CN101173004A - 一种昆虫抗菌肽Thanatin及其缺失突变体的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用基因工程方法制备昆虫抗菌肽Thanatin及其第15位氨基酸(T)缺失突变体的方法。该方法具有成本低、后处理简单、可商业化大规模生产的特点。
Description
【技术领域】
本发明涉及生物技术领域，更具体地，本发明涉及具有抗菌作用的昆虫抗菌肽及其缺失突变体的制备方法。
【背景技术】
抗生素的发现在人类医学史上具有重要的意义，它的使用挽救了无数的生命，使人的预期寿命增加了十年以上。但是随着人们对抗生素的广泛使用，细菌也逐渐适应并对其产生了耐药性。虽然目前临床上使用的抗生素有上百种之多，但都属于化学小分子，新研制的抗生素也一般是其结构修饰物，很难解决细菌对抗生素耐药的问题。随着耐药菌问题的出现，新型的抗耐药菌的抗生素的研发已成为国际上广泛关注的问题。
自然界中的许多生物，如昆虫、两栖类动物、植物和哺乳类动物都会产生保护机体的具有抗菌活性的小分子肽。这些抗菌肽能与生物体的细胞膜发生作用，从而达到杀死细菌、真菌和病毒的作用。昆虫抗菌肽都带有不同数量的正电荷，这种正电荷能与细菌细胞膜的磷脂双分子层负电荷结合，从而影响其膜上的离子通道，增加通透性，使细菌死亡，同时这些抗菌肽还可以与膜上的脂多糖结合，减轻由细菌感染引起的临床症状。
目前，已经报道的抗菌肽有数百种，其抗菌范围很广，它们对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、真菌和病毒都有一定的抑制作用，由于这些抗菌肽是利用生物体自身免疫机制而达到抗菌作用的，因此与抗生素的作用机制有明显的不同，故其对目前临床上的耐药菌仍具有杀菌作用，被国际上认为是一类具有广阔应用前景的新型抗菌药。但是现在直接利用天然抗菌肽作为抗菌药物的并不多。其中的原因主要是许多天然抗菌肽的抗菌活性不高，而化学合成天然抗菌肽的成本很高，并且化学合成的收率也很低，此外，许多抗菌肽具有很强的溶血副作用。例如从蜜蜂毒液中提取的蜂毒肽，具有很强的抗菌活性，但溶血副作用也很显著，从而使蜂毒肽作为抗菌药物的应用受到很大的限制。
昆虫抗菌肽Thanatin是一种从昆虫中提取的有较好抗菌活性的抗菌肽。
美国专利US 6770798公开了如何在转基因植物中表达Thanatin(21个氨基酸)，增强植物对病原微生物抵抗能力的方法，其氨基酸序列如下：
Gly-Ser-Lys-Lys-Pro-Val-Pro-Ile-Ile-Tyr-Cys-Asn-Arg-Arg-Thr-Gly-Lys-Cys-Gln-Arg-Met
式中的Gly为甘氨酸，Ser为丝氨酸，Lys为赖氨酸，Pro为脯氨酸，Val为缬氨酸，Tyr为酪氨酸，Cys为半胱氨酸，Asn为天冬酰胺，Arg为精氨酸，Thr为苏氨酸，Gln为谷氨酰胺，Met为甲硫氨酸。
对于氨基酸残基数目较少的小肽，常规的制备方法有：(1)化学合成法：通过使用多肽合成仪，直接合成小肽，其优点在于所得小肽化学纯度高，但成本较高，不适合大规模商业化生产；(2)基因工程方法合成：通过常规的基因工程制备，但由于小肽的基因序列较短，直接作为目的基因在表达载体上表达收率较低，通常将小肽编码基因制成多拷贝重复序列，然后将重复序列插入表达载体，进行表达，但所得表达蛋白质需要切割为若干个小肽方可使用，但切割需要引入化学试剂和生物降解酶，这使得后期处理极为复杂，影响产品纯度。
已报道Thanatin制备方法，例如黄亚东等人，昆虫抗真菌肽Thanatin基因的合成及原核表达，《蚕业科学》，2002年02期第104-108页；桑延霞等人，昆虫抗真菌肽基因的分泌型表达及活性鉴定，《中国农业科学》，2007年04期第842-849页。
为了解决Thanatin序列较短，难于表达的问题，在现有技术中往往采用经Thanatin编码基因与其它基因，如分泌引导肽或具有类似抑菌功能的多肽一起组成双价基因，这些方法虽然可以实施，但难于大规模工业化生产。
