CN104971342A - 一种抗甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌的药物组合物 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)的一种药物组合物，具有抗MRSA感染的作用。头孢他啶和氨苄青霉素具有抑制细菌细胞壁合成的作用，而Cbf-K₁₆则是阳离子抗菌肽，具有细胞膜穿透作用。本发明采用棋盘法、杀菌曲线法研究多肽Cbf-K₁₆与头孢他啶或氨苄青霉素联合使用的体外抗菌活性，结果表明，该药物组合物具有显著的体外协同抗MRSA活性。同时，体内研究表明，多肽Cbf-K₁₆与头孢他啶或氨苄青霉素组成的药物组合物对MRSA引起的动物全身感染具有显著的疗效，表明其对MRSA具有显著的体内外协同抗菌活性，其在临床治疗MRSA感染性疾病方面具有较好的应用前景。

Description

一种抗甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌的药物组合物

技术领域

本发明涉及协同抗甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌(MRSA)感染的药物组合物，该药物组合物包括抗菌肽Cbf-K₁₆和选自头孢他啶或氨苄青霉素在内的抗生素。

背景技术

抗生素自用于细菌性感染的治疗以来，大大延长了人的寿命。然而，随着抗生素的大量使用，抗生素耐药性问题也日益严重，细菌耐药性的产生速度远远超出了新抗生素的开发速度。金黄色葡萄球菌是临床感染的主要病原菌之一，可以引起如皮肤软组织感染、肺炎、菌血症、手术部位及导管相关性感染等，严重危害人类的健康。过去的20年里，MRSA已成为医院感染的重要病原菌，受到世界范围的广泛关注。MRSA具有多重耐药性，对包括β-内酰胺类、氨基糖苷类、氟喹诺酮类、四环素类、大环内酯类、林可霉素等多种抗菌药物耐药。万古霉素是治疗MRSA感染的首选药物，有较强的抗MRSA活性，能够降低其致病力。然而，近年来在日本和美国等地先后出现了对万古霉素中度耐药(VISA)或耐药(VRSA)的MRSA，给万古霉素对MRSA的治疗带来了挑战。因此，单一抗生素针对MRSA感染的治疗已经无法满足临床的需要。

头孢他啶、氨苄青霉素为半合成的广谱β-内酰胺类抗生素，主要作用于青霉素结合蛋白(PBPs)。PBPs是细菌细胞壁肽聚糖生物合成的重要酶，具有催化肽聚糖聚合(转糖基)和交联(转肽)的作用，在细菌细胞壁的生物合成、细胞分裂和形态维持中发挥重要作用。这两种抗生素通过抑制PBPs在细菌细胞壁肽聚糖的合成、细胞生长以及维持细胞形态过程中的作用，导致细菌细胞壁的完整性被破坏，原生质流失，从而达到杀灭细菌的目的。但是，MRSA对头孢他啶和氨苄青霉素具有一定的耐药性；其耐药机制主要有两种，一是产生β-内酰胺酶以降解药物，另一种是产生特异的青霉素结合蛋白PBP2a，取代对β-内酰胺抗生素具有高亲和力的PBP2和PBP3的功能。

抗菌肽作为一类天然的小分子多肽，因其独特的作用机制及广谱杀菌性，近年来备受人们的关注。抗菌肽的活性高，对细菌、真菌、病毒和寄生虫等均有抑制作用；而其独特的作用机制，使得病原体不易对其产生耐药性。因此，抗菌肽有望成为新一代的抗菌药物。Cbf-K₁₆是发明人在前期研究中，将抗菌肽Cathelicidin-BF部分活性氨基酸位点进行突变，采用固相化学合成法获得的对耐药性病原菌具有高抑制活性的抗菌肽，其具有SEQ ID No：1所示的氨基酸序列，其分子量为3637.63Da，全序列为：赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-精氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸。体外抗菌活性研究表明，Cbf-K₁₆具有一定的杀灭耐药性细菌的作用。该技术记载于本专利发明人周长林等已申请的中国专利ZL201210171901.8中。

