WO2019178954A1 - 琥珀酸在提高细菌对抗生素敏感性方面的应用 - Google Patents

琥珀酸在提高细菌对抗生素敏感性方面的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体公开了琥珀酸在提高细菌对抗生素敏感性方面的应用。本发明发现琥珀酸通过提高细菌的质子动力势，从而使进入细菌内部的抗生素数量增加，最终使细菌死亡，因此琥珀酸能够提高细菌对抗生素的敏感性，从而克服细菌耐药性的问题。将琥珀酸与抗生素联用可以显著提高抗生素的杀菌作用，与现有的只用抗生素作为抗细菌药物相比，具有更好的效果以及更高的安全性和可操作性。

Description

琥珀酸在提高细菌对抗生素敏感性方面的应用 技术领域
本发明属于医药技术领域，具体地，涉及琥珀酸在提高细菌对抗生素敏感性方面的应用。
背景技术
病原性细菌严重危害人类身体健康和养殖业的可持续性发展，需要采取有效措施进行防治。自从1929年弗莱明(Fleming)发现青霉素以来，各种抗生素的大量研究开启了人类的抗生素时代，其在感染疾病的治疗中发挥着重大的作用，使得抗生素的使用日益广泛。虽然采用抗生素可以有效防治疾病，但抗生素的滥用和误用会导致细菌产生耐药性。耐药菌株对原本有效的抗生素产生耐受，导致感染难以控制。因此，采用新的方法控制细菌特别是耐药菌的感染十分重要。
目前研究的热点是通过提高耐药菌对抗生素的敏感性，使得原本无效或低效的抗生素变得有效，将耐药菌杀死。近年来，已发现一些小分子可以协同抗生素促进杀菌作用，将其与抗生素一起制备成复方制剂，对控制细菌特别是耐药菌的感染具有重要意义。
琥珀酸是三羧酸循环中重要的四碳二羧酸中间产物，也是某些氨基酸的降解物。琥珀酸的天然来源是松属植物的树脂久埋于地下而成的琥珀等，此外还广泛存在于多种植物、动物的组织中。医药工业中可用它合成解毒剂、利尿剂、镇静剂、止血药、抗痉挛剂、松痰剂、磺胺药、抗生素以及维生素A、维生素B等。琥珀酸还可作为化学试剂，用作碱量法标准试剂、缓冲剂、气相色谱对比样品。在食品工业中可用于调味剂、酸味剂、缓冲剂，用于火腿、香肠、水产品、调味液等，还可用做防腐剂、pH值调节剂和助溶剂。但是，关于琥珀酸能否提高细菌对抗生素敏感性尚未见相关报道。
发明内容
本发明为了克服现有技术的上述不足，提供琥珀酸在提高细菌对抗生素敏感性方面的应用，本发明发现琥珀酸能够提高细菌对抗生素的敏感性，从而克服细菌耐药性的问题。
本发明的另一目的在于提供一种抑菌或杀菌的药物。
本发明的另一目的在于提供一种提高细菌对抗生素敏感性的方法。
本发明的另一目的在于提供琥珀酸在制备清除生物膜细菌的制剂或药物中的应用。
为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：
本发明发现添加琥珀酸后，可以提高临床大肠埃希菌对氨苄青霉素的敏感性，该作用具有抗生素浓度梯度、琥珀酸浓度梯度和时间效应。
本发明还发现添加琥珀酸后，可以提高临床大肠埃希菌对其它抗生素(如氨苄青霉素、羟苄青霉素、青霉素G、庆大霉素、环丙沙星、四环素、红霉素、克林霉素和利福平等)的敏感性。
以上结果表明，可以通过抗生素与琥珀酸联用提高细菌对抗生素敏感性的方法来达到治疗耐药菌的目的。
本发明发现添加琥珀酸后，氨苄青霉素对其它细菌或耐药菌(如大肠杆菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华菌、铜绿假单胞菌和乙型链球菌)的杀菌作用明显提高，结果表明，琥珀酸可以增强其它细菌或耐药菌对氨苄青霉素的敏感性。
本发明发现琥珀酸通过提高细菌的质子动力势，从而使进入细菌内部的抗生素含量增加，最终使细菌死亡。
本发明构建了体外临床大肠埃希菌生物膜，通过琥珀酸和氨苄青霉素联用的方法，证明能有效清除生物膜细菌。进一步采用小鼠慢性尿道感染模型，于尿道中植入临床大肠埃希菌生物膜，然后注射琥珀酸和氨苄青霉素。结果发现，添加琥珀酸和氨苄青霉素的实验组具有明显的杀菌效果，能显著减少生物膜上的耐药菌，说明琥珀酸可提高临床大肠埃希菌生物膜对氨苄青霉素的敏感性。以上结果表明，琥珀酸联合抗生素可以清除动物机体内的耐药菌。