本发明采用基因工程的方法生产Thanatin，成本显著低于化学合成法。另外，本发明在Thanatin及其缺失突变体表达载体构建中，在目的基因的上游引入了凝血酶切割位点(LVPRGS)，当用凝血酶切割后生成LVPR和GS，而GS恰好是Thanatin及其缺失突变体的头2位氨基酸，巧妙的解决了工具酶切割后氨基酸剩余问题，大大简化了下游的纯化工艺。这一设计使得整个过程变得非常流畅、简单，不繁琐。最终所得小肽不含其它序列，与Thanatin及其缺失突变体的氨基酸序列完全相同，因而抑菌效果最好。同时，整个制备流程经中试放大试验，结果良好，完全适合商业化大规模生产。
【发明内容】
[发明要解决的技术问题]
本发明的第一个目的是提供一种昆虫抗菌肽Thanatin的制备方法。
本发明的第二个目的是提供一种昆虫抗菌肽Thanatin第15位氨基酸(T)缺失突变体的制备方法。
[技术方案]
为了实现本发明的第一个发明目的，本发明人采用了下述技术方案：用PCR方法合成带有凝血酶切割位点的Thanatin基因，利用BamHI和XhoI酶切位点导入pET32a(+)载体，获得含编码Thanatin及其缺失突变体DNA序列的表达载体；经转化、发酵后获得菌体，融合蛋白从细菌中释放后用凝血酶切割，再用离子交换色谱和反相色谱进行分离纯化获得产品。
优选地，实现本发明第一个发明目的采用的技术方案是用SEQID NO.1 ：5’-GCGGATCCCTGGTGCCGCGCGGCAGCAAGAAGCCTGTCCCGATAATCTACTGTAAC-3’ 、SEQ ID NO.2 ：5’-CGCTCGAGTTACATACGCTGGCACTTACCTGACCTACGGTTACAGTAGATTATC-3’作为引物，经PCR扩增，琼脂糖电泳进行分离，胶回收，得到目的片段；将目的片段连接到pMD18T载体上，转化入大肠杆菌DH5α中，经蓝白斑筛选，鉴定出阳性克隆pMD18T-TH；用BamH I和XhoI对载体pET32a(+)和pMD18T-TH进行双酶切，低熔点琼脂糖法回收相应片段，用T4 DNA连接酶连接回收产物，获得含编码Thanatin的DNA序列的表达载体pET32-a-TH；将表达载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选并鉴定转化子，提取质粒；将pET32-a-TH转化BL21(DE3)感受态细胞，获得转化子，接种于含Amp(50μg/ml)的LB肉汤(上海生工)中培养，当菌液OD值(光密度值)达到0.6时，加入乳糖至终浓度8mM，37℃诱导表达6小时，离心分离细胞，破壁后离心获得上清；将上清溶液加入凝血酶缓冲液中，按1mg/1U用凝血酶进行切割，酶切条件为25℃、16h；酶切完成后，用DEAE-sephadex A25阴离子交换柱(美国Phamacia公司)分离，以含NaCl的0.05M PBS(pH7.4)为洗脱液，NaCl浓度从0.1～2.5M进行梯度洗脱，得到Thanatin粗品，冷冻干燥后，再经高效液相制备仪(HPLC，C18柱，美国Bio-Rad公司)精制，以含0.05％三氟乙酸的乙腈-水为流动相，乙腈浓度从5％～95％梯度洗脱，获得精制Thanatin。优选地，实现本发明第一个发明目的采用的技术方案是用SEQ ID NO.1 ：5’-GCGGATCCCTGGTGCCGCGCGGCAGCAAGAAGCCTGTCCCGATAATCTACTGTAAC-3’ 、 SEQ IDNO.2：5’-CGCTCGAGTTACATACGCTGGCACTTACCTGACCTACGGTTACAGTAGATTATC-3’作为引物，经PCR扩增，琼脂糖电泳进行分离，胶回收，得到目的片段；将目的片段连接到pMD18T载体上，转化入大肠杆菌DH5α中，经蓝白斑筛选，鉴定出阳性克隆pMD18T-TH；用BamH