发明内容

本发明针对MRSA对传统抗生素敏感性下降，提出一种抗MRSA的药物组合物，能有效地预防和治疗MRSA引起的感染。

本发明公开了一种抗菌肽Cbf-K₁₆与抗生素的复方药物组合物，由药物活性组分和药学上可接受的载体组成，其中药物活性组分含序列为SEQ ID No：1的多肽(即多肽Cbf-K₁₆)及选自头孢他啶、氨苄青霉素在内的任一组分，构成复方药物。

多肽Cbf-K₁₆与选自头孢他啶或氨苄青霉素中的任一组分的重量比可选8∶1-1∶8。优选4∶1-1∶4。更优选1∶1-1∶2。最优选1∶1。

可通过常规的操作手段，向药物活性组分中直接或间接加入药学上可接受的辅料制成胶囊剂、颗粒剂、丸剂、散剂、片剂、口服液、糖浆、口崩片、含漱液、细粒剂、粉末、或者注射剂等剂型供临床应用。

下面是本发明的部分抗菌试验及结果：

一、抗菌肽Cbf-K₁₆、头孢他啶和氨苄青霉素的药效、优选配比研究以及协同作用评价

(1)接种物的制备

将实验所需菌株从保藏的甘油管中接至营养琼脂斜面，37℃培养16h，接种环挑取少许接种至2ml营养肉汤培养基，37℃培养8h，用MH肉汤培养基稀释成1×10⁵CFU/ml左右的细菌悬液。

(2)药物的配置

称取一定量的Cbf-K₁₆、头孢他啶、氨苄青霉素，溶于无菌的生理盐水中，配制成浓度为1024μg/ml的母液，经0.22μm滤膜过滤除菌，分装。置于-20℃备用。

(3)最小抑菌浓度(MIC)的测定

将1×10⁵CFU/ml左右的细菌悬液接种至96孔板中，每孔100μl。然后等体积加入经MH倍比稀释的药物。使最终药物浓度为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml。同时设不含药物的空白对照组。37℃培养16-20h。观察结果，记录最低不长菌的药物浓度，即为最低抑菌浓度。结果见表1。

表1 抗菌肽Cbf-K₁₆与抗生素对细菌的MIC

由表1可看出，本发明所选的耐药性细菌临床株对头孢他啶、氨苄青霉素都表现出较强的耐药性，MIC值均大于64μg/ml；而对抗菌肽Cbf-K₁₆相对敏感，MIC值均小于32μg/ml。

(4)Cbf-K₁₆与抗生素优选配比研究

用无菌MH肉汤培养基将药物原液倍比稀释成含药浓度为1024、512、256、128、64、32、16、8、4、2μg/ml的药液。根据MIC值，由低到高依次将2种抗菌药物按棋盘法设计，两两组合加入96孔板中，每种抗菌药物加50μl，再取100μl菌液加入孔中，置37℃培养箱中培养16-20h。另设不含药组作为对照。观察抗菌效果，并记录联合的MIC值。通过计算部分抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration，FIC)判断相互作用。FIC指数为≤0.5、＞0.5-1、＞1-2、＞2时分别表示协同、相加、无关、拮抗作用。结果见表2。

表2 Cbf-K₁₆与抗生素优选配比研究

由表2可知，Cbf-K₁₆与抗生素联用时，不同的配比对MRSA的活性不同。在Cbf-K₁₆与抗生素重量比为8∶1-1∶8范围内有协同效果，在Cbf-K₁₆与抗生素重量比为4∶1-1∶4范围内协同效果明显，2∶1-1∶2时效果更好，Cbf-K₁₆与抗生素以1∶1配比时协同效果最高。

(5)棋盘法测定Cbf-K₁₆与抗生素联用的效果

用无菌MH肉汤培养基将药物原液倍比稀释成含药浓度为1024、512、256、128、64、32、16、8、4、2μg/ml的药液。根据MIC值，由低到高依次将2种抗菌药物按棋盘法设计，两两组合(Cbf-K₁₆∶抗生素重量比＝1∶1)加入96孔板中，每种抗菌药物加50μl，再取100μl菌液加入孔中，置37℃培养箱中培养16-20h。另设不含药组作为对照。观察抗菌效果，计算FIC。结果见表3。

