CN104758300A

CN104758300A - 维生素d及其组合物的抗菌用途

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Publication number: CN104758300A
Application number: CN201410001937.0A
Authority: CN
Inventors: 周明东
Original assignee: ZESHENG SCIENCE AND TECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd SHANGHAI
Current assignee: ZESHENG SCIENCE AND TECHNOLOGY DEVELOPMENT Co Ltd SHANGHAI; Zensun Shanghai Science and Technology Ltd
Priority date: 2014-01-02
Filing date: 2014-01-02
Publication date: 2015-07-08
Also published as: RU2016131454A; RU2016131454A3; CN105916510A; EP3111939A4; WO2015101208A1; EP3111939A1; AU2014375577A1; US20160324876A1; JP2017501203A; CA2935597A1

Abstract

本发明涉及维生素D化合物在制备用于预防或治疗尿路感染的药物中的用途，特别是涉及用于预防或治疗尿路感染的药物组合物和药物制剂。该组合物包括维生素D化合物和其它用于预防或治疗尿路感染的药物。该药物制剂含有维生素D化合物以及药学上可接受的载体。

Description

维生素D及其组合物的抗菌用途

技术领域

本发明涉及维生素D化合物在制备用于预防或治疗尿路感染的药物中的用途。更为特别地，涉及用于预防或治疗尿路感染的药物组合物和药物制剂。

背景技术

尿路感染（Urinary tract infection,UTI）是指病原体在尿路中生长繁殖，并侵犯泌尿道粘膜或组织而引起的炎症，以细菌性UTI最常见。尿路感染是临床常见病，据美国门诊医疗调查和医院门诊医疗调查，每年有近700万门诊病例和100万急诊，以及造成10万人住院治疗，尤以女性患者居多。大量文献报道尿路感染复发率高，约25-30%的女性患者发生复发感染，更有研究显示高达44.1%的女性患者在一年内复发一次。UTI的高复发率带来了重大的经济损失，有学者估算美国每年用于UTI治疗的费用高达16亿美元。

正常情况下，致病菌在尿路不易停留、繁殖，故不会引起感染。这是由于泌尿、生殖系统的生理防御功能，其中最为主要的是分泌抗菌肽。一旦有病原体入侵时，抗菌肽就能起到杀菌的作用，且这个反应过程相当迅速，使得致病菌尚未在体内繁殖就已经被清除。但是，这种抗感染的防御功能一旦减弱，致病菌就会趁虚而人，从而诱发感染。

抗菌肽多为20～60个氨基酸的肽，一般带正电且具有两亲性，后者使得它们在水溶环境和疏水环境（如膜）都能达到较高浓度。抗菌肽能快速吸附在入侵微生物的膜上并将其杀死。现研究较多的人抗菌肽是防御素和cathelicidin（也称为LL-37）。正常情况下人尿路中可检测到低水平的cathelicidin，一旦有微生物侵入，编码cathelicidin的mRNA表达量迅速上升。Chromek等用大肠杆菌分别感染cathelicidin基因敲除和野生型鼠，结果基因敲除的鼠下尿道细菌数明显高于野生型。

维生素D在人体营养中占重要地位，它是一种脂溶性维生素，人体内主要以维生素D₂（麦角钙化醇）和维生素D₃（胆钙化醇）两种形式存在。人体主要依靠食物摄取和皮肤合成获得维生素D。皮肤中的7-脱氢胆固醇经波长290～320mm的紫外光照射下合成维生素D前体。两种来源的维生素D都不能在血液中长期循环，而是马上就被脂肪组织或肝脏摄取，以用来储存或活化。活化后的维生素D能够与其受体VDR结合进入细胞核内，调节多种基因的表达，VDR广泛存在于人体各种细胞中，因而维生素D具有广泛的生物学作用，比如以往所熟知的促进钙磷代谢吸收的功能，以及近年来逐渐被发现的促进细胞分化、抑制细胞增殖、促进分泌抗菌肽、增强固有免疫、抑制特异性免疫等。