I和XhoI对载体pET32a(+)和pMD18T-TH进行双酶切，低熔点琼脂糖法回收相应片段，用T4 DNA连接酶连接回收产物，获得含编码昆虫抗菌肽Thanatin的DNA序列的表达载体pET32-a-TH；将表达载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选并鉴定转化子，提取质粒；另从LB平板上(Amp100μg/mL)保藏菌种单克隆转接至LB肉汤，37℃，200r/min摇床培养7h成种子液，种子液按体积比5∶100转接至发酵罐，37℃，固定通气量4L/min，培养约6小时至对数生长期，补料1L LB，同时加入诱导剂(IPTG即异丙基-D-硫代半乳糖苷，0.1mmol/L，上海生工)后继续培养，5小时后放罐；离心分离细胞，破壁后离心获得上清；将上清溶液加入凝血酶缓冲液中，按1mg/1U用凝血酶(美国Novagen公司)进行切割，酶切条件为25℃16h；酶切完成后，用DEAE-sephadex A25阴离子交换柱分离，得到Thanatin粗品，冷冻干燥后，再经高效液相制备仪(HPLC，C18柱)精制，获得精制Thanatin。
为实现本发明的第二个发明目的，可以采用下述技术方案：用PCR方法合成带有凝血酶切割位点的Thanatin第15位氨基酸缺失突变的基因，利用BamHI和XhoI酶切位点导入pET32a(+)载体，获得含编码Thanatin第15位氨基酸缺失突变体DNA序列的表达载体；经转化、发酵后获得菌体，融合蛋白从细菌中释放后用凝血酶切割，再用离子交换色谱和反相色谱进行分离纯化获得产品。
优选地，实现本发明第二个发明目的采用的技术方案是用SEQID NO.1 ：5’-GCGGATCCCTGGTGCCGCGCGGCAGCAAGAAGCCTGTCCCGATAATCTACTGTAAC-3’ 、 SEQ IDNO.3：5’-CGCTCGAGTTACATACGCTGGCACTTACCCCTACGGTTACAGTAGATTATC-3’作为引物，经PCR扩增，琼脂糖电泳进行分离，胶回收，得到目的片段；将目的片段连接到pMD18T载体上，转化入大肠杆菌DH5α中，经蓝白斑筛选，鉴定出阳性克隆pMD18T-TH1；用BamH I和XhoI对载体pET32a(+)和pMD18T-TH1进行双酶切，低熔点琼脂糖法回收相应片段，用T4 DNA连接酶连接回收产物，获得含编码昆虫抗菌肽Thanatin第15位氨基酸(T)缺失突变体的DNA序列的表达载体pET32-a-TH1；将表达载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选并鉴定转化子，提取质粒；将pET32-a-TH1转化BL21(DE3)感受态细胞，获得转化子，接种于含Amp(50μg/ml)的LB肉汤中培养，当菌液OD值达到0.6时，加入乳糖至终浓度8mM，37℃诱导表达6小时，离心分离细胞，破壁后离心获得上清；将上清溶液加入凝血酶缓冲液中，按1mg/1U用凝血酶进行切割，酶切条件为25℃16h；酶切完成后，用DEAE-sephadex A25阴离子交换柱分离，得到粗品，冷冻干燥后，再经高效液相制备仪(HPLC，C18柱)精制，获得精制Thanatin第15位氨基酸(T)缺失突变体。
优选地，实现本发明第二个发明目的采用的技术方案是用SEQIDNO.1：5’-GCGGATCCCTGGTGCCGCGCGGCAGCAAGAAGCCTGTCCCGATAATCTACTGTAAC-3’ 、 SEQ IDNO.3：5’-CGCTCGAGTTACATACGCTGGCACTTACCCCTACGGTTACAGTAGATTATC-3’作为引物，经PCR扩增，琼脂糖电泳进行分离，胶回收，得到目的片段；将目的片段连接到pMD18T载体上，转化入大肠杆菌DH5α中，经蓝白斑筛选，鉴定出阳性克隆pMD18T-TH1；用BamH