CN105061603A - 抗菌肽-溶菌酶融合蛋白的制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种抗菌肽-溶菌酶融合蛋白，该蛋白从N端-C端依次包含抗菌肽thanatin蛋白、3GSA柔性肽、T4溶菌酶蛋白。制备方法如下：采用人工合成获得包含抗菌肽thanatin、3GSA柔性肽、T4溶菌酶编码基因序列；以pETDuet质粒为载体，构建重组质粒；转化至BL21中，筛选获得表达菌株；挑取单克隆至LB培养基，进行蛋白诱导，得到在上清表达的融合蛋白；融合蛋白纯化，切除Sumo标签，得到目的抗菌肽-溶菌酶融合蛋白。该蛋白被证明在提高仔猪成活率、降低保育猪的腹泻率、降低保育猪的呼吸道病发病率方面具有显著效果，可用于制备相关药物制剂。

Description

抗菌肽-溶菌酶融合蛋白的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术制药工程技术领域，尤其涉及一种抗菌肽-溶菌酶融合蛋白的制备方法，以及该融合蛋白在提高仔猪成活率以及降低保育猪的腹泻率、呼吸道病发病率中的应用。

背景技术

自抗生素问世以来，其在人类与动物的疾病治疗方面发挥了至关重要的作用，不仅如此，抗生素作为人类的食品添加剂和动物饲料添加剂的应用也越来越多。正是由于抗生素被广泛的应用甚至滥用，细菌的耐药性越来越来强，由此带来的抗生素的杀菌效果越来越差，甚至出现一些抗生素无法杀死的超级细菌。因此寻找新的抗菌物质的任务迫在眉睫。

近些年出现的抗菌肽和溶菌酶是一类具有杀菌活性的天然多肽和蛋白，其做为抗生素替代品已广泛的应用于医药临床和食品工业。1981年，人们第一次真正意义上发现抗菌肽Cecropin，迄今为止仅在昆虫中就发现了超过2000种抗菌肽类物质，这些抗菌肽不仅对细菌、真菌有抗菌能力，对病毒、原虫及癌细胞也有一定作用。溶菌酶作为机体非特异免疫因子之一，也具有多种药理功效，如抗菌消炎、抗病毒、增强免疫力、止血、凝血等。抗菌肽的抗菌机理为带正电荷的抗菌肽与带有负电荷的细菌细胞膜结合，通过造成膜穿孔的或抑制细菌的生理代谢过程造成细菌死亡。溶菌酶又称为胞壁质酶，其通过分解细胞壁上肽聚糖的β-(1,4)糖苷键发挥其杀菌作用。目前，抗菌肽和溶菌酶主要都是单独存在而发挥其抗菌功能，但由于其杀菌机理的不同，对不同菌株的杀菌方面具有一定的局限性，导致其各自有较窄的抗菌谱，不能达到很好的杀菌效果。

公告为CN101649311B的中国发明专利公开了一种人溶菌酶-抗菌肽融合蛋白的制备方法，它采用基因工程的方法构建人溶菌酶-抗菌肽重组质粒，然后在真核表达人溶菌酶-抗菌肽融合蛋白，该融合蛋白的表达体系构建成本高，蛋白表达量少，不利于工业化生产。

目前也有研究者试图在原核表达溶菌酶-抗菌肽融合蛋白，但是进展不佳，要么融合蛋白不能够成功表达，要么融合蛋白虽然能够表达，但是只能表达在包涵体，导致后期纯化复性难度大，对蛋白活性影响大，从而影响其后期功能实现和进一步应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服以上现有技术问题的不足，提供一种抗菌肽-溶菌酶融合蛋白以及该融合蛋白的制备方法，该融合蛋白的表达体系采用在原核表达融合蛋白，体系构建成本低，蛋白表达量大，更利于工业化生产，且融合蛋白成功表达在上清，有利于融合蛋白后期的纯化复性，有利于保持融合蛋白的活性。