通过太阳直接照射皮肤是人体产生天然维生素D的主要方式，但由于现代社会生活习惯的改变，现代人待在室内时间加长，较多地使用防晒产品，使得人们接受到足够的阳光照射机会较少，而能够提供维生素D的食物来源又非常有限（如鱼肝油、一些水栖哺乳动物的肝脏和脂肪等），因此大部分人无法从常规饮食中补充维生素D，导致目前全球范围内维生素D缺乏呈普遍趋势，国外众多大型流行病学调查显示（包括美国、加拿大、英国、法国、德国、西班牙、俄罗斯、新西兰、以色列等），在大龄儿童、青年和中年人中约有50％～70％的人群处于维生素D缺乏状态。而我国维生素D缺乏形势更为严峻，特别是中国人的膳食结构中缺乏富含维生素D的食物，在现代生活中接触阳光和户外活动的机会也大大减少，因此我国居民出现维生素D缺乏的几率将比西方人更高，据中科院研究发现我国中老年人群缺乏维生素D现象更为严重，其调查结果显示我国中老年人血液中含有的维生素D的水平整体较低，维生素D不足者占93.6％，维生素D充足者仅占6.4％。

维生素D缺乏或不足对人体的免疫能力具有极其不利的影响，降低对尿路感染反复发作的抵抗力。虽然暂未有流行病学研究数据证实维生素D缺乏会导致免疫能力下降的直接证据，但已有流行病学研究显示体内25(OH)D血清浓度降低而呈现上呼吸道感染率增加的关系，另有流行病学研究显示母婴体内维生素D缺乏与婴儿急性下呼吸道感染的高发病率相关，Gibney等人研究显示维生素D缺乏与肺结核发病率相关，这些研究都从侧面揭示维生素D缺乏或不足对系统免疫能力或会造成一定负面的影响。另外孕妇和高龄妇女都是维生素D缺乏或不足的高危人群，有研究显示2%～10%的孕妇及高达20%的80岁以上妇女有无症状菌尿，发病概率远远超过普通人，提示我们这两者之间可能存在某种内在联系。

尿路感染可根据病原体的感染部位分为尿道炎、膀胱炎、肾盂肾炎；肾盂肾炎严重时引发肾功能损伤甚至衰竭，而革兰氏阴性杆菌败血症多由尿路感染引起，少数败血症病人可发生明显的休克，伴有心、脑、肾缺血的临床表现。

现UTI治疗主要采取抗生素疗法，常用的典型的治疗UTI的抗生素有：TMP-SMX、呋喃妥因（nitrofurantoin）、环丙沙星（ciprofloxacin）、左氧氟沙星（levofloxacin）或其化学类似物、某些盘尼西林（penicillin）如阿莫西林等。尽管抗生素一定程度上能降低UTI，但是抗生素广泛应用的代价同样是高昂的：耐药菌的不断增加以及破坏患者体内的正常菌群数量。有一项研究表明从UTI患者中分离的大肠杆菌在1998年至2003年5年间对环丙沙星、阿莫西林-克拉维酸、TMP-SMX抗性明显增加。抗生素滥用将导致耐药性的细菌不断增加，细菌对药的抗性使得抗生素用量加大或不断寻求杀菌更强的抗生素，造成经济上的浪费；并且其盲目杀菌作用也导致体内有益菌的减少，对人体造成不必要的伤害。抗生素可以快速抑制细菌增殖，但不能提高机体自身的固有免疫，当病原体再次侵入时，体内固有免疫仍不足以将病原体杀死，感染易复发。前文也提到UTI的高复发率，现阶段单用抗生素疗法不能降低UTI的高复发率，且易造成医疗资源的浪费和经济的重大损失。因此现亟需一种有效的新的防治UTI的方法，能够单独使用或同抗生素疗法联用以降低UTI的高复发率。