I和XhoI对载体pET32a(+)和pMD18T-TH1进行双酶切，低熔点琼脂糖法回收相应片段，用T4 DNA连接酶连接回收产物，获得含编码昆虫抗菌肽Thanatin的DNA序列的表达载体pET32-a-TH1；将表达载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选并鉴定转化子，提取质粒；另从LB平板上(Amp100μg/mL)保藏菌种单克隆转接至LB肉汤，37℃，200r/min摇床培养7h成种子液，种子液按5∶100的比例转接至发酵罐；37℃，固定通气量4L/min，培养约6小时至对数生长期，补料1L LB，同时加入诱导剂(IPTG即异丙基-D-硫代半乳糖苷，0.1mmol/L)后继续培养，5小时后放罐，离心；将沉淀加入凝血酶缓冲液中，按1mg/1U用凝血酶进行切割，酶切条件为25℃16h；酶切完成后，用DEAE-sephadex A25阴离子交换柱分离，得到粗品，冷冻干燥后，再经高效液相制备仪(HPLC，C18柱)精制，获得精制Thanatin第15位氨基酸(T)缺失突变体。
本发明通过合成2对特异性引物，利用PCR方法合成带有凝血酶切割位点的Thanatin(TH)和第15位氨基酸(T)缺失突变的Thanatin(TH1)基因，并将目的片段连接到pMD18T载体上，分别命名为pMD18T-TH及pMD18T-TH1。用BamH I和XhoI分别对pMD18T-TH及pMD18T-TH1进行双酶切，相应片段回收后导入pET32a(+)载体，获得含编码Thanatin及其缺失突变体DNA序列的表达载体，命名为pET32-a-TH和pET32-a-TH1；将表达质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，获得转化子，接种于含Amp(50μg/ml)的LB培养基，用8mM乳糖37℃诱导表达6小时，SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)检测发现在24KDa分子量附近有明显条带，融合蛋白的表达量分别占菌体总蛋白的53％(Thanatin)和68％(Thanatin突变体)。
种子液按体积计以5∶100的比例转接至发酵罐；在LB培养基中于37℃，固定通气量4L/min，培养约6小时至对数生长期，补料后用0.1mmol/L的IPTG诱导5小时后放罐。过滤后称重，所得湿菌体分别为140g/L培养基(Thanatin)和146g/L培养基(Thanatin突变体)，SDS-PAGE显示，融合蛋白表达量占菌体总蛋白的43％(Thanatin)和45％(Thanatin突变体)。
融合蛋白经凝血酶切割后，用DEAE-sephadexA25阴离子交换柱分离，得到Thanatin及其缺失突变体粗品，冷冻干燥后，再经高效液相制备仪(HPLC，C18柱)精制，获得Thanatin及其突变体纯品，其纯度达到95％以上。
用所得样品进行杀菌实验、溶血实验和急性局部刺激实验，结果表明，本发明涉及的Thanatin突变体对大肠杆菌，伤寒沙门氏菌和枯草杆菌的杀菌效果与Thanatin相当，同时增强了对金黄色葡萄球菌的抑制作用；Thanatin与Thanatin突变体的浓度在2.5mg/ml时未发生溶血反应，产品安全性较高；具有较低的急性毒性刺激反应，对兔眼角膜无急性刺激作用。
有益效益
本发明具有以下有益效益：
1.用基因工程技术制备具有较高抗菌活性的昆虫抗菌肽Thanatin及其缺失突变体，适合于大规模工业化生产。
2.采用基因工程技术制备，对环境友好，无任何有害物质产生。
3.生产成本较低。化学合成每毫克肽(21个氨基酸)需560元人民币，而用本方法生产每毫克肽只需2元人民币，大规模制备时成本甚至更低。