本发明所采用的技术方案为提供一种抗菌肽-溶菌酶融合蛋白，它从N端-C端依次包含了抗菌肽thanatin蛋白、3GSA柔性肽、T4溶菌酶蛋白，氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。该融合蛋白是通过基因工程把抗菌肽thanatin(死亡素)的密码子与T4溶菌酶的密码子串联起来，中间插入3GSA作为一段柔性肽，避免蛋白表达后抗菌肽与溶菌酶的结构相互影响从而影响其各自的活性，并通过其N端与sumo蛋白结合，成功构建能够在原核表达、并表达在上清的重组蛋白，其中抗菌肽thanatin蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，3GSA柔性肽的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，T4溶菌酶蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。

上述抗菌肽-溶菌酶融合蛋白的制备方法，包括以下步骤：

(1)采用人工合成的方法获得依次包含抗菌肽thanatin基因序列、3GSA柔性肽基因序列、T4溶菌酶基因序列的tha-3GSA-T4基因序列，如SEQIDNO.6所示，其中抗菌肽thanatin基因序列如SEQIDNO.7所示，3GSA柔性肽基因序列如SEQIDNO.8所示，T4溶菌酶基因序列如SEQIDNO.9所示；

(2)以pETDuet质粒为载体，构建pETDuet-Sumo-tha-3GSA-T4重组质粒，并转化至大肠杆菌Top10中，通过PCR、双酶切及测序鉴定，筛选得到阳性克隆；

(3)将阳性克隆即测序准确的pETDuet-Sumo-tha-3GSA-T4重组质粒转化至大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)中，通过氨苄青霉素抗生素的筛选获得表达菌株；

(4)挑取pETDuet-sumo-tha-3GSA-T4/BL21单克隆至LB培养基，LB培养基中含50ug/ml氨苄青霉素，37℃培养至OD₆₀₀为0.75-0.85，加入终浓度0.1mM的IPTG进行蛋白诱导，诱导条件为16℃培养16-20h，得到在上清表达的Sumo-tha-3GSA-T4融合蛋白；

(5)对得到的Sumo-tha-3GSA-T4融合蛋白进行纯化，然后切除Sumo标签，得到抗菌肽-溶菌酶融合蛋白。

本发明进一步提供上述抗菌肽-溶菌酶融合蛋白在作为提高仔猪成活率、降低保育猪腹泻率、降低保育猪呼吸道病发病率药物中的应用。

与现有技术相比，本发明具有以下显著优点和有益效果：

(1)通过对抗菌肽基因和溶菌酶基因的选择，以及柔性肽和标签蛋白的选择和合适排布，通过在基因工程上把抗菌肽thanatin和T4溶菌酶基因密码子串联并在二者间插入3GSA柔性肽的方法，以sumo为融合蛋白，pETDuet为载体，在工程菌E.coliBL21(DE3)内成功表达一种同时具备结合抗菌肽和溶菌酶的抗菌能力的抗菌蛋白，且融合蛋白表达在上清，表达量大，有利于后期的纯化复性以及融合蛋白活性的保证；

(2)通过基因重组的方式表达了结合抗菌肽和溶菌酶两种杀菌机制、活性更高、抗菌谱更广的融合蛋白，该重组蛋白被证明在提高仔猪成活率、降低保育猪的腹泻率、降低保育猪的呼吸道病发病率方面具有显著效果，可用于制备相关药物制剂。

附图说明

图1所示的是本发明His6-Sumo-tha-3GSA-T4融合蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳检测图，其中1.marker；2.总蛋白；3.破碎后上清；4.破碎后沉淀；5.过镍柱流穿；6.镍柱洗脱液；

图2所示的是本发明tha-3GSA-T4融合蛋白的SDS-PAGE凝胶电泳检测图，其中1.marker；2.纯化后的His6-Sumo-tha-3GSA-T4融合蛋白；3.UIP1cut；4.tha-3GSA-T4融合蛋白；