综上所述，在抗生素中添加琥珀酸能明显提高细菌或耐药菌对抗生素的敏感性，从而达到抑菌或杀菌的目的。因此，本发明请求保护琥珀酸在提高细菌对抗生素敏感性方面的应用。
优选地，所述细菌为大肠杆菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华菌、铜绿假单胞菌或乙型链球菌中的至少一种。
优选地，所述抗生素选自氨苄青霉素、羟苄青霉素、青霉素G、庆大霉素、环丙沙星、四环素、红霉素、克林霉素或利福平中的至少一种。
优选地，为琥珀酸在提高大肠杆菌对氨苄青霉素敏感性方面的应用。
优选地，为琥珀酸在提高大肠杆菌对羟苄青霉素、青霉素G、庆大霉素、环丙沙星、四环素、红霉素、克林霉素或利福平敏感性方面的应用。
优选地，为琥珀酸在提高溶藻弧菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华菌、铜绿假单胞菌或乙型链球菌对氨苄青霉素敏感性方面的应用。
本发明还请求保护一种抑菌或杀菌的药物，含有抗生素和琥珀酸。
本发明还请求保护一种提高细菌对抗生素敏感性的方法，将琥珀酸与抗生素联用。
在上述方法中，所述细菌为敏感菌或耐药菌。
优选地，所述细菌包括但不限于大肠杆菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华菌、铜绿假单胞菌和乙型链球菌。因为这些细菌是常见的人类和养殖动物致病菌，如大肠杆菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌和铜绿假单胞菌均为革兰氏阴性菌，乙型链球菌为革兰氏阳性菌。这些细菌可以是耐药菌，也可以是敏感菌。
优选地，所述抗生素选自但不限于氨苄青霉素、羟苄青霉素、青霉素G、庆大霉素、环丙沙星、四环素、红霉素、克林霉素和利福平。因为氨苄青霉素、羟苄青霉素、青霉素G为β-内酰胺类抗生素；庆大霉素为氨基糖苷类抗生素；环丙沙星为喹诺酮类抗生素；四环素为四环素类抗生素；红霉素为大环内酯类抗生素；克林霉素为林可酰胺类抗生素；利福平为抗结核药类。这些包括了目前临床使用的主要抗生素类型。
优选地，所述的琥珀酸与抗生素的剂量比按重量计为1：0.0015～300。
优选地，应用上述方法来提高细菌对抗生素的敏感性时，琥珀酸的使用量为3mg～30g/次给药。
本发明还请求保护琥珀酸在制备清除生物膜细菌的制剂或药物中的应用。
优选地，所述细菌为临床大肠埃希菌。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明首次发现琥珀酸能够提高细菌对抗生素的敏感性，从而克服细菌耐药性的问题，进一步研究发现琥珀酸通过提高细菌的质子动力势，从而使进入细菌内部的抗生素含量增加。将琥珀酸与抗生素联用可以显著提高抗生素的杀菌作用，与现有的只用抗生素作为抗细菌药物相比，具有更好的效果以及更高的安全性和可操作性，具有较好的应用前景。
附图说明
图1为实施例1在不同浓度的氨苄青霉素中添加20mM琥珀酸后，临床大肠埃希菌的生存率；A为临床大肠埃希菌YT16，B为临床大肠埃希菌YT28。
图2为实施例1在10mg/mL氨苄青霉素中添加20mM琥珀酸后，不同时间下临床大肠埃希菌YT16和YT28的生存率。
图3为实施例1在10mg/mL氨苄青霉素中添加不同浓度琥珀酸后，临床大肠埃希菌YT16和YT28的生存率。
图4为实施例1在10mg/mL氨苄青霉素中添加20mM琥珀酸后，28株临床大肠埃希菌的生存率和杀菌率增加的倍数；A为生存率，B为杀菌率增加的倍数。
图5为实施例2在不同青霉素类抗生素中添加20mM琥珀酸后，临床大肠埃希菌YT16 和YT28的生存率；A为羟苄青霉素，B为羧苄青霉素，C为青霉素G钠盐。
图6为实施例2在不同中抗生素中添加20mM琥珀酸后，临床大肠埃希菌YT16的生存率；A为庆大霉素，B为环丙沙星，C为四环素、红霉素、克林霉素和利福平。
图7为实施例3在氨苄青霉素中添加20mM琥珀酸后，不同细菌的生存率。
