CN105622763A - 抗菌肽融合蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

抗菌肽融合蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种抗菌肽融合蛋白，该蛋白包括抗菌肽thanatin蛋白、orf-91鲨肝肽蛋白，所述抗菌肽thanatin蛋白与orf-91鲨肝肽蛋白之间通过3GSA柔性肽片段连接。该融合蛋白是抗菌肽thanatin蛋白编码基因、orf-91鲨肝肽编码基因、以及位于抗菌肽thanatin蛋白编码基因与orf-91鲨肝肽编码基因之间的3GSA柔性肽编码基因在基因水平融合后在原核表达的可溶性重组蛋白，大小为21KD。抗菌活性研究表明产物该蛋白具有抗菌活性，构建体系解决了天然抗菌肽表达量低、对宿主伤害大、难以通过基因工程手段获得的难题，具有广泛的应用前景。

Description

抗菌肽融合蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术制药工程技术领域，具体涉及一种抗菌肽融合蛋白及其制备方法，以及该融合蛋白在制备抗菌药物中的应用。
背景技术
抗菌肽(Antimicrobialpeptides,AMPs)是生物体在受到病原微生物侵袭时自身诱导产生的一类具有抗菌活性的小分子多肽，是天然免疫的主要成分，一般由20-60个氨基酸残基组成。很多抗菌肽不仅能在较低浓度下有效抑制细菌、病毒、真菌和原虫等多种病原微生物的生长，甚至还可以杀死肿瘤细胞，而对正常的没有发生病变的真核细胞几乎没有作用。自从天蚕素被发现以来，人们相继从生物界分离到1700多种抗菌肽，它们的分布极其广泛，从哺乳动物、甲壳动物、鱼类、昆虫、两栖动物、鸟类到植物、细菌和病毒等均有发现，其中以昆虫抗菌肽种类最多。
死亡素(thanatin)又称死亡肽，是由斑腹刺益蜷(Podisusmaculiveniris)诱导产生的一种环状昆虫抗菌肽，由21个氨基酸残基组成，其中第8-21位氨基酸残基形成β反向折叠结构，此结构由11位和18位两个半胱氨酸残基之间形成的二硫键来稳定。死亡素结构简单，抗菌谱相对广，对G+和G-细菌、某些真菌及原虫都有抑制作用，对哺乳动物细胞不表现出溶血性，是迄今已知所有昆虫抗菌肽中抗菌谱最广、抗菌活性最强的抗菌蛋白，其最小抑杀浓度(MIC)约为0.25-4ug/ml。
但目前，抗菌肽大多都是单独存在而发挥其抗菌功能，对不同菌株的杀菌能力还是存在一定的局限性，且抗菌活性也有待提高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是针对以上现有技术，提供一种抗菌肽融合蛋白以及该融合蛋白的制备方法，该融合蛋白的表达体系蛋白表达量大，利于纯化复性和保持活性，适用于工业化大生产，且更为重要的是，该融合蛋白抗菌活性高，其本身和编码基因可应用于抗菌药物制备中，能为抗菌药物制备提供新的良好的材料来源。
本发明所采用的技术方案为：
一种抗菌肽融合蛋白，该蛋白包括抗菌肽thanatin蛋白、orf-91鲨肝肽蛋白，所述抗菌肽thanatin蛋白与orf-91鲨肝肽蛋白之间通过3GSA柔性肽片段连接，所述抗菌肽thanatin蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.8所示，所述orf-91鲨肝肽蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.9所示，所述3GSA柔性肽片段如SEQIDNO.10所示。即该蛋白从N端-C端依次包含了抗菌肽thanatin蛋白、3GSA柔性肽、orf-91鲨肝肽蛋白，或orf-91鲨肝肽蛋白、3GSA柔性肽、抗菌肽thanatin蛋白。
该蛋白是抗菌肽thanatin蛋白编码基因、orf-91鲨肝肽编码基因、以及位于抗菌肽thanatin蛋白编码基因与orf-91鲨肝肽编码基因之间的3GSA柔性肽编码基因在基因水平融合后在原核表达的可溶性重组蛋白。所述抗菌肽融合蛋白的编码基因序列如SEQIDNO.4所示或如SEQIDNO.5所示。