尿路感染的的一大诱因是机体自身固有免疫力下降，增强自身固有免疫能力是降低尿路感染复发率的一条途径。而活性维生素D与VDR（vitamin d receptor，维生素D受体）结合进入细胞核内，作用于多种靶基因，可增强人的固有免疫、上调抗菌肽的表达，抑制病菌粘附，杀灭或抑制病原体，减少复发率，其理论依据和实验结果使新的尿路感染的防治药物成为可能。本申请提供了一种可有效降低尿路感染复发的药物制剂，通过降低尿路感染的复发，改善患者的生活质量，并减少抗生素的应用，缓解目前临床上抗生素滥用的状况。维生素D化合物在制备用于预防或治疗尿路感染的药物中的应用必将大大改观UTI的防治状况。

发明内容

A.发明概述

本发明涉及维生素D化合物在制备用于预防或治疗尿路感染的药物中的用途。其中所述尿路感染包括上尿路感染和下尿路感染，根据病原体的感染部位可分为尿道炎、膀胱炎、肾盂肾炎。在一个优选实施方案中，维生素D化合物是维生素D受体配体（VDR配体）。在一个更优选的实施方案中，维生素D化合物是维生素D受体的激动剂。优选地，维生素D化合物包括维生素D₂化合物、维生素D₃化合物、其异构体、活化形式或类似物。优选地，维生素D化合物包括维生素D₂、D₃和其类似物。在某些实施方案中，维生素D化合物是维生素D的活化形式，例如骨化二醇（25-OH D₃）或骨化三醇（1，25-(OH)2D₃）。

另一方面，本发明涉及一种预防或治疗尿路感染的药物组合物，该组合物包括维生素D化合物和其它用于预防或治疗尿路感染的药物。在一个优选实施方案中，维生素D化合物是维生素D受体配体（VDR配体）。在一个更优选的实施方案中，维生素D化合物是维生素D受体的激动剂。优选地，维生素D化合物包括维生素D₂化合物、维生素D₃化合物、其异构体、活化形式或类似物。优选地，维生素D化合物包括维生素D₂、D₃和其类似物。在某些实施方案中，维生素D化合物是维生素D的活化形式，例如骨化二醇（25-OH D₃）或骨化三醇（1，25-(OH)₂D₃）。在一个优选实施方案中，其它用于预防或治疗尿路感染的药物是某一抗生素，如TMP-SMX、呋喃妥因（nitrofurantoin）、环丙沙星（ciprofloxacin）、左氧氟沙星（levofloxacin）或其化学类似物、盘尼西林（penicillin）、阿莫西林等。在某些实施方案中，本发明的药物组合物适合于局部或口服施用于受试者。在其它实施方案中，正如下文所描述的，本发明的药物组合物可以被特殊配制成以固体或液体形式施用，如口服施用、肠胃外施用、局部施用等。

另一方面，本发明提供了一种预防或治疗尿路感染的药物制剂，该药物制剂含有维生素D化合物以及药学上可接受的载体。在一个优选实施方案中，维生素D化合物是维生素D受体配体（VDR配体）。在一个更优选的实施方案中，维生素D化合物是维生素D受体的激动剂。优选地，维生素D化合物包括维生素D₂化合物、维生素D₃化合物、其异构体、活化形式或类似物。优选地，维生素D化合物包括维生素D₂、D₃和其类似物。在某些实施方案中，维生素D化合物是维生素D的活化形式，例如骨化二醇（25-OH D₃）或骨化三醇（1，25-(OH)₂D₃）。在某些优选实施方案中，药学上可接受的载体是下述某一物质，如：糖类、淀粉、纤维素及其衍生物、明胶、滑石粉、赋形剂、油类、多元醇、酯类、缓冲剂、海藻酸或药物制剂中采用的其它无毒的相容性物质。本发明组合物可加入制备不同剂型时所需的各种常规辅料，如崩解剂、润滑剂、粘合剂、抗氧剂、络合剂等药用载体，以常规的制剂方法制成任何一种常用的口服剂型，如分散片、颗粒剂、胶囊剂、口服液等其他剂型。本发明的药物制剂的剂型可以为片剂、胶囊、注射剂、输注剂、吸入剂软膏剂或栓剂，但不限于此。

