CN102702333A

CN102702333A - 抗耐药性病原菌感染多肽及其用途

Info

Publication number: CN102702333A
Application number: CN2012101719018A
Authority: CN
Inventors: 周长林; 窦洁; 王晶; 郝青茹; 王慧; 周伟东
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2012-05-29
Filing date: 2012-05-29
Publication date: 2012-10-03
Anticipated expiration: 2032-05-29
Also published as: CN102702333B

Abstract

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种抗菌多肽，氨基酸序列如SEQ ID：NO:1或如SEQ ID：NO：2所示，本发明的抗菌多肽具有抗耐药性病原菌感染，特别是抗超级耐药细菌（即超级细菌）的用途。

Description

抗耐药性病原菌感染多肽及其用途

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种抗菌多肽，本发明的抗菌多肽具有抗耐药性病原菌感染，特别是抗超级耐药细菌（超级细菌）的用途。

背景技术

抗生素的发现使人们进入了控制、治疗细菌感染性疾病的时代。但是大量广谱抗生素的使用同时加强了对致病菌的筛选作用，加速了致病菌的进化，使得细菌的耐药率逐步增加，耐药谱也不断扩大，最终导致了超级耐药细菌的出现。超级耐药细菌（超级细菌）正在全球蔓延。据报道，超级细菌对目前临床上使用的抗生素不敏感（替加环素和多粘菌素除外），其携带有超级耐药的新德里金属β-内酰胺酶-1（New Delhi metallo-β-lactamase-1，NDM-1）基因。近期研究表明，在院内感染病人中分离出含NDM-1基因（质粒编码）的超级细菌，其耐药性大多是细菌在接触抗生素后获得的，并可通过耐药基因的转移而传播和扩散，也可通过耐药基因的复制而传给细菌下一代。因此，寻求新的抗耐药性病原菌感染的药物，特别是抗超级耐药细菌（超级细菌）的药物在临床上具有重要意义。

由于抗微生物多肽具有广谱的抗菌活性和广泛的生物学功能，近年来有关抗微生物多肽的研究已经得到广泛重视。抗菌肽由于抗菌机理不同于传统抗生素，不容易产生耐药细菌，因此在临床上治疗耐药性病源菌感染的疾病具有独特的优势。Cathelicidin家族，是一类N端有一段Cathelin结构域而C端含有高度特异的成熟肽段的抗微生物多肽家族，具有广谱抗菌活性。其不仅对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌具有非常强的杀菌活性，而且对某些真菌以及病毒同样具有作用。除了具有抗菌活性外，Cathelicidin家族多肽还具有其他重要的生物学功能，包括促进创伤修复，作为化学引诱剂召集炎症细胞到达炎症部位，诱导血管生成，结合内毒素，以及诱导细胞溶解等。上述生物学效应增强了其对宿主的防御机制，促使机体能够从病原体感染中恢复过来。

抗菌肽大部分是以两亲螺旋的形式和胞膜发生作用，肽链长度、螺旋性、疏水性、疏水距、电荷及亲水面和疏水面的夹角等结构参数对膜活性（结合和穿透能力）和选择性有影响，大多数抗菌肽带有正电荷。在多肽与负电性的革兰阴性和阳性细菌细胞膜相互作用中，正电荷所起的作用是众所周知的，正电荷增加，抗菌活性增加，但不是简单的正相关关系。多肽的两亲性则是指沿螺旋轴平行的两个侧面，一侧亲水残基集中，显亲水性，另一侧疏水残基较多，显疏水性，两亲性使得螺旋的侧面上形成了疏水矩。

发明内容

本发明设计并公开了一种抗菌多肽，具有抗耐药性病原菌感染功效，特别是具有抗超级耐药细菌的功效。

本发明依据Cathelicidin家族的抗菌多肽，将其部分活性氨基酸位点进行突变，采用固相化学合成法获得对耐药性病原菌具有高抑制活性的抗菌多肽，并以本研究构建的超级耐药的重组E.coli(NDM-1)为对象，研究其对超级耐药细菌的抗菌活性。

本发明的抗菌多肽，其氨基酸序列其氨基酸序列如SEQ ID：NO：1所示或如SEQ ID：NO：2所示。

本发明氨基酸序列之一如SEQ ID：NO：1所示的多肽。简称Cbf-K₁₆，全序列为：赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-赖氨酸-亮氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-精氨酸-丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-精氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸。

本发明另一个氨基酸序列如SEQ ID：NO：2所示的多肽。简称Cbf-A₇A₁₃，全序列为：赖氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-赖氨酸-亮氨酸-丙氨酸-赖氨酸-丝氨酸-缬氨酸-赖氨酸-赖氨酸-丙氨酸-丙氨酸-赖氨酸-谷氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-精氨酸-缬氨酸-异亮氨酸-甘氨酸-缬氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-苯丙氨酸。