图8为实施例4琥珀酸联合氨苄青霉素对临床大肠埃希菌的治疗效果；A为临床大肠埃希菌生物膜体外杀菌实验结果，B为在小鼠体内尿道和肾脏中耐药菌的清除效果。
图9为实施例5在氨苄青霉素中添加琥珀酸后，细菌体内氨苄青霉素含量变化情况。
图10为实施例6添加琥珀酸后，细菌质子动力势变化情况。
具体实施方式
下面结合说明书附图及具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。
实施例1 琥珀酸提高临床大肠埃希菌对氨苄青霉素的敏感性
1、临床大肠埃希菌耐药性分析
大肠埃希菌(Escherichia coli，E.coli)是临床中最常见的一种细菌，将从临床上获得的30株大肠埃希菌，命名为YT1～30。根据NCCLS方法检测这30株临床获得的大肠埃希菌对8种抗生素的最小抑菌浓度(MIC)，同时用大肠埃希菌K12作为对照。测定结果见表1，从此结果看出，这30株菌MIC均比对照E.coli K12高4倍以上(除YT1对头孢他啶的MIC与对照相同外)，即这30个临床大肠埃希菌均为多重耐药菌，特别是对氨苄青霉素的MIC是对照的64～4000倍。
表1 30种大肠埃希临床菌对8种抗生素的最小抑菌浓度(MIC)
  丁胺卡那霉素 氨苄青霉素 巴洛沙星 头孢他啶 盐酸克林霉素 庆大霉素 四环素 罗红霉素
对照 0.61 6.1 0.015 0.122 24.414 0.61 1.526 9.765
YT1 9.765 25000 0.244 0.122 390.625 2.441 6.1 39.0625
YT2 9.765 6250 3.906 0.488 390.625 156.25 24.414 625
YT3 9.765 390.625 15.625 0.488 390.625 156.25 97.656 625
YT4 9.765 6250 250 0.488 1562.5 9.765 390.625 156.25
YT5 9.765 25000 250 7.81 6250 625 390.625 625
YT6 9.765 1562.5 62.5 1.953 1562.5 156.25 97.656 625
YT7 9.765 1562.5 15.625 0.488 6250 625 97.656 625
YT8 9.765 1562.5 250 0.488 6250 625 97.656 625
YT9 2.441 1562.5 250 0.488 1562.5 156.25 97.656 625
YT10 39.0625 6250 15.625 7.812 6250 625 97.656 625
YT11 2500 1562.5 3.906 7.812 25000 2500 97.656 625
YT12 2500 6250 62.5 0.488 25000 2500 6250 625
YT13 2500 6250 62.5 0.488 25000 2500 6250 625
YT14 2500 6250 15.625 0.488 25000 2500 6250 2500
YT15 2500 6250 15.625 0.488 25000 2500 6250 2500
YT16 2500 6250 250 0.488 25000 2500 6250 625
YT17 2500 6250 250 0.488 25000 2500 6250 625
YT18 2.441 6250 62.5 0.488 390.625 2.441 1562.5 625
YT19 9.76 1562.5 62.5 0.488 390.625 625 1562.5 625
YT20 2.441 1562.5 62.5 0.122 390.625 156.25 1562.5 625
YT21 2500 1562.5 15.625 0.488 390.625 2500 1562.5 625
YT22 625 6250 62.5 0.488 390.625 2500 1562.5 625
YT23 9.765 1562.5 15.625 0.488 390.625 156.25 1562.5 625