图3所示的是本发明Tha-T4融合蛋白对革兰氏阳性菌的抑菌效果图，其中1.thanatin0.1mM/L；2.T40.1mM/L；3.tha、T4各0.1mM/L的混合液；4.tha-T40.1mM/L；

图4所示的是本发明Tha-T4融合蛋白对革兰氏阴性菌的抑菌效果图，其中1.thanatin0.1mM/L；2.T40.1mM/L；3.tha、T4各0.1mM/L的混合液；4.tha-T40.1mM/L；

图5所示的是本发明实施例4中不同处理组仔猪生长性能比较；

图6所示的是本发明实施例4中不同处理组仔猪健康水平比较。

具体实施方式

以下结合实施例对本发明作进一步具体描述。应该指出，以下具体说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有说明，本发明使用的所有科学和技术术语具有与本发明所属技术领域人员通常理解的相同含义。

实施例1：抗菌肽Thanatin和T4溶菌酶的串联表达与蛋白纯化

1、融合基因的设计与合成

人死亡素(thanatian)和T4溶菌酶蛋白是以thanatian-连接肽-T4溶菌酶的方式连接，因此thanatin基因在前，T4溶菌酶基因在后。

连接肽选用3GSA片段，插入在抗菌肽和溶菌酶的基因之间，作为一段柔性肽，减少两部分蛋白在结构上的影响，并增加融合蛋白表达的可溶性。

在融合蛋白的N端添加sumo蛋白，不仅起到助融作用，还有助于减小抗菌蛋白对宿主细菌的毒性的活性，使其在宿主菌内大量表达。

抗菌肽thanatin基因序列如SEQIDNO.7所示，3GSA柔性肽基因序列如SEQIDNO.8所示，T4溶菌酶基因序列如SEQIDNO.9所示。采用人工合成(苏州金唯智生物科技有限公司)的方法获得依次包含Sumo蛋白基因序列、抗菌肽thanatin基因序列、3GSA柔性肽基因序列、T4溶菌酶基因序列的tha-3GSA-T4基因序列，具体如SEQIDNO.6所示。

设计的抗菌肽-溶菌酶融合蛋白从N端-C端依次包含了抗菌肽thanatin蛋白、3GSA柔性肽、T4溶菌酶蛋白，氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，其抗菌肽thanatin蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，3GSA柔性肽的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，T4溶菌酶蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO.4所示。

2、重组质粒pETDuet-Sumo-tha-3GSA-T4的构建

以pETDuet质粒为载体，先构建包含His6-sumo序列的pETDuet-His6-sumo重组载体，然后tha-3GSA-T4基因序列与经过BamHI和NotI双酶切的pETDuet-His6-sumo载体连接，并转化至大肠杆菌Top10中，通过PCR和双酶切鉴定，筛选阳性克隆，并送至上海生物工程测序鉴定。His6-sumo基因序列如SEQIDNO.10所示，其编码的氨基酸序列如SEQIDNO.5所示，采用人工合成(苏州金唯智生物科技有限公司)。

3、重组质粒的转化

将测序正确的重组质粒pETDuet-His6-Sumo-tha-3GSA-T4采用CaCl₂方法转化至大肠杆菌宿主菌BL21(DE3)中，通过氨苄青霉素抗生素的筛选获得表达菌株。

4、Tha-T4融合蛋白的诱导表达及纯化

挑取pETDuet-His6-Sumo-tha-3GSA-T4/BL21单克隆至50ml培养基中，加入终浓度为50ug/ml的氨苄青霉素，培养过夜。第二天转接至2L的LB培养基中，37℃培养值OD₆₀₀为0.8左右，加入终浓度0.1mM的IPTG诱导，16℃培养18h。