上述抗菌肽融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：
(1)采用人工合成的方法获得包含抗菌肽thanatin蛋白编码基因序列、3GSA柔性肽编码基因序列、orf-91鲨肝肽编码基因的tha-orf_91融合基因序列和/或orf_91-tha融合基因序列，分别如SEQIDNO.4所示、如SEQIDNO.5所示；
(2)以pETDuet质粒为载体，构建重组质粒，并转化至大肠杆菌E.coliTG1中，通过鉴定、筛选，得到阳性克隆；
(3)将阳性克隆转化至大肠杆菌宿主菌BL21中，通过氨苄青霉素抗生素的筛选获得表达菌株；
(4)挑取阳性单克隆至LB培养基，LB培养基中含50ug/ml氨苄青霉素，37℃培养至OD600为0.5-0.7，加入终浓度0.4mM的IPTG进行蛋白诱导，诱导条件为16℃培养16-20h，得到在上清表达的带Sumo标签的融合蛋白；
(5)对得到的带Sumo标签的融合蛋白进行纯化，然后切除Sumo标签，得到抗菌肽融合蛋白。
本发明进一步提供上述抗菌肽融合蛋白在制备抗菌药物中的应用。
本发明还进一步提供上述抗菌肽融合蛋白的编码基因在制备抗菌药物中的应用。
与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：
(1)通过对抗菌肽基因和orf-91鲨肝肽基因的选择，以及柔性肽和标签蛋白的选择和合适排布，通过在基因工程上把抗菌肽thanatin和orf-91鲨肝肽基因密码子串联并在二者间插入3GSA柔性肽的方法，以sumo为融合蛋白，pETDuet为载体，在工程菌E.coliBL21(DE3)内成功表达在上清的抗菌肽融合蛋白，表达量大，有利于保证后期纯化复性及融合蛋白活性；
(2)得到的抗菌肽融合蛋白抗菌活性明显优于thanatin，解决了天然抗菌肽表达量低，对宿主伤害大，难以通过基因工程手段获得的难题，其本身或编码基因可应用于抗菌药物制备中，这为研制新一代的抗菌药物打下了基础，具有广泛的应用前景。
附图说明
图1所示的是本发明实施例1中重组表达载体的双酶切鉴定电泳图，其中M:marker，1:orf_91-tha重组质粒双酶切结果，2:tha-orf_91重组质粒双酶切结果，3:pETduet-His-SUMO载体双酶切结果。
图2所示的是本发明实施例1中重组表达载体的PCR鉴定电泳图，其中(A)为tha-orf_91重组质粒的菌液PCR鉴定，(B)为orf_91-tha重组质粒的菌液PCR鉴定。
图3所示的是本发明实施例2中重组质粒诱导表达的SDS-PAGE鉴定图，其中1-3为含有tha-orf_91基因工程菌，4-6为含有orf_91-tha基因工程菌，1、4:未诱导全菌蛋白，2、5:诱导蛋白超声波破碎上清，3、6:诱导蛋白超声波破碎沉淀，7:未诱导的pETduet-His-SUMO空载。
图4所示的是本发明实施例2中重组融合蛋白表达纯化及SUMO酶切的SDS-PAGE鉴定图，其中(A)为tha-orf_91，(B)为orf_91-tha，1:诱导蛋白超声波破碎后上清，2:诱导蛋白超声波破碎后沉淀，3:镍柱纯化后蛋白，4:未透析蛋白SUMO酶切，5:透析后蛋白，6:透析后蛋白SUMO酶切。
图5所示的是本发明实施例3中重组蛋白的抑菌活性检测，其中(A)为重组蛋白tha-orf_91对革兰氏阴性菌(大肠杆菌TG1)的抑菌活性检测图，(B)为重组蛋白tha-orf_91对革兰氏阳性菌(枯草芽孢杆菌)抑菌活性检测图，(C)为重组蛋白orf_91-tha对革兰氏阴性菌(大肠杆菌TG1)抑菌活性检测图，(D)为重组蛋白orf_91-tha对革兰氏阳性菌(枯草芽孢杆菌)抑菌活性检测图；1：ddH2O，2：1mg/mL的Amp3：纯化、SUMO肽酶切后的重组蛋白4：透析、SUMO肽酶切后的重组蛋白。