表3 Cbf-K₁₆与头孢他啶或氨苄青霉素联用对耐药株的MIC值以及部分抑菌浓度指数(FIC)

由表3可以看出，Cbf-K₁₆与抗生素联合用药对MRSA显示出较强的协同抗菌活性，FIC指数均≤0.5。但药物组合物对耐药性革兰阴性细菌大肠埃希菌没有显示出联用活性，FIC指数均＞0.5。

二、抗菌肽Cbf-K₁₆与抗生素联用的药物组合物对MRSA的杀菌活性

(1)抗菌肽Cbf-K₁₆与抗生素联用后对MRSA的杀菌曲线的绘制

将1/2×MIC浓度的抗菌肽Cbf-K₁₆分别与1/2×MIC的抗生素混合(Cbf-K₁₆∶抗生素重量比＝1∶1)，再与制备好的10⁶CFU/ml的菌悬液混合，使终浓度为10⁵CFU/ml左右。在0、1、2、4、8和24h时，吸取培养物系列稀释，进行活菌计数，每个稀释度做三个平行实验，计算平均值。然后以细菌浓度的对数值为纵坐标，药物作用时间为横坐标，绘制杀菌曲线。结果见图1、2。

本实验分别测定了抗菌肽Cbf-K₁₆分别与头孢他啶、氨苄青霉素联用对MRSA的杀菌曲线。

由图1可以看出，Cbf-K₁₆与头孢他啶联用对MRSA杀菌效果显著。从1h开始，联用组的菌体浓度呈持续下降趋势，4h时菌浓已下降5个lg CFU/ml，并且菌浓一直维持在1个lgCFU/ml左右。

由图2可以看出，Cbf-K₁₆与氨苄青霉素联用较单独用药组的杀菌效果好。从1h开始，联用组菌体浓度开始下降，24h时菌浓已下降5个lg CFU/ml。

(2)抗菌肽Cbf-K₁₆对抗生素预孵育的MRSA的杀菌作用

将细菌用1/2×MIC浓度的抗生素预孵育4h，8000r/min离心10min，PBS洗3遍后，用无菌MH将菌浓调整至1×10⁸CFU/ml，再加入终浓度为1/2×MIC浓度的抗菌肽Cbf-K₁₆，使菌体终浓度为10⁵CFU/ml左右。在0、2、4、8和24h时，吸取培养物系列稀释，进行活菌计数，每个稀释度做三个平行实验，求平均值。以细菌浓度对数为纵坐标，抗菌肽Cbf-K₁₆作用时间为横坐标，绘制柱状图。同时设未用抗生素孵育组做对照。结果见图3、4。

本实验分别测定了抗菌肽Cbf-K₁₆对头孢他啶、氨苄青霉素预孵育的MRSA的杀菌效果。

由图3可以看出，Cbf-K₁₆对头孢他啶预孵育的MRSA杀菌活性高于未孵育组。抗生素未孵育组菌浓从4h开始上升，而抗生素孵育组从2h开始菌体浓度维持在2个lg CFU/ml左右。

由图4可以看出，氨苄青霉素预孵育的MRSA对Cbf-K₁₆的敏感性高于未孵育组。未孵育组的菌体浓度维持上升，而孵育组菌体浓度持续下降至2个lg CFU/ml左右。

附图说明

图1抗菌肽Cbf-K₁₆与头孢他啶联用对MRSA的杀菌曲线

图2抗菌肽Cbf-K₁₆与氨苄青霉素联用对MRSA的杀菌曲线

图3抗菌肽Cbf-K₁₆对头孢他啶预孵育的MRSA的杀菌作用

图4抗菌肽Cbf-K₁₆对氨苄青霉素预孵育的MRSA的杀菌作用

具体实施方式

实施例1

Cbf-K₁₆与头孢他啶联用对MRSA感染小鼠的死亡保护率的影响

实验采用20g左右的ICR小鼠，雌雄各半，随机分为7组，设为空白组、模型组、Cbf-K₁₆组(40mg/kg/d)、头孢他啶组(80mg/kg/d)，低剂量联合组(Cbf-K₁₆20mg/kg/d，头孢他啶80mg/kg/d)、中剂量联合组(Cbf-K₁₆40mg/kg/d，头孢他啶80mg/kg/d)、高剂量联合组(Cbf-K₁₆80mg/kg/d，头孢他啶80mg/kg/d)。适应性培养2天后，开始实验。除空白组外，其它各组小鼠腹腔注射5×10⁸CFU的MRSA，Cbf-K₁₆在感染后0.5h和2h腹腔给药，头孢他啶在感染后0h和6h尾静脉给药，连续7d观察生存状态，记录死亡数，计算死亡保护率。