4℃、4000rpm离心30min，收集菌液，弃上清培养基，加入30mLHisbufferA(20mMTris、200mMNaCl、10％glycerol、25mMImidazoleFinal，PH8.0)重悬菌体，高压机械破碎菌体。4℃、16000rpm离心30min，重复2次，收集上清，将上清通过蠕动泵输送至经过HisbufferA预平衡过的Ni-NTA柱，使蛋白结合在柱子中。将柱子连接在FPLC中，用预设好的洗脱程序洗脱(50％HisbufferB(20mMTris、200mMNaCl、10％glycerol、275mMImidazoleFinal，PH8.0))收集融合蛋白。分别收集总蛋白、破碎后上清与沉淀、过镍柱流穿及洗脱下来的蛋白，进行SDS-PAGE凝胶电泳检测，结果如图1所示。

在融合蛋白中以酶:融合蛋白为1:1000(体积比)的比例加入UIP1酶，以切除sumo融合蛋白，再通过Ni-NTA柱子，流穿的为目的tha-3GSA-T4融合蛋白。浓缩目的蛋白后通过FPLC将样品过凝胶层析柱superdex75，获得纯化后的目的tha-3GSA-T4融合蛋白，SDS-PAGE电泳如图2所示。采用冷冻干燥法将纯化后的目的蛋白冻成粉末保存，以便后续的动物实验。

实施例2：抗菌肽Thanatin-T4溶菌酶(tha-3GSA-T4)融合蛋白的抗菌活性测定

以牛津杯法检测融合蛋白的抗菌活性：

在平板中先倒入一层琼脂粉，待其凝固后将对数生长期的试验菌分别按0.1％的接种量加入20m150℃左右LB固体培养基中，混匀后再铺平板。在平板上垂直放上牛津杯，并在其中加入200μL的样品，放入37℃的烘箱12h。分别以Thanatin和T4溶菌酶单独为对照。

试验菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，其中革兰氏阳性菌选用枯草芽孢杆菌(ATCC6633)，革兰氏阴性菌选用大肠杆菌(ATCC25922)。

以抑菌圈的大小判断抑菌活性的强弱。

结果如图3、图4所示，由抑菌圈大小可以看出：抗菌肽Thanatin-T4溶菌酶串联蛋白的抑菌作用均大于Thanatin和T4的单独作用，并且要优于Thanatin和T4的混合溶液。

实施例3：tha-3GSA-T4融合蛋白对仔猪成活率的研究

实验用品种为杜洛克、大约克和长白母猪三元杂交种，在试验期间所有仔猪按正常的免疫程序进行疫苗接种，并按常规方式进行管理。

试验组：在饲料中按3‰(重量比，下同)的比例加入tha-T4融合蛋白。仔猪从7日龄教槽开始添加直到保育舍出栏。

对照组：仔猪按在饲料中3‰的比例分别加入Thanatin、T4溶菌酶、Thanatin+溶菌酶(Thanatin和T4溶菌酶等摩尔比混合)、以及常规抗生素阿莫西林。

结果如表1所示。

表1仔猪哺乳、保育阶段存活率统计

由表1可以看出，tha-T4融合蛋白可显著提高哺乳及保育阶段仔猪成活率，并且效果要好于Thanatin和溶菌酶单独和混合的作用，该效果很可能通过调节猪体免疫系统而显著提高了仔猪健康状况。

实施例4：tha-3GSA-T4融合蛋白对保育猪生长性能的研究

将200头杂种仔猪随机分成5组，每组2个重复，每个重复20头猪，公母各半。各试验组依次在基础饲料中添加0.5％(重量比，下同)阿莫西林组、0.5％T4溶菌酶组、0.5％Thanatin组、0.5％Thanatin+溶菌酶组(Thanatin和T4溶菌酶等摩尔比混合)、0.5％tha-T4融合蛋白组，并以基础饲粮组为空白对照组。分别记录仔猪的始重、末重、日增重，结果如图5所示。分别记录仔猪的腹泻、呼吸道发病情况，结果如图6所示。