采用固相化学合成法即可得到本发明的抗菌多肽。

本发明还公开了一种构建超级耐药细菌（超级细菌）-重组E.coli(NDM-1)表达系统的方法。

本发明构建重组E.coli(NDM-1)表达系统的方法包括：依据GenBank(National Center forBiotechnology Information，NCBI)中公开的大肠杆菌新德里金属β-内酰胺酶NDM-1全基因序列（No.AEH43774.1），全合成了大肠杆菌NDM-1基因，构建NDM-1基因的pET28a质粒载体，转化入大肠杆菌（E.coli BL21(DE3)），构建了重组E.coli(NDM-1)的NDM-1表达系统。研究表明，NDM-1基因可在重组E.coli(NDM-1)中诱导表达，具有金属β-内酰胺酶活性，对替加环素敏感，证明重组E.coli(NDM-1)超级耐药细菌的模型已构建成功。

本发明的抗菌多肽的抗超级细菌的应用包括：以自主成功构建的重组E.coli(NDM-1)为超级耐药细菌（超级细菌）研究模型，进行了抗菌多肽的体外抗超级细菌活性的研究，如多肽对超级细菌的最低抑菌浓度（MIC）、最低杀菌浓度（MBC）、杀菌曲线（KCs）值的测定，实验确证本发明多肽对超级细菌有较高的抗菌活性。本发明为临床上治疗耐药性病原菌感染，特别是超级细菌感染性疾病提供了良好的实验依据，并对一系列新的具有抗菌活性的化合物的设计合成具有一定的指导意义。

超级细菌的构建及确证：

（1）依据GenBank(National Center for Biotechnology Information，NCBI)中公开的NDM-1全基因序列（No.AEH43774.1），在其两端分别添加限制性酶切位点EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ，进行全基因合成。目的基因经扩增、质粒提取、EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切，将琼脂糖凝胶电泳纯化后的目的基因片段再连接到含有EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ酶切位点的E.coli BL21(DE3)中的pET28a载体上，转化得到重组E.coli NDM-1，并进行基因确证。由图1可确证重组E.coliNDM-1的基因方面构建成功。

（2）挑取含重组质粒的大肠埃希菌BL21(DE3)单菌落接种于3ml含25mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃过夜培养，然后按1∶100的比例转入新鲜LB培养基，于37℃200rpm振荡培养至OD₆₀₀=0.5时，取3ml菌液做空白对照，剩余菌液加入异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)进行诱导，使其终浓度为1.0mM。继续培养，以不同诱导时间2h、4h、6h收菌；以不同浓度IPTG诱导为条件，使其终浓度分别为0.5Mm、1.0mM、1.5mM、2.0mM。通过12％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）测定NDM-1的表达情况，并确定最佳诱导时间及诱导浓度。

由图2可得：经SDS-PAGE检测，诱导时间为4小时，诱导剂浓度为1.0mM时，NDM-1酶的表达量及酶活力最高。

由图3可得：IPTG诱导浓度为1.0mM时，NDM-1酶活力最高。

（3）绘制青霉素V钾盐的标准曲线：配制青霉素V钾盐标准液，梯度稀释成十个浓度，分别测定其OD₂₄₀的吸光度，并绘制成标准曲线。NDM-1酶分解青霉素V钾盐：以青霉素V钾盐为底物，37℃水解2h，沸水浴终止反应，通过分光光度法在OD₂₄₀测定青霉素V钾盐的吸光度。

由图4可看出重组菌的NDM-1酶活最高，可从酶活方面验证超级细菌构建成功。

附图说明

图1是重组E.coli NDM-1经BamH I/EcoR I双酶切后电泳图。

图2是1.0mM IPTG诱导不同时间重组E.coli NDM-1蛋白表达电泳图。

图3是不同浓度IPTG诱导4h，重组E.coliNDM-1的的酶活测定曲线。

图4是重组E.coli NDM-1、E.coli BL21(DE3)、E.coli ATCC25922、E.coli临床株(青霉素耐药)的酶活测定图。

图5是Cbf-K₁₆和Cbf-A₇A₁₃对重组E.coli NDM-1的杀菌曲线。

具体实施方式

实施例1

多肽的合成及结构确证：

按常规固相合成方法人工合成本发明多肽。本发明的多肽Cbf-K₁₆和Cbf-A₇A₁₃，通过HPLC确定其纯度均大于99％，由质谱确定其分子量分别为3637.63和3496.37，其分子量与理论值3638.1和3496.8吻合。