另一方面，本发明涉及提供了一种预防或治疗尿路感染的药盒，该药盒含有如上所述的药物组合物或药物制剂以及如何使用该组合物或药物制剂的说明书。

B.释义

除另有定义，这里使用的所有科技术语与本发明所属技术领域的普通技术人员理解含义相同。所有专利文献、专利申请文献、公开的专利文献和其它出版物均作为参考。如本节阐述的定义与上述参考文献所述的定义不一致或相反时，以本节阐述的定义为准。

本文所用的术语“维生素D化合物”包括任何能够预防或治疗尿路感染的维生素D化合物，一般而言，为维生素D受体配体（VDR配体）并且能够预防或治疗尿路感染的维生素D化合物被视为本发明的范围内，维生素D化合物优选地是维生素D受体的激动剂。因此，维生素D化合物旨在包括开环甾类，适用本发明的方法的具体维生素D化合物的实例在本文中有进一步描述。维生素D化合物包括维生素D₂化合物、维生素D₃化合物、其异构体、活化形式或类似物。优选的维生素D化合物是维生素D₃化合物，它们是维生素D受体的配体（更优选地是激动剂）。维生素D₂化合物和维生素D₃化合物分别包括维生素D₂、D₃和其类似物。在某些实施方案中，维生素D化合物可以是甾类，例如开环甾类，例如骨化醇（VD₃）、骨化二醇（25-OH D₃）或骨化三醇（1，25-(OH)₂D₃）。

术语“其它用于预防或治疗尿路感染的药物”是指已知的可用于预防或治疗尿路感染的药物，包括现有的各种抗生素，如TMP-SMX、呋喃妥因（nitrofurantoin）、环丙沙星（ciprofloxacin）、左氧氟沙星（levofloxacin）或其化学类似物、盘尼西林（penicillin），阿莫西林等。

术语“药学上可接受的”表示在合理的医学判断范围内适合于与人类和动物的组织接触使用、没有过度的毒性、刺激作用、变态反应或者其它问题或并发症。

术语“药学上可接受的载体”包括药学上可接受的材料、组合物或媒介物，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或包封材料，它们参与将主题化学物质从机体的一个器官或一个部分携带或运输到机体的另一个器官或另一个部分。每种载体必须是“可接受的”，意义是与制剂其它成分相容并对患者无害。

术语“施用”包括向受试者引入维生素D化合物以发挥它们预期功能的途径，可使用的施用途径的实例包括注射（皮下、静脉内、肠胃外、腹膜内）、口服、吸入、直肠、透皮或经由膀胱滴注，口服施用是优选的。本发明的制剂可以口服、或经静脉、皮下、肌内、经皮肤、鼻内、或直肠途径的胃肠外给药，或吸入给药。用于口服给药的剂型包括片剂、丸剂、粉剂、颗粒剂、液体剂、悬浮剂、糖浆剂、胶囊剂等。

具体实施方式

实施例1：VD₃刺激细胞的抗菌实验

1.实验目的

本研究以维生素D的最终活化形式1，25-二羟维生素D₃[1,25(OH)₂D₃]为供试品、以人组织细胞淋巴瘤细胞U-937细胞为实验系统，以大肠杆菌E.coli O111B4为抑菌对象，取分别经1,25(OH)₂D₃作用后的细胞上清液和大肠杆菌E.coli O111B4共孵育，以E.coli O111B4的菌落形成单位（CFU）来考察1,25(OH)₂D₃在体外是否可以刺激人来源细胞株分泌抗菌肽，以达到抗菌效果。