YT24 9.765 6250 15.625 7.812 390.625 625 1562.5 625
YT25 2500 6250 0.244 31.25 390.625 2500 6.103 625
YT26 2500 6250 15.625 31.25 390.625 2500 97.656 625
YT27 9.765 6250 15.625 0.488 390.625 625 97.656 625
YT28 2500 1562.5 15.625 31.25 1562.5 2500 390.625 2500
YT29 9.765 6250 15.625 7.812 390.625 625 390.625 625
YT30 2.441 25000 15.625 7.812 390.625 39.0625 390.625 156.25
2、试验样本的准备
为研究琥珀酸是否可提高临床大肠埃希菌对氨苄青霉素的敏感性，选取30株临床菌中的2株(YT16和YT28)，对临床菌在不同浓度琥珀酸、不同浓度抗生素以及不同作用时间，对氨苄青霉素敏感性提高的效果进行了深入研究。
从固体LB平板上挑取临床菌的单菌落，接种于5mL LB液体培养基中，于37℃、200rpm条件下培养16h；按1：100(v/v)的比例接种于100mL LB液体培养基中，于37℃培养至OD 600值为1.0。收集20mL菌液，于8000rpm条件下离心5min，除去上清并用等体积0.85％生理盐水洗涤菌体，最后用1×M9基本培养基(含10mM乙酸盐)悬浮菌体，调菌液OD值为0.5，然后分装5mL于试管中，用于以下试验研究。
3、琥珀酸胺提高临床菌对抗生素敏感性具有抗生素浓度梯度效应
为了解在不同抗生素浓度时琥珀酸提高临床菌对抗生素敏感性的作用，设置20mM琥珀酸及四个浓度的氨苄青霉素(2.5、5、10和20mg/mL)分别处理细菌，4h后进行活菌计数，比较在相同抗生素浓度情况下，添加琥珀酸和未添加琥珀酸后临床菌的生存率。
结果表明，在加入琥珀酸后，随着氨苄青霉素浓度的升高，其对临床菌杀菌效率的提高越显著。具体情况是：
对于临床菌YT16(如图1A所示)，添加20mM琥珀酸后，当氨苄青霉素浓度为2.5mg/mL时，杀菌效率提高了2倍多(生存率由未添加琥珀酸的61.04％下降到添加琥珀酸后的30.06％)； 当氨苄青霉素浓度为5mg/mL时，临床菌的杀菌效率则提高到16.75倍(生存率由未添加琥珀酸的34.53％下降到添加琥珀酸后的2.06％)；当氨苄青霉素浓度为10mg/mL时，临床菌的杀菌效率提高了62.25倍(生存率由未添加琥珀酸的25.99％下降到添加琥珀酸后的0.41％)；当氨苄青霉素浓度为20mg/mL时，临床菌的杀菌效率提高了105.96倍(生存率由未添加琥珀酸的12.47％下降到添加琥珀酸后的0.12％)。
对于临床菌YT28(如图1B所示)，添加20mM琥珀酸后，当氨苄青霉素浓度为2.5mg/mL时，杀菌效率提高了1.65倍多(生存率由未添加琥珀酸的68.38％下降到添加琥珀酸后的41.62％)；当氨苄青霉素浓度为5mg/mL时，临床菌的杀菌效率则提高到4.42倍(生存率由未添加琥珀酸的56.25％下降到添加琥珀酸后的12.71％)；当氨苄青霉素浓度为10mg/mL时，临床菌的杀菌效率提高了21.06倍(生存率由未添加琥珀酸的35.87％下降到添加琥珀酸后的1.7％)；当氨苄青霉素浓度为20mg/mL时，临床菌的杀菌效率提高了34.48倍(生存率由未添加琥珀酸的27.09％下降到添加琥珀酸后的0.79％)。
4、琥珀酸提高临床菌对抗生素敏感性具有时间效应
为进一步了解琥珀酸提高临床菌对抗生素敏感性的作用是否具有时间效应，在添加20mM琥珀酸和10mg/mL氨苄青霉素时，分别在1～7h内进行活菌计数，观察其杀菌效率与时间的关系。
结果如图2所示，临床菌在添加氨苄青霉素基础上再添加琥珀酸后，活菌数随着时间的延长明显下降：