实施例2

本发明多肽Cbf-K₁₆和Cbf-A₇A₁₃对重组E.coli NDM-1的体外抗菌作用：

（1）精确称取多肽Cbf-K₁₆和Cbf-A₇A₁₃配置成浓度为1280μg/ml的药物溶液，0.22μm膜无菌过滤，分装，置-70℃保藏备用。

（2）将重组E.coli NDM-1接种至营养琼脂斜面，37℃孵育18h后，再挑取少许接种于2ml营养肉汤培养基，37℃培养8h，用无菌MH肉汤培养液稀释成10⁵CFU/ml左右的细菌悬液，期间以IPTG持续诱导。

（3）取无菌96孔板，第一列加药物原液40μl和MH肉汤培养基60μl，其余各孔每孔加MH肉汤培养基50μl，每行依次将药物倍比稀释成50μl含药浓度为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25μg/ml的溶液。取50μl的上述稀释菌液加至制备好的含药溶液中，此时，各溶液药物浓度分别为256、128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml，同时设不含药物的空白对照组。期间用终浓度1.0mM IPTG持续诱导。置37℃恒温培养16～20h，观察结果，并记录MIC值。

（4）Cbf-K₁₆和Cbf-A₇A₁₃对超级细菌的体外最低抑菌浓度（MIC）：

由表1可以看出，重组E.coli NDM-1诱导4h后耐药性提高，说明E.coli ATCC25922是敏感株，经IPTG诱导后重组E.coli NDM-1耐药性提高成为超级耐药菌。本发明的两个肽Cbf-K₁₆和Cbf-A₇A₁₃对其有较高的活性。

表1Cbf-K₁₆和Cbf-A₇A₁₃对重组E.coli NDM-1的最低抑菌浓度（MIC）

（5）依次将未见细菌生长各管培养物分别吸取0.1ml倾倒于营养琼脂平皿上，培养基中加1.0mM IPTG持续诱导。37℃再培养18h，平皿上菌落小于5个的最小稀释度的药物浓度即为最低杀菌浓度MBC。

由表2可知，Cbf-K₁₆和Cbf-A₇A₁₃对超级细菌（重组E.coli NDM-1）的最低杀菌浓度（MBC）分别为8g/ml和16ug/ml。

表2Cbf-K₁₆和Cbf-A₇A₁₃对重组E.coli NDM-1的最低杀菌浓度（MBC）

（6）采用4倍MIC的药物浓度，将制备好的10⁶CFU/ml的菌悬液与药物混合，使其浓度为10⁵CFU/ml左右。在0、1、2、4、6、8、10、12和24h时，期间用终浓度1.0mM IPTG持续诱导，吸取培养物，进行系列稀释，活菌计数，每个稀释度做三个平行实验，求平均值。最后以细菌浓度对数为纵坐标，培养时间为横坐标，绘制杀菌曲线。同时做空白对照和阳性对照。

由图5可以看出Cbf-K₁₆和Cbf-A₇A₁₃具有很好的杀菌作用，尤其是Cbf-K₁₆在3小时内即可杀死超级耐药细菌，一个小时菌落数就下降1个lgCFU。Cbf-A₇A₁₃杀菌时间较长，但在6个小时内就可将超级耐药细菌全部杀死。而阳性对照替加环素虽然MIC值小，但杀菌效果不显著，在10个小时内仍只能抑制细菌生长而不能将其杀死。

序列表

SEQUENCE LISTING

<110>中国药科大学

<120>抗耐药性病原菌感染多肽及其用途

<130>2012

<160>2

<170>PatenttIn version 3.3

<210>1

<211>30

<212>PRT

<213>人工序列

<400>1

Lys Phe Phe Arg Lys Leu Lys Lys Ser Val Lys Lys Arg Ala Lys Lys

1 5 10 15

Phe Phe Lys Lys Pro Arg Val Ile Gly Val Ser Ile Pro Phe

20 25 30

<210>2

<211>30

<212>PRT

<213>人工序列

<400>2

Lys Phe Phe Arg Lys Leu Ala Lys Ser Val Lys Lys Ala Ala Lys Glu

1 5 10 15

Phe Phe Lys Lys Pro Arg Val Ile Gly Val Ser Ile Pro Phe

20 25 30

Claims

1.一种抗菌多肽，其氨基酸序列如SEQ ID：NO：1所示。

2.一种抗菌多肽，其氨基酸序列如SEQ ID：NO：2所示。

3.权利要求1或2的多肽用于制备抗耐药性病原菌感染药物的用途。

4.权利要求3的用途，其中耐药性病原菌是超级耐药细菌。