2.实验材料

2.1供试品1,25(OH)₂D的信息

药品名	供应商	货号	批号	保存条件	失效日期
						1,25(OH)₂D₃	Sigma	D1530	023M4010V	-20℃	2015-01-31

使用无水乙醇溶解1,25(OH)₂D₃，配制成浓度为200x l0^-6M的储备液，分装后，保存于-20℃冰箱中待用。

2.2实验仪器

MODEL3111型CO2培养箱

XDS-1B型倒置显微镜

SDG-D2型超净工作台

DK-6000型水浴锅

Biofuge Stratos型离心机

SMARTSPEC3000型紫外分光光度计

SCS-24恒温振荡摇床

2.3细菌和细胞培养基

RPMI1640基础培养基：每10.4g冻干粉加入1.5g碳酸氢钠、2.5g葡萄糖和0.11g丙酮酸钠。首先用800ml去离子水进行溶解，待完全溶解后，用1N HCl调pH值至7.2-7.4，并用去离子水定容至1L。基础培养基配制后，用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌，然后分装于蓝盖瓶，每瓶500mL，保存于2-8℃冰箱待用。

含10%FBS的RPMI1640完全培养基：每450mL基础培养基加入50mL胎牛血清（FBS）。

含1%FBS的RPMI1640不完全培养基：每49mL基础培养基加入1mL胎牛血清（FBS）。

LB液体培养基：准确称取胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，溶解于900mL去离子水中。用5N的NaOH调pH至7.0后，用去离子水定容至1L，121℃高压蒸汽灭菌15min。

1.5%琼脂平板：每1000mL LB液体培养基加入15g琼脂粉，121℃高压蒸汽灭菌15min。6孔板每孔加入2mL含1.5%琼脂的LB培养基，待培养基凝固后，将1.5%琼脂平板放入2-8℃冰箱保存。

上层琼脂培养基：每100mL LB液体培养基加入0.8g琼脂粉，制备成含0.8%琼脂的上层琼脂培养基，121℃高压蒸汽灭菌15min，待培养基冷却后，将上层培养基放入2-8℃冰箱保存。

3.实验方法

3.1接种和给药（Day1）

将处于指数增长期U-937细胞进行离心（1000rpm，5min）；

离心结束后，弃除细胞上清，加入适量的RPMI1640不完全培养基重悬细胞沉淀，并确保细胞分散均匀；

用血细胞计数板对细胞重悬液进行计数；

用RPMI1640不完全培养基将所得到的细胞悬液的浓度调整到1x10⁵/mL;

6孔板的每个孔接种3mL细胞悬液，每孔的细胞总数为3x10⁵;

以0.5%（v/v）的给药体积，根据标签和实验设计，每孔中加入10μL不同浓度的200x供试品溶液或溶媒；

每个剂量平行重复2孔，其中一孔24小时收获，另一孔48小时后收获；

给药后，将6孔板置于37℃、5%CO2培养箱培养，分别培养24小时和48小时。

3.2大肠杆菌感染菌液制备

Day1下午，解冻一支E.coli O111B4甘油管，吸取10μL甘油菌接种于10mL不含任何

抗生素的LB液体培养基中，37℃震荡培养过夜；

Day2早上，吸取200μL培养过夜的菌液（按1:100比例）转接至20mL不含任何抗生素的LB液体培养基，37℃震荡培养至OD600读数0.6-1.0，进入下一步的抗菌实验（Day3）；剩余的过夜菌液保存于2-8℃冰箱备用。

Day2下午，吸取10μL培养过夜的菌液接种于10mL不含任何抗生素的LB培养基中，37℃震荡培养过夜；

Day3早上，吸取200μL培养过夜的菌液（按1:100比例）转接至20mL不含任何抗生素的LB培养基，37℃震荡培养至OD600读数0.6-1.0，进入下一步的抗菌实验（Day3）。

3.3抗菌实验（Day2和Day3）

实验开始前，取出事先制备好的含1.5%琼脂平板（下层培养基），室温至少放置一小时；

溶化上层琼脂培养基（含0.8%琼脂），然后分装。每管分装1.6mL的上层琼脂培养基，然后将小管置于45℃水浴锅保温待用；

取10mL OD600为0.6-1.0的E.coli菌液转入50mL离心管，进行离心（1000rpm x5min）；离心后，弃除上清，细菌沉淀加入10mL PBS进行重悬；通过倍比稀释（10倍倍距），用PBS将上述细菌悬液稀释1x10⁵倍；