YT16在1h时，杀菌效率仅为1.33倍(生存率由仅添加氨苄青霉素的93.89％降低到添加氨苄青霉素和琥珀酸后的71.54％)，而4h时杀菌效率达到60.66倍(生存率由47.34％降低到0.78％)，7h时杀菌效率达到1744.19倍(生存率由18.45％降低到0.01％)。
YT28在1h时，杀菌效率仅为1.44倍(生存率由96.79％降低到66.81％)，而4h时杀菌效率达到21.45倍(生存率由26.79％降低到1.25％)，7h时杀菌效率达到78.34倍(生存率由14.18％降低到0.18％)。
5、琥珀酸提高临床菌对抗生素的敏感性具有浓度依赖性
为了解琥珀酸浓度与杀菌效率之间是否存在梯度效应以及其最佳杀菌浓度，在添加10mg/mL氨苄青霉素的基础上加入不同浓度的琥珀酸(1.25mM～20mM)作用4h，然后进行活菌计数，并计算生存率，公式为添加不同浓度琥珀酸浓度时活菌数/不添加琥珀酸时活菌数×100％。
结果如图3所示，YT16没有添加琥珀酸的生存率为73.8％，而随着添加琥珀酸浓度的升 高，细菌的生存率从69.23％降低为1.19％，杀菌效率从1.07倍提高至61倍。YT28没有添加琥珀酸的生存率为86.21％，而随着添加琥珀酸浓度的升高，细菌的生存率从80.31％降低为4.24％，杀菌效率从1.07倍提高至20倍。
6、琥珀酸提高临床大肠埃希菌对氨苄青霉素的敏感性是普遍存在的
为研究添加琥珀酸后，不同耐药性的临床大肠埃希菌是否对氨苄青霉素的敏感性都得到了提高，参照本实施例步骤2的方法制备其余28株临床菌样品，分别添加20mM琥珀酸和10mg/mL氨苄青霉素，作用4h后统计活菌数量，计算生存率。
结果如图4所示，琥珀酸能提高所有临床菌对氨苄青霉素的敏感性(如图4A所示)，其提高敏感性的程度不同，提高倍数在17～127倍之间(如图4B所示)。
实施例2 琥珀酸提高临床大肠埃希临床耐药菌对其他抗生素的敏感性
1、提高对青霉素类抗生素的敏感性
为研究添加琥珀酸后，临床大肠埃希菌是否对青霉素类抗生素都有作用效果，按照实施例1步骤2制备YT16和YT28两种临床大肠埃希菌样品，分别添加20mM琥珀酸和3种青霉素，作用4h后统计活菌数量，计算生存率。
结果表明，琥珀酸能提高临床大肠埃希菌YT16和YT28对这3种抗生素的敏感性。具体情况如下：
对于羟苄青霉素，加入20mM琥珀酸后，添加5mg/mL羟苄青霉素可分别提高YT16和YT28的敏感性15.86和13.94倍；添加7.5mg/mL羟苄青霉素可分别提高YT16和YT28的敏感性为3.37和31.85倍(如图5A所示)。
对于羧苄青霉素，加入20mM琥珀酸后，添加1.25mg/mL羧苄青霉素可分别提高YT16和YT28的敏感性1.99和1.8倍；添加2.5mg/mL羧苄青霉素可分别提高YT16和YT28的敏感性11.65和15.85倍(如图5B所示)。
对于青霉素G钠盐，加入20mM琥珀酸后，添加0.5mg/mL青霉素G钠盐可分别提高YT16和YT28的敏感性4.96和2.66倍；添加0.75mg/mL青霉素G钠盐可分别提高YT16和YT28的敏感性5.13和9.34倍(如图5C所示)。
2、提高对其他抗生素的敏感性
为研究添加琥珀酸后，临床大肠埃希菌是否对青霉素类以外的其他抗生素也有效，实施例1步骤2制备YT16样品，分别添加20mM琥珀酸和多种抗生素(庆大霉素，环丙沙星，四环素，红霉素，克林霉素和利福平)，作用4h后统计活菌数量，计算生存率。
结果如图6所示，琥珀酸均能提高YT16对这几种抗生素的敏感性2倍左右。
实施例3 琥珀酸提高多种细菌对氨苄青霉素的敏感性
挑取大肠杆菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、迟钝爱德华菌、铜绿假单胞菌、乙型链球菌等多种细菌单克隆到100mL LB液体培养基中，于37℃或30℃、200rpm条件下培养16h达饱和状态。分别收集20mL各细菌菌液，于8000rpm条件下离心5min，除去上清并以等体积的0.85％生理盐水洗涤菌体，最后用1×M9基本液体培养基(含10mM乙酸盐)悬浮菌体，调节菌液OD值至0.5，然后分别分装5mL于试管中备用。