图6所示的是本发明实施例3中高浓度组三种不同蛋白的抑菌活性检测，其中(A)为高浓度组三种不同蛋白Thanatin、orf_91-tha及tha-orf_91对革兰氏阴性菌(大肠杆菌TG1)抑菌活性检测图，(B)为高浓度组三种不同蛋白Thanatin、orf_91-tha及tha-orf_91对革兰氏阳性菌(枯草芽孢杆菌)抑菌活性检测图；A:Amp，B:Thanatin，C:tha-orf_91，D:orf_91-tha，E:ddH2O。
图7所示的是本发明实施例3中低浓度组三种不同蛋白的抑菌活性检测，其中(A)为低浓度组三种不同蛋白Thanatin、orf_91-tha及tha-orf_91对革兰氏阴性菌(大肠杆菌TG1)抑菌活性检测图，(B)为低浓度组三种不同蛋白Thanatin、orf_91-tha及tha-orf_91对革兰氏阳性菌(枯草芽孢杆菌)抑菌活性检测图；A:Amp，B:Thanatin，C:tha-orf_91，D:orf_91-tha，E:ddH2O。
图8是thanatin氨基酸序列的蛋白结构解析图。
图9是tha-orf_91融合蛋白的蛋白结构预测图。
图10是orf_91-tha融合蛋白的蛋白结构预测图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。
材料和试剂：
1.菌种、质粒：
E.coliTG1菌株、E.coliBL21菌株、枯草芽孢杆菌菌株及质粒pET-duet-His-SUMO由中国科学院上海药物研究所赠予；菌株pET-duet-His-SUMO-thanatin由浙江理工大学生物实验室在质粒pET-duet-His-SUMO的基础上自行构建，其中的thanatin序列同SEQIDNO.1。
2.主要酶类及其生化试剂：
琼脂糖购自BoehringerMannheim公司；蛋白胨(Tryptone)、酵母提取物(YeastExtract)购自英国Oxoid公司；Taq酶及相应PCR反应有关试剂购自上海博亚(Biosia)生物技术有限公司；限制性内切酶、T4DNALigase及其相关试剂购自东洋纺(上海)生物科技有限公司；Amp、IPTG为Promega公司产品；其余试剂为国产分析纯。所需重组基因由苏州金唯智生物科技有限公司合成。所需引物由北京擎科新业生物技术有限公司杭州合成部合成。常规试剂配制如无特别说明，均参照《分子克隆实验指南》第三版。
实施例1：重组表达载体的构建
1.目的片段的设计与合成
通过NCBI数据库获得死亡素thanatin核酸序列(如SEQIDNO.1所示)，在本实验室的鲨肝小肽cDNA数据库中找到鲨肝肽orf_91基因(如SEQIDNO.2所示)，orf_91鲨肝肽是从条纹斑竹鲨再生肝脏cDNA文库中筛选出的等电点为10.72的可能具有潜在生物学活性的鲨肝肽orf_91基因翻译的小肽，在两个核苷酸序列中间加入3个串联片段(Gly+Ser+Ala)编码基因(如SEQIDNO.3所示)，形成thanatin+3GSA编码片段+鲨肝肽orf_91融合基因(下简称tha-orf_91融合基因，如SEQIDNO.4所示)和鲨肝肽orf_91+3GSA编码片段+thanatin融合基因(下简称orf_91-tha融合基因，如SEQIDNO.5所示)，并在其5’端加上BamHI酶切位点，3’端加上XhoI酶切位点，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成。当然，为了符合大肠杆菌密码子偏好性，可在不影响翻译氨基酸序列的情况下，对融合基因序列的个别核苷酸进行修改，如将SEQIDNO.4序列修改为如SEQIDNO.6所示，将SEQIDNO.5序列修改为如SEQIDNO.7所示。
序列SEQIDNO.4或SEQIDNO.6翻译成的氨基酸序列如SEQIDNO.11所示，序列SEQIDNO.5或SEQIDNO.7翻译成的氨基酸序列如SEQIDNO.12所示。
本发明为了确保预表达的两个融合蛋白的空间构象不受干扰，利用3个串联片段(Gly+Ser+Ala)将Thanatin和orf_91鲨肝肽铰链起来，这样有利于两个蛋白的天然构象不发生改变。
2.重组表达载体的构建和筛选