药物作用结束后（24小时或48小时），离心U-937细胞（1000rpm,5min），离心结束后，吸取细胞上清备用；

每个离心管预先加入50μL稀释后的细菌悬液（约150-250个细菌）；

每份细胞上清样品取1.2mL细胞上清液加入细菌悬液中，混匀；

将细胞上清/细菌混合液置于37℃摇床中振荡（200rpm）孵育90分钟，孵育结束后如下步骤进行铺板；

铺板：取0.8mL细胞上清液/菌液的混合液和1.6mL上层琼脂培养基混合，然后将混合液铺于1.5%琼脂平板上，每孔600uL，3孔一重复。

无菌测试：取800uL PBS和1.6mL上层琼脂培养基混匀后，如上进行铺板。

抗生素对照实验：取700uL PBS、50uL菌液、2uL氨苄抗生素、1.6mL上层琼脂培养基进行混匀，混匀后如上进行铺板。

待上层琼脂培养基冷却凝固后，所有6孔板（琼脂平板）一起放入37℃培养箱培养，培养过夜。

3.4菌落计数（Day3和Day4）

铺板后次日，从培养箱中取出6孔板进行菌落计数。

4.实验结果

U937细胞经维生素D₃诱导24h和48h后，取上清进行抗菌实验。分别计算各剂量组菌落形成单位（CFU）。实验结果如下：

其中，无菌实验及抗生素对照实验组均未有菌落产生。从现有数据看，不同浓度的VD₃刺激U937细胞后，其细胞上清溶液显示出明显的抗菌作用。

5.讨论

为了考察维生素D₃在预防和改善泌尿系感染方面的作用，本实验采用维生素D₃刺激来源于人的U937细胞，收集上清进行抗菌实验，考察细胞上清液的抗菌效果。

该实验体系稳定，实验结果控制在合理的误差范围内，数据可信。实验结果显示，U937细胞经VD₃刺激后，其上清溶液显示出明显的抗菌作用。

为了更清楚地描述和理解本发明，我们通过举例的方式详细描述了本发明，但显而易见的是，本技术领域中普通技术人员可以在不背离权利要求的精神和范围的前提下，对本发明做出适当的改变或修改。

Claims

1.维生素D化合物在制备用于预防或治疗尿路感染的药物中的用途。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述维生素D化合物包括维生素D₂、维生素D₃、维生素D₃的活化形式或类似物。

3.根据权利要求2所述的用途，其中所述维生素D₃的活化形式是25-羟基维生素D₃或1,25-二羟基维生素D₃。

4.根据根据权利要求2所述的用途，其中所述维生素D化合物是1,25-二羟基维生素D₃。

5.根据权利要求1所述的用途，其中所述尿路感染包括膀胱炎、尿道炎或肾盂肾炎。

6.用于预防或治疗尿路感染的药物组合物，其特征在于其含有维生素D化合物和其它可用于预防或治疗尿路感染的药物。

7.根据权利要求6所述的药物组合物，其中所述维生素D化合物包括维生素D₂、维生素D₃、维生素D₃的活化形式或类似物。

8.用于预防或治疗尿路感染的药物制剂，其特征在于其含有维生素D化合物以及药学上可接受的载体。

9.根据权利要求8所述的药物制剂，其中所述维生素D化合物包括维生素D₂、维生素D₃、维生素D₃的活化形式或类似物。

10.根据权利要求8所述的药物制剂，其剂型可以是片剂、胶囊、注射剂、输注剂、吸入剂软膏剂或栓剂。

11. 用于预防或治疗尿路感染的药盒，其特征在于其含有如权利要求8所述的药物制剂以及如何使用该药物制剂的说明书。