4.在Thanatin及其缺失突变体表达载体构建中，在目的基因的上游引入了凝血酶切割位点(LVPRGS)，当用凝血酶切割后生成LVPR和GS，而GS恰好是Thanatin及其缺失突变体的头2位氨基酸，巧妙的解决了工具酶切割后氨基酸剩余问题，大大简化了下游的纯化工艺。
5.杀菌实验、溶血实验和急性局部刺激实验表明，本发明涉及的Thanatin突变体对大肠杆菌，伤寒沙门氏菌和枯草杆菌的杀菌效果与Thanatin相当，同时增强了对金黄色葡萄球菌的抑制作用；Thanatin与Thanatin突变体的浓度在2.5mg/ml时均未发生溶血反应，产品安全性较高；具有较低的急性毒性刺激反应。
【附图说明】
图1：pET32-a-TH重组表达质粒的构建示意图
图2：pET32-a-TH1重组表达质粒的构建示意图
【具体实施方式】
下面通过实施例具体说明本发明而不限制其保护范围。
下述实施例中涉及的电泳、感受态细胞制备、转化等分子生物学方法采用《分子克隆实验指南》的方法进行(萨姆布鲁斯(Sambrool，J.)等著，黄培堂等译，分子克隆实验指南(第3版)，北京，科学出版社，2002，8)。质粒提取，采用上海生工试剂盒K192，按照使用说明进行。
实施例1
表达载体的构建和转化子的获得
按照本技术领域的技术人员已知常规方法分别合成引物SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2及SEQ ID NO.3、(表1)，用SEQ ID NO.1、SEQID NO.2及SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.3分别组成2对引物，经PCR扩增，琼脂糖电泳进行分离，胶回收，得到目的片段。将目的片段连接到pMD18T(上海生工)载体上，转化入大肠杆菌DH5α(美国Novagen公司)中，经蓝白斑筛选，鉴定出阳性克隆，命名为pMD18T-TH及pMD18T-TH1。依照说明书用BamH I和XhoI(美国Promega公司)分别对载体pET32a(+)(美国Novagen公司)和pMD18T-TH及pMD18T-TH1进行双酶切，低熔点琼脂糖法回收相应片段(《分子克隆》)，按说明书用T4 DNA连接酶(美国Promega公司)连接回收产物，获得含编码昆虫抗菌肽Thanatin及其缺失突变体的DNA序列的表达载体；将表达载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选并鉴定转化子，采用常规方法提取质粒，然后送上海Invitrogen公司进行测序，得到的测序结果与预期序列一致(pET32-a-TH和pET32-a-TH1重组表达质粒的构建见图1，图2)。
表1引物序列
诱导表达，检测鉴定
将pET32-a-TH及pET32-a-TH1分别转化BL21(DE3)感受态细胞(美国Novagen公司)，获得转化子，接种于含Amp(50μg/ml)(安苄青霉素，上海生工)的LB肉汤(上海生工)20ml中培养，当菌液OD值达到0.6时，加入乳糖至终浓度8mM，37℃诱导表达6小时。5000rpm离心10分钟，取沉淀。将沉淀溶于50mM Tris-HCl(三羟甲基氨基甲烷-盐酸，上海生工)、10mM NaCl(pH8.0)组成的缓冲液中，超声破碎20min。将超声后的溶液12000rpm离心20min，分别保留上清和沉淀，其沉淀用于电泳检测。在24KDa分子量附近有明显条带(分子量约为23.6KDa)，它相应于融合蛋白，主要集中在溶液上清中。融合蛋白的表达量分别占菌体总蛋白的53％(Thanatin)和68％(Thanatin突变体)。
发酵罐中试放大
按照下列条件对工程菌(含pET32-a-TH及pET32-a-TH1质粒的BL21(DE3)细胞)进行中试放大实验：
发酵体系：10L LB培养基(Amp100μg/mL)。