tha-orf_91融合基因与orf_91-tha融合基因分别用BamHI酶和XhoI酶双酶切获得目的片段，得到的目的片段分别克隆至载体pETduet-His-SUMO上，构建两个重组质粒pETduet-His-SUMO-tha-orf_91(下简称tha-orf_91重组质粒)和pETduet-His-SUMO-orf_91-tha(下简称orf_91-tha重组质粒)。
将构建的重组质粒进行双酶切和菌液PCR鉴定，双酶切后在100-250bp之间有清晰条带，融合目的基因大小为195bp，与琼脂糖凝胶电泳显示条带大小相符，pETduet-His-SUMO载体大小为5684bp，与电泳结果相符，如图1。
重组质粒的菌液PCR鉴定的结果见图2(A)、(B)，如箭头所示，在100-250bp之间有清晰条带，与融合目的基因大小相符。
将重组质粒分别转化到E.coliTG1大肠杆菌，将含有重组质粒的TG1大肠杆菌送到北京擎科新业生物技术有限公司杭州分公司进行测序，结果显示重组载体构建成功，并未发生基因突变。
实施例2：融合蛋白的诱导表达和纯化
1.重组融合蛋白的诱导表达
测序正确后，提取质粒，将重组质粒转化到BL21(DE3)大肠杆菌，进行诱导表达。
成功构建的两种工程菌及实验室已有的菌株pET-duet-His-SUMO-thanatin接种于100mLLB培养液，分别于37℃恒温摇床培养至A600值为0.6左右，然后放入16℃摇床预冷20min，再加入IPTG至终浓度为0.4mmol/L，16℃诱导18h，12000rpm离心收集菌体，PBS洗涤两次后，将诱导后的重组菌超声破碎30min，超声3s，停3s，然后12000rpm离心25min，分别取上清和沉淀，SDS-PAGE电泳检测表达产物的存在形式，结果如图3所示。tha-orf_91与orf_91-tha未诱导和空载的对照组除不加IPTG外以同样条件培养。
重组菌经IPTG诱导和超声裂解后的电泳结果显示：与阴性对照组相比，在21kDa左右有明显特异性条带，与重组融合蛋白tha-orf_91和重组融合蛋白orf_91-tha预测大小相符，并且表达的重组融合蛋白存在于超声上清液中(图3)。
2.重组融合蛋白的纯化及SUMO肽的切除
重组融合蛋白镍柱纯化：经验证重组融合蛋白表达在超声破碎后的上清中，将超声破碎后的上清过0.45μm滤膜后进行镍柱亲和层析纯化蛋白。
切除SUMO肽：在纯化出的重组融合蛋白溶液中加入SUMO蛋白酶(按照100:1的比例混匀)，4℃酶切过夜，切除SUMO肽。菌株pET-duet-His-SUMO-Thanatin表达的Thanatin蛋白在sumo酶切之后将酶切产物再过一次镍柱纯化，以除去酶切下来后的有his标签的sumo肽，得到更纯的重组的目的蛋白。
结果如图4所示：镍柱纯化后目的蛋白存在且杂蛋白较少，经镍柱亲和柱纯化的目的蛋白纯度可达90％以上。对目的蛋白进行SUMO酶切后，取样进行SDS-PAGE分析，结果显示重组融合蛋白酶切后的电泳条带上有一条符合SUMO肽大小的蛋白条带，说明酶切成功。
体外保存试验表明，在大肠杆菌中表达的融合蛋白比较稳定，在-20℃存放一段时间后，活性未发生明显改变，这就避免了体外表达蛋白容易降解的矛盾。
实施例3：牛津杯法检测抑菌活性
1.重组蛋白tha-orf_91与重组蛋白orf_91-tha抑菌活性检测
在超净台中，分别把含有大肠杆菌的平板和枯草芽孢杆菌的平板分别分成四个区域，每区域放1个牛津杯，牛津杯中分别加入250μL的Amp(1mg/mL)、ddH2O、未透析并酶切后的重组蛋白和浓缩后并酶切后的重组蛋白。37℃培养过夜后观察抑菌圈的大小，判断样品的抗菌活性。
2.thanatin蛋白抑菌活性检测
通过重组蛋白浓度及蛋白氨基酸数目将蛋白浓度进行调整，使thanatin的摩尔浓度与重组蛋白的摩尔浓度相同(表1)，以TG1为革兰氏阴性菌试验菌，枯草芽孢杆菌为革兰氏阳性菌试验菌，五个牛津杯(A、B、C、D、E)中分别加入250μL的Amp(1mg/mL)、thanatin、tha-orf_91、orf_91-tha及ddH2O。37℃培养过夜后观察抑菌圈的大小，判断样品抑菌活性。
表1通过相同摩尔浓度调整的高浓度组和低浓度组.
