CN110711192A - 色氨酸增强对革兰氏阴性菌杀菌作用的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了色氨酸具有增强革兰氏阴性菌杀菌效果的作用，具体涉及色氨酸在制备革兰氏阴性菌杀菌药物中的应用。本发明设计实验证明了庆大霉素和卡那霉素中添加色氨酸能够提升细菌胞内活性氧水平，同时还能够提升细菌对于抗生素的吸收从而改善细菌对药物的敏感性，充分验证了色氨酸对革兰氏阴性菌的诱杀作用以及对耐药菌的杀菌效果的提升。基于以上发现，本发明相应的保护色氨酸的第二医疗用途、一种杀菌组合物以及一种杀菌药物以及一种杀菌方法。

Description

色氨酸增强对革兰氏阴性菌杀菌作用的应用
技术领域
本发明涉及杀灭革兰氏阴性菌技术领域，具体涉及色氨酸能够增强抗生素杀灭革兰氏阴性细菌的应用。
背景技术
随着抗生素的广泛使用，出现越来越多的抗性菌和耐药菌。这给今后的细菌性的感染治疗带来的了极大地困难。耐药菌又是引起慢性以及反复性感染的重要原因，例如尿路感染。现有的研究结果表明90％的慢性尿路感染是由大肠杆菌引起的。然而新型抗生素的研发周期也比较长，加上细菌随着环境的变化有更多的适应机制，因而安全有效地杀菌增强剂是非常有前景的治疗细菌性感染的有效途径。如果能同时针对抗性菌和耐药菌都有良好地增强效果是非常有临床应用前景的。
色氨酸是人体所必须的8种氨基酸之一，主要有缓解失眠，帮助稳定情绪的作用，并且与维生素B6烟酸及镁一起在大脑中发生作用，制造血液中的血清素，是一种必须的神经活动传导物质及使人正常睡眠的神经激素，对人体的各种生理功能的维持起着重要的作用。此外色氨酸作为添加剂还能改善精神状态，减少抑郁的发生。因此色氨酸作为杀菌的增强剂是一种更加安全可靠的途径。
发明内容
本发明验证了色氨酸能够通过提升细胞内活性氧(ROS)的水平促进杀菌，并且色氨酸能够提升细菌对抗生素的敏感性以杀灭抗性菌、降低耐药菌产生的效果。
基于本发明的实验结论，本发明提供色氨酸在制备杀菌药物中的应用、并提供了一种杀菌组合物以及一种杀菌药物以及一种杀菌方法。
本发明目的之一提供一种色氨酸在制备杀菌药物中的应用，其特征在于所述杀菌药物是针对革兰氏阴性菌的药物。
优选的，革兰氏阴性菌为敏感型大肠杆菌和抗药性大肠杆菌。
进一步的，上述抗药性大肠杆菌为抗氨基糖苷类大肠杆菌。
更进一步的，杀菌药物为庆大霉素和卡那霉素。
本发明还提供一种杀菌组合物，其特征在于，成分为抗生素和色氨酸的组合。
优选的，上述抗生素为氨基糖苷类抗生素。
进一步的，上述氨基糖苷类抗生素为庆大霉素或卡那霉素。
本发明还提供一种杀菌药物，针对的细菌为革兰氏阴性菌，其特征在于，该杀菌药物具体成分为上述杀菌组合物中的一种。
本发明还提供一种杀灭革兰氏阴性菌的方法，特征在于，本方法中所用药物为上述杀菌组合物与药学上可接受的辅料制成的制剂。
本发明的有益效果
1.细菌获得耐药性后将使化药的治疗效果大大下降，同时，耐药基因可通过质粒遗传，成为固有耐药菌。而色氨酸联合抗生素能够收获更好的治疗效果，降低化药使用剂量，减少耐药菌的产生，为杀菌药物的研发提供了一种新的思路。
2.色氨酸作为人体必须的氨基酸，机体接受性高，毒副作用小，研发成本低。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
图1抗生素联合色氨酸处理敏感菌和抗性菌的存活率图；
(a)：对数生长期的MG1655在不同浓度的庆大霉素(0mg/L,1mg/L,2mg/L,3mg/L,4mg/L)以及有无5mM的色氨酸处理二十四个小时细菌存活率结果。
(b):对数生长期的MG1655在不同浓度的卡纳霉素(0mg/L,0.5mg/L,1.5mg/L,2.5mg/L,3.5mg/L)以及有无5mM的色氨酸处理二十四个小时后细菌存活率。
(c):在低于最小抑菌浓度的庆大霉素2mg/L或者1.5mg/L的卡那霉素处理中，依次添加不同浓度的色氨酸，测定细菌生存率结果。
(d):稳定期的MG1655在庆大霉素60mg/L或者卡那霉素40mg/L以及有无5mM 的色氨酸处理一个小时后细菌存活率。
(e):色氨酸对于抗性菌的杀菌效果。对数生长期的EY1经过庆大霉素60mg/L或者卡那霉素40mg/L单独处理或者联合5mM的色氨酸联合处理24小时后细菌的存活率。
图2色氨酸对于耐药菌产生比率的影响图；
(a):按照1％的转接量转接过夜培养物到新鲜的培养基中，培养不同的时间(从3个小时到9个小时)的MG1655经过60mg/L的庆大霉素处理5个小时后，添加不同浓度的色氨酸处理30分钟后耐药菌产生的比率。
(b):按照1％的转接量转接过夜培养物到新鲜的培养基中，培养不同的时间(从3个小时到9个小时)的MG1655经过40mg/L的卡纳霉素处理5个小时后，添加不同浓度的色氨酸处理30分钟后耐药菌产生的比率。
(c):色氨酸对于耐药菌的杀菌效果。对数生长期的MG1655经过庆大霉素60mg/L或者卡那霉素40mg/L处理5个小时后，离心菌体，利用1*PBS缓冲液冲洗一次，离心。分两部分，一部分直接活菌计数，另一部分再加入抗生素单独处理或抗生素和5mM 的色氨酸联合处理五个小时，比较处理前后细菌的比例。