发酵方案：从LB平板上(Amp100μg/mL)挑取单个克隆接种LB培养液，37℃，200r/min摇床培养7h成为种子液，种子液按体积比5∶100转接至发酵罐；37℃，固定通气量4L/min，培养约6小时至对数生长期，补料1L LB，同时加入诱导剂(IPTG 0.1mmol/L)(上海生工)后继续培养，5小时后放罐。过滤后称重，所得湿菌体分别为140g/L培养基(Thanatin)和146g/L培养基(Thanatin突变体)；SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳)显示，融合蛋白表达量占菌体总蛋白的43％(Thanatin)和45％(Thanatin突变体)。
融合蛋白的酶切，分离纯化
将融合蛋白加入凝血酶(美国Novagen公司)缓冲液中，按1mg/1U用凝血酶进行切割，酶切条件为25℃16h。酶切完成后，用DEAE-sephadex A25阴离子交换柱(美国Phamacia公司)分离，得到Thanatin及其缺失突变体粗品，冷冻干燥后，再经高效液相制备仪(HPLC，C18柱)精制，获得Thanatin及其突变体纯品，其纯度达到95％以上。以胰岛素为对照，将产品按照Tricine-SDS-PAGE电泳方法，检测其分子量约为2.4KDa。
实施例2
抗菌活性的测定
用灭菌生理盐水配制浓度为6mg/ml多肽样品溶液。试验用菌种分别接种于营养肉汤，于37℃培养24小时，临用前用无菌生理盐水作1∶105倍稀释，取12支细菌培养管并编号，于第1管中加入营养肉汤1.8ml，其余11管中均加入1.0ml肉汤。于第1管加入0.2ml多肽溶液，混匀后取出1.0ml加入到第2管中，如此反复，依次稀释到第12管，每管各加菌液0.2ml，轻轻振摇均匀，置37℃培养24小时。以无菌生长的最低多肽浓度，即为抑制细菌生长的最低样品浓度(MIC)。表2为实施例1中制备的Thanatin及其缺失突变体对几种菌的最低抑菌浓度(试验菌分别为：大肠杆菌，伤寒沙门氏菌，绿脓杆菌，枯草杆菌和金黄色葡萄球菌，来自卫生部临床检验中心)。
表2昆虫抗菌肽Thanatin及其缺失突变体最低抑菌浓度MIC(mg/ml)
| 多肽 | 大肠杆菌 | 伤寒沙门氏菌 | 绿脓杆菌 | 枯草杆菌 | 金黄色葡萄球菌 |
| ThanatinThanatin突变体 | 0.01560.0156 | 0.03130.0313 | 0.06250.0625 | 0.03130.0313 | 0.12500.0625 |
实施例3
多肽溶血活性的测定：将人血红细胞(何处获得)悬浮在磷酸盐(购自何处，由谁生产)缓冲液(pH7.4)中，得到红细胞悬浮液(5％v/v)。将多肽溶解在磷酸盐缓冲液中，配成约5mg/ml储备液，取14支1.5ml离心管，于第1支离心管中加1ml多肽储备液，其余各管中加0.5ml磷酸盐缓冲液，从第1管中取出0.5ml多肽储备液加至第2管中，用微量混合仪混合均匀，再从第2管中取出0.5ml溶液加至第3管中混合均匀，以此类推，即以倍比稀释法依次稀释到第14管，弃去0.5ml，各管补加0.5ml配好的5％血红细胞悬浮液至终体积1.0ml，轻轻摇匀，37℃恒温箱中保温60min后，于4000rpm离心10分钟，取上清液在414nm下比色，以红细胞悬浮在磷酸盐缓冲液中为空白，以红细胞悬浮在1％TritonX-100中为100％溶血。溶血百分率用下式计算：
定义溶血百分率为50％时的多肽浓度为半数溶血剂量(HC50)。结果表明，Thanatin及其缺失突变体的HC50＞2.5mg/ml。
实施例4
兔眼结膜局部刺激实验：取健康家兔(购自何处)4只，实验前先检查眼结膜血管、角膜透明度及眼分泌物等状况，选用正常者供试。将供试药物用生理盐水配制成等渗。取实施例1中制备的抗菌肽(Thanatin及突变体)各0.1ml(5mg/ml)滴入左眼结膜囊中，停留2min；右眼滴入同量生理盐水作为对照。使用放大镜观察给药后1、24、48、72 h的眼部情况。结果显示，至72h时，兔眼角膜无浑浊，虹膜正常，结膜无充血水肿，无分泌物出现。表明药液对兔眼无急性刺激作用。