结果显示：纯化后tha-orf_91重组蛋白与orf_91-tha重组蛋白在革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌检测平板上均产生了抑菌圈，且在革兰氏阴性菌上形成的抑菌圈比Amp形成的抑菌圈大，但在革兰氏阳性菌上形成的抑菌圈不明显(如图5(A)、(B)、(C)、(D)。因此，可以初步判断纯化后tha-orf_91重组蛋白与orf_91-tha重组蛋白对革兰氏阴性菌有抑菌活性且活性很强，对革兰氏阳性菌有抑菌效果但活性较弱。
同样以大肠杆菌和枯草芽孢杆菌为试验菌检测重组蛋白的活性，同时以抗生素作阳性对照，以ddH2O作阴性对照。结果显示：Thanatin单独基因在大肠杆菌中表达的蛋白的抑菌圈与融合蛋白tha-orf_91与orf_91-tha所形成的抑菌圈相比明显较小(如图6)。表明两种重组蛋白对革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌均有明显的抑菌效果，且与thanatin相比活性均增强，特别是对革兰氏阳性菌抑菌活性大大增强。
重组蛋白orf_91-tha对革兰氏阳性菌的MIC(最小抑菌浓度)比thanatin和重组蛋白tha-orf_91小，即抑菌活性更高。且通过将低浓度组与高浓度组进行对照可知，重组蛋白orf_91-tha对革兰氏阳性菌的MIC比thanatin和重组蛋白tha-orf_91小(图7)，即抑菌活性更高。
以上实验结果也可以从orf_91鲨肝肽和Thanatin融合蛋白的序列特征得到验证，比较thanatin和与orf_91鲨肝肽融合后的序列，发现融合后的蛋白多了很多疏水性氨基酸和正电荷(orf_91一共34个氨基酸，含有15个疏水性氨基酸和5个正电荷氨基酸)，而这些正是融合蛋白抗菌的机理：通过疏水作用和正电荷的促进作用与细菌细胞膜结合，从而通过膜穿孔和和非膜穿孔形式导致细菌死亡。因此从氨基酸序列来看，融合后的蛋白增加了thanatin的抗菌活性。
其次，实验结果中发现orf_91连在thanatin序列后面(C端)时抗菌活性比在前面(N端)时低，根据研究发现thanatin的N端为几个疏水性氨基酸组成的无序结构，C端包含一个反向平行的β折叠，并且包含一个二硫键；其抑菌的最小基序由C端环和相邻残基组成，C末端Met残基的酞氨化对其抗菌活性是重要的。我们推测可能在其C端加上一些氨基酸时会影响thanatinC端的反向β折叠结构及C末端袢，从而影响其抗菌活性。
图8是thanatin(氨基酸序列如SEQIDNO.8所示)的蛋白结构解析图，图9是tha-orf_91融合蛋白(SEQIDNO.11示)的蛋白结构预测图，图10是orf_91-tha融合蛋白(SEQIDNO.12示)的蛋白结构预测图。
综合上述实验结果可以得出结论：两种重组蛋白tha-orf_91与orf_91-tha的抑菌活性较thanatin活性提高，特别是对革兰氏阳性菌的抑菌活性大大提高，其中重组蛋白orf_91-tha的抑菌效果最好。
抑菌活性实验表明产物具有较高的抗菌活性，表明本发明orf_91鲨肝肽和Thanatin(死亡素)融合蛋白或者融合基因可应用于抗菌药物制备中，这为研制新一代的抗菌药物打下了基础，具有广泛的应用前景。
本发明实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合生物工程技术领域的市售产品。
以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。
序列表：
SEQIDNO.1：
GGTTCTAAGAAGCCTGTTCCTATTATTTACTGCAACCGTCGTACTGGTAAGTGCCAACGTATG
SEQIDNO.2：
ATGCCTTTCCAGGTCAGAGGGGGATGTAAATGCCTTGCCACAATCTCTACATTTCCACGGTTTTT
CCCCAGTGTGACTGAGCTTATGTCTCGACAGACCAGA
SEQIDNO.3：
GGTAGCGCAGGTAGCGCAGGTAGCGCA
SEQIDNO.4：
GGTTCTAAGAAGCCTGTTCCTATTATTTACTGCAACCGTCGTACTGGTAAGTGCCAACGTATG