图3细菌胞内活性氧的测定结果图
对数生长期和稳定期的MG1655在60mg/L的庆大霉素单独处理或者5mM的色氨酸联合处理一个小时细胞内活性氧水平测定结果。
图4抗生素吸收测定结果图。
(a)对数生长期的MG1655在不同浓度的色氨酸下对于Texas Red标记的庆大霉素的吸收。
(b)稳定期的MG1655在不同浓度的色氨酸下对于Texas Red标记的庆大霉素的吸收。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
实施例1：敏感菌株MG1655和抗性菌EY1的最小抑菌浓度测定
选用庆大霉素和卡那霉素作为本实验中抗生素的代表药物，加入生理盐水将抗生素进行系列稀释，将倍比稀释后的抗菌溶液加入到灭菌的96孔板中，冰冻干燥后加入肉汤培养的菌悬液，确定最小的抑制菌体生长的浓度MIC，结果为下表所示
表1.最小抑菌浓度MIC测定(mg/L)：
菌株 庆大霉素 卡那霉素
MG1655 4 3.5
EY1 240 220
实施例2：杀菌效果实验
选取对数生长期和稳定期的大肠杆菌MG1655，向培养基中加入相同浓度的庆大霉素(0mg/L,1mg/L,2mg/L,3mg/L,4mg/L)和卡那霉素(0mg/L,1mg/L,2mg/L,3 mg/L,4mg/L)以及加入5mM色氨酸后的庆大霉素和卡那霉素处理24h，通过活菌计数的方法计算处理后各实验组存活的细菌数量，以确定各组药物的杀菌效果。实验结果如图1中(a)(b)(d)所示：与庆大霉素合用时，色氨酸在3mg/L以及最小抑菌浓度4mg/L时杀菌效果较未加色氨酸的实验组提高了100倍，与卡那霉素合用时，色氨酸在1.5mg/L至最小抑菌浓度3.5mg/L能提高杀菌10-100倍，对于稳定期的MG1655， 5mM色氨酸与庆大霉素60mg/L或者卡那霉素40mg/L合用能够提高稳定期的杀菌效率10倍左右。
实施例3：测定耐药菌产生比率
按照1％的转接量转接过夜培养物到新鲜的培养基中，培养不同的时间(从3个小时到9个小时)的MG1655经过60mg/L的庆大霉素和40mg/L的卡纳霉素处理5个小时后，添加不同浓度的色氨酸处理30分钟，通过活菌计数的方法比较处理前后细菌的比例来确定耐药菌产生的比率。实验结果如图2中(a)(b)所示，色氨酸浓度依赖性的降低耐药菌的产生。降低的效率可达10-1000倍。
实施例4：捕杀耐药菌的效果
选取对数期生长的MG1655经过庆大霉素60mg/L或者卡那霉素40mg/L处理5 个小时后，离心菌体，利用1*PBS缓冲液冲洗一次，离心。分两部分，一部分直接活菌计数，另一部分再加入抗生素单独处理或抗生素和5mM的色氨酸联合处理五个小时，比较处理前后细菌的比例，结果如附图2(c)所示，色氨酸对于耐药菌的杀菌效率可以达到80-90％。
实施例5：活性氧的测定
选取对数生长期和稳定期的MG1655分别加入60mg/L的庆大霉素单独处理或者5mM的色氨酸联合处理一个小时后，通过分子探针H2DCFDA试剂盒 (Invitrogen#C400)来测定细菌胞内的活性氧水平，结果如附图3所示，细菌胞内的活性氧检测结果表明色氨酸能够提高胞内活性氧的水平，从而起到增强杀菌的效果。
实施例6：细菌胞内抗生素积累状态测定
分别向对数期和稳定期的MG1655中加入0mM，1mM,5mM,10mM浓度的色氨酸培养，使用细胞流式仪检测细菌吸收Texas Red标记的庆大霉素的情况。结果如附图4 中(a)(b)所示，对于对数生长期和稳定生长期的MG1655，色氨酸能够提升细菌对于抗生素的吸收，并呈现剂量依赖性。
以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (9)

1.色氨酸在制备杀灭革兰氏阴性菌药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于所述革兰氏阴性菌为敏感型大肠杆菌和抗药性大肠杆菌。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抗药性大肠杆菌为抗氨基糖苷类大肠杆菌。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述氨基糖苷类药物为庆大霉素和卡那霉素。
5.一种针对革兰氏阴性菌的杀菌组合物，其特征在于，成分为抗生素和色氨酸。
6.如权利要求5所述的杀菌组合物，其特征在于，所述抗生素为氨基糖苷类抗生素。
7.如权利要求6所述的杀菌组合物，其特征在于，所述氨基糖苷类抗生素为庆大霉素或卡那霉素。
8.一种针对革兰氏阴性菌的杀菌药物，其特征在于，所述杀菌药物具体成分为权利要求5-7中的杀菌组合物以及药学上可接受的辅料和载体。
9.一种杀灭革兰氏阴性菌的方法，其特征在于，本方法中所用药物为权利要求8中的杀菌组合物与药学上可接受的辅料制成的制剂。
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