将上述制备好的菌液按照细菌种类分别分为2组：对照组(只添加氨苄青霉素)和实验组(添加氨苄青霉素和琥珀酸)。添加20mM琥珀酸和各自菌2倍最低抑菌浓度的氨苄青霉素，于37℃、200rpm摇床中孵育4h后，取100μL菌液进行活菌计数，计算其生存率。
结果如图7所示，添加琥珀酸后，这些细菌对氨苄青霉素的敏感性普遍都提高了1.5～2.2倍。
综上所述，添加琥珀酸不仅能提高临床大肠埃希菌对氨苄青霉素的敏感性，青霉素类其他3种抗生素也具有类似的效果，而且也能提高临床大肠埃希菌对其他抗生素的敏感性。琥珀酸还能提高多种细菌对氨苄青霉素的敏感性。以上结果表明，可以通过抗生素与琥珀酸联合使用来提高细菌对抗生素敏感性的方法来达到治疗细菌(包括临床大肠埃希耐药菌)的目的。
实施例4 琥珀酸可提高临床大肠埃希菌生物膜的清除效率
1、临床大肠埃希菌生物膜的制备
挑取9株临床大肠埃希菌(YT3,11,12,16,17,21,22,23,28,33)单克隆于LB培养基中过夜培养，按1：200转接至2mL新鲜LB培养基中，并加入经紫外灭菌的6mm PE-50生物导管，于37℃培养箱中培养24h，每天用1mL LB培养基更换菌液，将导管连续培养3天。将制备好的生物膜用1mL无菌生理盐水洗涤5遍后置于1.5mL EP管中。
2、生物膜体外杀菌实验
实验分为4组：生理盐水对照组、琥珀酸组、氨苄青霉素组、氨苄青霉素+琥珀酸组，于37℃、200rpm摇床中处理导管。琥珀酸的使用剂量为580mg/kg，氨苄青霉素使用剂量为：对于YT16为2000mg/kg，对于YT28为500mg/kg。6h后，超声波清洗15min，将导管上的生物膜洗脱并充分混匀，梯度稀释后点板计数。细菌存活率计算公式为：每组活菌数/对照组活菌数×100％。
3个实验组生物膜上的细菌生存率如图8A所示，由此结果可以看出：(1)单独使用琥珀酸和氨苄青霉素不能清除生物膜上的大肠埃希临床菌；(2)只有当二者联合使用时才可清除大肠埃希临床菌，且其清除效率较明显，可提高9～106倍。
3、琥珀酸可提高氨苄青霉素耐药菌的体内清除效果
进一步以小鼠为试验动物，将制备好的临床大肠埃希临床菌生物膜植入小鼠尿道中，构建小鼠慢性尿道感染模型，进行体内临床大肠埃希菌清除试验：向5周龄昆明雌性小鼠(约20g)尿道中植入培养3天形成的临床大肠埃希菌生物膜的6mm PE-50生物导管。48h后，将小鼠分为2组，每组5只，分别为氨苄青霉素组和氨苄青霉素+琥珀酸组。小鼠于腹腔注射590mg/kg琥珀酸和适量的氨苄青霉素抗生素(MIC＝6250μg/mL的细菌注射2000mg/kg，MIC＝1560μg/mL的细菌注射500mg/kg)，每天2次，连续3天。最后一次24h后，取导管管材于生理盐水中超声悬浮生物膜细菌，梯度稀释并平板计数，计算导管生物膜上的细菌存活率。计算公式为注射物质组活菌数/对照组活菌数×100％。
如图8B所示，结果表明，添加抗生素的同时添加琥珀酸能显著减少生物膜上的耐药菌，9株菌的杀菌效率分别增加了14、5、53、30、5、9、38、17和53倍。结合上述生物膜试验结果，说明琥珀酸可提高临床大肠埃希菌生物膜对氨苄青霉素的敏感性。
实施例5 琥珀酸提高临床大肠埃希菌中氨苄青霉素的含量
细菌死亡与进入细菌内部的抗生素数量有关，细菌耐药是由于进入细菌体内的抗生素浓度低于使其死亡的浓度。为研究琥珀酸提高临床大肠埃希菌对抗生素敏感性的作用机理，验证是否通过增加进入细菌内部的抗生素数量而起作用，按照实施例1步骤2的方法制备细菌样本，将实验分为2组：1个对照组(只添加氨苄青霉素)和1个实验组(添加氨苄青霉素和琥珀酸)，于37℃、200rpm条件下摇床孵育6h。将培养好的细菌清洗后重悬于生理盐水中，调节OD 600值至1.0，取1mL菌体超声破碎，离心后取上清用于抗生素含量测定。采用氨苄青霉素ELISA快速诊断试剂盒(购自深圳市绿诗源生物科技有限公司，检测范围在2～1000g/mL)进行检测，具体步骤如下：将50μL样品(或标准品)和50μL抗体加入96孔板中，轻轻混匀后于25℃孵育30min，洗板4～5次；加入酶标物100μL，轻轻混匀后于25℃避光孵育30min，洗板4～5次；分别加入50μL底物A和B，轻轻混匀后于25℃避光孵育15min；最后加入反应终止液终止反应，设定酶标仪于450nm处测定反应产物的吸光值。以标准品的百分吸光率为纵坐标，以氨苄青霉素标准品浓度(ng/mL)的半对数为横坐标绘制标准曲线，AMP实际浓度＝样品检测浓度×稀释倍数。