GGTAGCGCAGGTAGCGCAGGTAGCGCAATGCCTTTCCAGGTCAGAGGGGGATGTAAATGCCTT
GCCACAATCTCTACATTTCCACGGTTTTTCCCCAGTGTGACTGAGCTTATGTCTCGACAGACCA
GATAA
SEQIDNO.5：
ATGCCTTTCCAGGTCAGAGGGGGATGTAAATGCCTTGCCACAATCTCTACATTTCCACGGTTTTT
CCCCAGTGTGACTGAGCTTATGTCTCGACAGACCAGAGGTAGCGCAGGTAGCGCAGGTAGCGC
AGGTTCTAAGAAGCCTGTTCCTATTATTTACTGCAACCGTCGTACTGGTAAGTGCCAACGTATGT
AA
SEQIDNO.6：
GGTAGCAAAAAACCGGTGCCGATTATCTATTGCAACCGCCGCACCGGCAAATGCCAGCGTATG
GGTAGCGCAGGTAGCGCCGGTAGCGCAATGCCGTTTCAGGTGCGCGGTGGTTGCAAATGCCTG
GCCACCATTAGCACCTTTCCGCGCTTTTTTCCGAGCGTGACCGAACTGATGAGCCGCCAGACCC
GCTAA
SEQIDNO.7：
ATGCCGTTTCAGGTGCGCGGTGGTTGCAAATGCCTGGCCACCATTAGCACCTTTCCGCGCTTTT
TTCCGAGCGTGACCGAACTGATGAGCCGTCAGACCCGTGGTAGCGCAGGTAGCGCAGGTAGCG
CAGGCAGCAAAAAACCGGTGCCGATCATCTACTGCAATCGCCGCACCGGTAAATGCCAGCGCA
TGTAA
SEQIDNO.8：
GSKKPVPIIYCNRRTGKCQRM
SEQIDNO.9：
MPFQVRGGCKCLATISTFPRFFPSVTELMSRQTR
SEQIDNO.10：
GSAGSAGSA
SEQIDNO.11：
GSKKPVPIIYCNRRTGKCQRMGSAGSAGSAMPFQVRGGCKCLATISTFPRFFPSVTELMSRQTR
SEQIDNO.12：
MPFQVRGGCKCLATISTFPRFFPSVTELMSRQTRGSAGSAGSAGSKKPVPIIYCNRRTGKCQRM

Claims (6)

1.一种抗菌肽融合蛋白，其特征在于：该蛋白包括抗菌肽thanatin蛋白、orf-91鲨肝肽蛋白，所述抗菌肽thanatin蛋白与orf-91鲨肝肽蛋白之间通过3GSA柔性肽片段连接，所述抗菌肽thanatin蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.8所示，所述orf-91鲨肝肽蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.9所示，所述3GSA柔性肽片段如SEQIDNO.10所示。
2.根据权利要求1所述的抗菌肽融合蛋白，其特征在于：该蛋白是抗菌肽thanatin蛋白编码基因、orf-91鲨肝肽编码基因、以及位于抗菌肽thanatin蛋白编码基因与orf-91鲨肝肽编码基因之间的3GSA柔性肽编码基因在基因水平融合后在原核表达的可溶性重组蛋白。
3.权利要求1所述的抗菌肽融合蛋白的编码基因，其特征在于：其核酸序列如SEQIDNO.4所示或如SEQIDNO.5所示。
4.权利要求1所述的抗菌肽融合蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)采用人工合成的方法获得包含抗菌肽thanatin蛋白编码基因序列、3GSA柔性肽编码基因序列、orf-91鲨肝肽编码基因的tha-orf_91融合基因序列和/或orf_91-tha融合基因序列，分别如SEQIDNO.4所示、如SEQIDNO.5所示；
(2)以pETDuet质粒为载体，构建重组质粒，并转化至大肠杆菌E.coliTG1中，通过鉴定、筛选，得到阳性克隆；
(3)将阳性克隆转化至大肠杆菌宿主菌BL21中，通过氨苄青霉素抗生素的筛选获得表达菌株；
(4)挑取阳性单克隆至LB培养基，LB培养基中含氨苄青霉素，培养至OD600为0.5-0.7，加入IPTG进行蛋白诱导，得到在上清表达的带Sumo标签的融合蛋白；