表4 Cbf-K₁₆和头孢他啶对MRSA感染小鼠的死亡保护率的影响

实验结果(表4)表明，Cbf-K₁₆、头孢他啶对小鼠的死亡保护率均为20％，与感染模型组相比，3组联合用药组均能有效降低MRSA感染小鼠的死亡率，提高小鼠的死亡保护率，延长存活时间。在3组联合用药组中，高剂量联合组和中剂量联合组的作用效果较佳，死亡保护率达80％，低剂量联合用药组的死亡保护率为60％，3组均优于单独使用的Cbf-K₁₆和头孢他啶组。

实施例2

Cbf-K₁₆与氨苄青霉素联用对MRSA感染小鼠的死亡保护率的影响

实验采用20g左右的ICR小鼠，雌雄各半，随机分为7组，设为空白组、模型组、Cbf-K₁₆组(40mg/kg/d)、氨苄青霉素组(80mg/kg/d)，低剂量联合组(Cbf-K₁₆20mg/kg/d，氨苄青霉素80mg/kg/d)、中剂量联合组(Cbf-K₁₆40mg/kg/d，氨苄青霉素80mg/kg/d)、高剂量联合组(Cbf-K₁₆80mg/kg/d，氨苄青霉素80mg/kg/d)。适应性培养2天后，开始实验。除空白组外，其它各组小鼠腹腔注射5×10⁸CFU的MRSA，Cbf-K₁₆在感染后0.5h和2h腹腔给药，氨苄青霉素在感染后0h和6h尾静脉给药，连续7d观察生存状态，记录死亡数，计算死亡保护率。

表5 Cbf-K₁₆和氨苄青霉素对MRSA感染小鼠的死亡保护率的影响

实验结果(表5)表明，Cbf-K₁₆对小鼠的死亡保护率达20％，氨苄青霉素对小鼠的死亡保护率为0％。与感染模型组相比，3组联合用药组能有效降低MRSA感染小鼠的死亡率，提高小鼠的死亡保护率，延长存活时间；且高剂量联合组的作用效果较佳，死亡保护率达80％，中剂量和低剂量联合组的死亡保护率为60％和20％，均优于单独使用的Cbf-K₁₆和氨苄青霉素组。

Claims (8)

1.一种抗甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌(MRSA)的药物组合物，由药物活性组分和药学上可接受的载体组成，其中药物活性组分含多肽Cbf-K₁₆及选自头孢他啶或氨苄青霉素中的任一组分。

2.权利要求1的药物组合物，其中多肽Cbf-K₁₆与选自头孢他啶或氨苄青霉素中的任一组分的重量比为8∶1～1∶8。

3.权利要求1的药物组合物，其中多肽Cbf-K₁₆与选自头孢他啶或氨苄青霉素中的任一组分的重量比为4∶1～1∶4。

4.权利要求2的药物组合物，其中多肽Cbf-K₁₆与选自头孢他啶或氨苄青霉素中的任一组分的重量比为2∶1～1∶2。

5.权利要求3的药物组合物，其中多肽Cbf-K₁₆与选自头孢他啶或氨苄青霉素中的任一组分的重量比为1∶1。

6.权利要求1～5的药物组合物在制备MRSA感染动物的疾病治疗药物中的应用。

7.权利要求6的用途，所述动物为哺乳动物人。

8.权利要求6所述的MRSA感染性疾病可以是呼吸道感染、脓毒性关节炎、心内膜炎、败血症，也可以是皮肤、皮肤结构与软组织感染，如脓疱病、烧伤感染、创伤感染、烫伤样皮肤综合征、中毒性休克综合征等。