SEQUENCE LISTING
<110>沈，子龙
<120>一种昆虫抗菌肽Thanatin及其缺失突变体的制备方法
<130>US 6770798
<160>3
<170>PatentIn version 3.4
<210>1
<211>56
<212>DNA
<213>引物1
<400>1
gcggatccct ggtgccgcgc ggcagcaaga agcctgtccc gataatctac tgtaac 56
<210>2
<211>54
<212>DNA
<213>引物2
<400>2
cgctcgagtt acatacgctg gcacttacct gacctacggt tacagtagat tatc 54
<210>3
<211>51
<212>DNA
<213>引物3
<400>3
cgctcgagtt acatacgctg gcacttaccc ctacggttac agtagattat c 51
Claims (7)
1.一种昆虫抗菌肽Thanatin的制备方法，其特征在于该方法包括下述步骤：用PCR方法合成带有凝血酶切割位点的Thanatin基因，利用BamHI和XhoI酶切位点导入载体，获得含编码Thanatin或其缺失突变体DNA序列的表达载体；经转化、发酵后获得菌体，融合蛋白从细菌中释放后用凝血酶切割，再进行分离纯化获得产品。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于用SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2作为PCR引物。
3.根据权利要求1-2中任一项权利要求所述的制备方法，其特征在于编码Thanatin或其缺失突变体的DNA序列是用BamHI和XhoI酶切位点导入载体的。
4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于载体为pET32a(+)载体。
5.根据权利要求1-2中任一项权利要求所述的制备方法，其特征在于采用离子交换色谱和反相色谱进行分离纯化获得产品。
6.根据权利要求1-2中任一项权利要求所述的制备方法，其特征在于编码Thanatin或其缺失突变体的DNA序列是用BamHI和XhoI酶切位点导入pET32a(+)载体的，融合蛋白切割后用离子交换色谱和反相色谱进行分离纯化获得产品。
7.根据权利要求1-2中任一项权利要求所述的制备方法，其特征在于用SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2作为PCR引物，经PCR扩增，琼脂糖电泳进行分离，胶回收，得到目的片段；将目的片段连接到pMD18T载体上，转化入大肠杆菌DH5α中，经蓝白斑筛选，鉴定出阳性克隆pMD18T-TH；用BamH I和XhoI对载体pET32a(+)和pMD18T-TH进行双酶切，低熔点琼脂糖法回收相应片段，用T4 DNA连接酶连接回收产物，获得含编码Thanatin的DNA序列的表达载体pET32-a-TH；将表达载体转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选并鉴定转化子，提取质粒；将pET32-a-TH转化BL21(DE3)感受态细胞，获得转化子，接种于含Amp(50μg/ml)的LB肉汤中培养，当菌液OD值达到0.6时，加入乳糖至终浓度8mM，37℃诱导表达6小时，离心取沉淀；将沉淀加入凝血酶缓冲液中，按1mg/1U用凝血酶进行切割，酶切条件为25℃16h；酶切完成后，用DEAE-sephadex A25阴离子交换柱分离，得到Thanatin粗品，冷冻干燥后，再经高效液相制备仪(HPLC，C18柱)精制，获得精制Thanatin。
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