(5)对得到的带Sumo标签的融合蛋白进行纯化，然后切除Sumo标签，得到抗菌肽融合蛋白。
5.权利要求1所述的抗菌肽融合蛋白在制备抗菌药物中的应用。
6.权利要求3所述的抗菌肽融合蛋白的编码基因在制备抗菌药物中的应用。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106632692A (zh) * 2016-12-30 2017-05-10 浙江益肽生物科技有限公司 抗菌肽融合蛋白及其制备方法和应用
CN107056948A (zh) * 2016-12-30 2017-08-18 杭州洪晟生物技术股份有限公司 抗菌肽融合蛋白及其制备方法和应用
CN107988295A (zh) * 2017-11-20 2018-05-04 广东海纳川生物科技股份有限公司 一种毕赤酵母发酵表达重组死亡素的生产工艺
CN112457413A (zh) * 2020-12-09 2021-03-09 青岛农业大学 一种利用sumo融合表达抗菌肽的方法

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101173004A (zh) * 2007-10-30 2008-05-07 沈子龙 一种昆虫抗菌肽Thanatin及其缺失突变体的制备方法
CN102260698A (zh) * 2011-05-27 2011-11-30 浙江理工大学 大肠杆菌中表达PTA-linker-thanatin融合蛋白及其抗癌研究
CN102372781A (zh) * 2011-11-03 2012-03-14 中国科学院遗传与发育生物学研究所 昆虫抗菌肽Thanatin(S)融合蛋白及其在植物抗病中的应用
CN103641901A (zh) * 2014-01-07 2014-03-19 钱坤 一种抗菌肽
CN105061603A (zh) * 2015-08-11 2015-11-18 浙江益肽生物科技有限公司 抗菌肽-溶菌酶融合蛋白的制备方法及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101173004A (zh) * 2007-10-30 2008-05-07 沈子龙 一种昆虫抗菌肽Thanatin及其缺失突变体的制备方法
CN102260698A (zh) * 2011-05-27 2011-11-30 浙江理工大学 大肠杆菌中表达PTA-linker-thanatin融合蛋白及其抗癌研究
CN102372781A (zh) * 2011-11-03 2012-03-14 中国科学院遗传与发育生物学研究所 昆虫抗菌肽Thanatin(S)融合蛋白及其在植物抗病中的应用
CN103641901A (zh) * 2014-01-07 2014-03-19 钱坤 一种抗菌肽
CN105061603A (zh) * 2015-08-11 2015-11-18 浙江益肽生物科技有限公司 抗菌肽-溶菌酶融合蛋白的制备方法及其应用

Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106632692A (zh) * 2016-12-30 2017-05-10 浙江益肽生物科技有限公司 抗菌肽融合蛋白及其制备方法和应用
CN107056948A (zh) * 2016-12-30 2017-08-18 杭州洪晟生物技术股份有限公司 抗菌肽融合蛋白及其制备方法和应用
CN107056948B (zh) * 2016-12-30 2020-11-13 杭州洪晟生物技术股份有限公司 抗菌肽融合蛋白及其制备方法和应用
CN107988295A (zh) * 2017-11-20 2018-05-04 广东海纳川生物科技股份有限公司 一种毕赤酵母发酵表达重组死亡素的生产工艺
CN112457413A (zh) * 2020-12-09 2021-03-09 青岛农业大学 一种利用sumo融合表达抗菌肽的方法
CN112457413B (zh) * 2020-12-09 2022-06-28 青岛农业大学 一种利用sumo融合表达抗菌肽的方法

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