鼠的焦虑抑郁症状。

实施例4社交躲避实验(Social interaction test)

社交躲避实验准备阶段，首先调试摄像头，使之垂直于地面拍摄，使拍摄视野足够涵盖整个旷场箱，且光线均一，无明显明暗角。利用行为学分析Anymaze软件，定义旷场箱底面(40cm×40cm)一侧矩形区域(14cm×24cm)为社交区域，其他区域为非社交区域。将一圆柱形铁丝笼经75％酒精擦拭后放置于社交区域正中。正式实验分为两个阶段(Stage)，每个阶段测试150s，中间间隔30s。

第一阶段为无白鼠阶段(Without-target stage)。此阶段中，直接将待测小鼠于旷场箱中部，并面朝铁丝笼方向轻柔放下，随后立即开启摄像头记录小鼠在社交区域活动的时间，待150s测试时间结束后将受试小鼠移出。

第二阶段为有白鼠阶段(With-target stage)。此阶段中先将无攻击性的CD-1白鼠(雄性，6-7月龄，北京维通利华)放入铁丝笼中，按第一阶段中平行操作，再次记录150s测试时间，测试结束后将受试小鼠移出。每次放入受试动物前用75％酒精擦拭旷场箱底部及边缘区域，以避免前一次测试中小鼠气味的干扰。

定义SI得分＝T2(Stage 2受试小鼠在社交区域的运动时间)/T1(Stage 1受试小鼠在社交区域的运动时间)。

实验数据以Mean±SEM表示，并采用GraphPad Prism 8软件对结果进行分析处理，数据采用t-test进行分析，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001，*p<0.05表示数据差异具有统计意义。

实验结果：

图4A为社交实验小鼠运动轨迹热图，图4B为小鼠社交得分统计图。由图可知，在社交实验中，UMS模型组小鼠社交得分显著低于对照组(****p＜0.0001)，给予Blautia.hydrogenotrophica菌液后小鼠社交得分显著升高(*p<0.05)，而给予灭活菌后社交得分不提高，说明Blautia.hydrogenotrophica活菌可以改善小鼠社交行为，而灭活菌无此作用。

实施例5悬尾测试(Tail suspension test,TST)与强迫游泳测试(Forcedswimming test,FST)

(1)悬尾测试

悬尾实验中，用胶带将小鼠尾巴固定在悬尾箱吊杆上(胶带粘贴力应足以承受被测小鼠的重量)，使小鼠的鼻尖与悬尾箱底部之间的距离保持在20-25cm左右。小鼠悬尾总时间为6min，前两分钟为适应时间，应对后4min内的不动时间进行记录。实验结束后，将胶带从尾巴轻轻取下，以减少胶带撕扯给动物带来的疼痛应激。实验结束后，两个实验人员在单盲情况下进行不动时间的计算(前2min为适应时间)，其不动状态定义为小鼠停止挣扎，四肢不动或仅有微小摆动。

(2)强迫游泳测试(Forced swimming test,FST)

强迫游泳实验中，使用一个高40cm、直径25cm，盛满约3000mL温水(22-24℃为宜)的圆柱形烧杯放入悬尾箱中，以达到隔离各实验对象的效果。将小鼠轻柔地放入盛有水的烧杯中，待小鼠头部微微昂起后放手，此时开始计时。小鼠游泳总时间为6min，前两分钟为适应时间，应对后4min内的不动时间进行记录。实验结束后，两个实验人员在单盲情况下进行不动时间的计算(前2min为适应时间)，其不动状态定义为小鼠呈漂浮状态，四肢不动或仅有微小摆动。

实验数据以Mean±SEM表示，并采用GraphPad Prism 8软件对结果进行分析处理，数据采用t-test进行分析，*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001，****p＜0.0001，*p<0.05表示数据差异具有统计意义。

实验结果：

图5为悬尾实验小鼠的不动时间统计图，图6为强迫游泳实验小鼠的不动时间统计图。由图可知，在悬尾实验和强迫游泳实验中，UMS模型组小鼠的不动时间显著高于对照组小鼠(****p＜0.0001，**p<0.01)，给予Blautia.hydrogenotrophica菌液后小鼠不动时间显著降低(*p<0.05，p＝0.0512)，而给予灭活菌后不动时间无改善，说明Blautia.hydrogenotrophica活菌可以缓解小鼠绝望行为而灭活菌无此作用。这些结果表明Blautia.hydrogenotrophica能够改善不可预知温和应激引起的小鼠抑郁样行为。

如上所述，尽管参照特定的优选实施例已经表示和表述了本发明，但其不得解释为对本发明自身的限制。在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围前提下，可对其在形式上和细节上作出各种变化。

Claims (8)

1.一种布劳特氏菌在制备预防或治疗抑郁症药物中的应用，其特征在于，所述布劳特氏菌为Blautia.hydrogenotrophica菌粉DSM 10507，保藏于德国微生物保藏中心。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述布劳特氏菌作为唯一活性成分制备预防或治疗抑郁症药物。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述布劳特氏菌与其它药物联合使用制备预防或治疗抑郁症药物。

4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述药物包括布劳特氏菌及药学上可接受的辅料。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为片剂、胶囊剂、颗粒剂、混悬剂、口服液、注射剂或输液剂。

6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述布劳特氏菌Blautia.hydrogenotrophica菌液显著改善小鼠的抑郁、焦虑样行为，并且能改善社交。

7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述布劳特氏菌是活细胞形式。

8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物中布劳特氏菌的有效剂量为1×10⁹CFU/ml。