结果如图9所示，添加氨苄青霉素和琥珀酸的实验组细菌体内抗生素数量，与只加氨苄青霉素对照组相比，YT16增加了5.97倍，YT28增加了7.99倍。结果表明琥珀酸确实可以提高进入细菌体内的抗生素数量。
实施例6 琥珀酸提高临床大肠埃希菌的质子动力势
由实施例5可知，添加琥珀酸后，进入临床大肠埃希菌内部的抗生素数量显著增加，但具体的作用机理尚不清楚。为研究琥珀酸促进抗生素进入细菌内部的作用机理，将实验(实验样品制备按照实施例1步骤2的方法进行)分为2组：1个对照组(不添加氨苄青霉素和琥珀酸)和1个实验组(添加琥珀酸)，于37℃、200rpm条件下摇床孵育6h。将经过处理的细菌分别调节浓度至10 6CFU/mL，取1mL转移至1.5mL EP管中，加入10μL 3mM DiOC 2(3,3'-diethyloxa-carbocyanine iodide)，充分混匀后于37℃振荡孵育30min。上机前转移至流式细胞术分析管中，使用流式细胞仪FACSCalibur flow cytometer(Becton Dickinson,San Jose,CA,USA)进行检测，参数设置按照仪器操作规程进行。染料DiOC 2(3)的绿色荧光激发波长488nm，发射波长530nm，红色荧光激发波长488nm、发射波长610nm。红光强度与绿光强度的比值表示膜电位的强度，质子动力势(PMF)值计算公式为LOG(10 3/2*Y mean/X mean)，Y mean和X mean分别表示红光强度和绿光强度，按照BacLight bacterial membrane potential kit(Invitrogen)试剂盒说明进行测定。
结果如图10所示，发现添加琥珀酸后，细菌的质子动力势增加1.2倍(YT16)和1.45倍(YT28)。此结果表明，添加琥珀酸后可引起细菌质子动力势增加，由此使进入细菌内部的抗生素含量增加，最终使细菌死亡。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (10)

  1. 琥珀酸在提高细菌对抗生素敏感性方面的应用。
  2. 一种抑菌或杀菌的药物，其特征在于，含有抗生素和琥珀酸。
  3. 一种提高细菌对抗生素敏感性的方法，其特征在于，将琥珀酸与抗生素联用。
  4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述细菌为敏感菌或耐药菌。
  5. 根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述细菌为大肠杆菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华菌、铜绿假单胞菌或乙型链球菌中的至少一种。
  6. 根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述抗生素选自氨苄青霉素、羟苄青霉素、青霉素G、庆大霉素、环丙沙星、四环素、红霉素、克林霉素或利福平中的至少一种。
  7. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述琥珀酸与抗生素的剂量比按重量计为1：0.0015～300。
  8. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述琥珀酸的使用量为3mg～30g/次给药。
  9. 琥珀酸在制备清除生物膜细菌的制剂或药物中的应用。
  10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述细菌为临床大肠埃希菌。
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