由图5、图6可以看出，tha-T4融合蛋白组组生长性能均好于抗生素对照组、溶菌酶组、Thanatin组、Thanatin+溶菌酶组，说明tha-T4融合蛋白能够通过提高猪群的健康水平来间接促进仔猪生长增重。并且试验猪的腹泻率、呼吸道病发病率都有明显下降，说明使用tha-T4融合蛋白制剂能明显降低保育猪的腹泻率以及呼吸道病发病率。

本发明实施例涉及到的材料、试剂和实验设备，如无特别说明，均为符合生物工程技术领域的市售产品。

以上所述，仅为本发明的优选实施例，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的核心技术的前提下，还可以做出改进和润饰，这些改进和润饰也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。

序列表：

SEQIDNO.1：

GSKKPVPIIYCNRRTGKCQRMGSAGSAGSAMNIFEMLRIDEGLRLKIYKDTEGYYTIGIGHLLTKSPSLSVAKSELDKAIGRNCNGVITKDEAEKLFNQDVDAAVRGILRNAKLKPVYDSLDAVRRCALINMVFQMGETGVAGFTNSLRMLQQKRWDEAAVNLAKSRWYNQTPNRAKRVIATFRTGTWDAYKNL.

SEQIDNO.2：

GSKKPVPIIYCNRRTGKCQRM

SEQIDNO.3：

GSAGSAGSA

SEQIDNO.4：

MNIFEMLRIDEGLRLKIYKDTEGYYTIGIGHLLTKSPSLSVAKSELDKAIGRNCNGVITKDEAEKLFNQDVDAAVRGILRNAKLKPVYDSLDAVRRCALINMVFQMGETGVAGFTNSLRMLQQKRWDEAAVNLAKSRWYNQTPNRAKRVIATFRTGTWDAYKNL

SEQIDNO.5：

MGHHHHHHGSDSEVNQEAKPEVKPEVKPETHINLKVSDGSSEIFFKIKKTTPLRRLMEAFAKRQGKEMDSLRFLYDGIRIQADQAPEDLDMEDNDIIEAHREQIGG

SEQIDNO.6：

GGCAGCAAAAAACCGGTGCCGATCATCTACTGCAATCGCCGCACCGGTAAATGCCAACGTATGGGTAGCGCCGGTAGCGCAGGTAGCGCCATGAATATTTTTGAAATGCTGCGCATCGATGAAGGCCTGCGCCTGAAAATTTATAAAGATACCGAGGGTTACTACACGATCGGCATTGGCCACCTGCTGACCAAAAGCCCGAGCCTGAGTGTGGCCAAAAGCGAACTGGACAAAGCCATTGGTCGCAACTGCAACGGTGTGATCACCAAGGATGAGGCCGAAAAACTGTTCAACCAGGACGTGGATGCCGCCGTTCGCGGTATTCTGCGTAACGCCAAACTGAAACCGGTGTACGACAGTCTGGATGCCGTGCGTCGCTGCGCCCTGATCAACATGGTGTTTCAGATGGGCGAAACCGGTGTGGCAGGCTTTACCAATAGCCTGCGCATGCTACAGCAGAAACGCTGGGATGAAGCCGCCGTGAATCTGGCCAAAAGCCGCTGGTATAACCAGACCCCGAATCGCGCCAAACGCGTGATCGCCACATTTCGCACCGGCACCTGGGATGCCTATAAAAATCTGTAA

SEQIDNO.7：

GGCAGCAAAAAACCGGTGCCGATCATCTACTGCAATCGCCGCACCGGTAAATGCCAACGTATG

SEQIDNO.8：

GGTAGCGCCGGTAGCGCAGGTAGCGCC

SEQIDNO.9：

ATGAATATTTTTGAAATGCTGCGCATCGATGAAGGCCTGCGCCTGAAAATTTATAAAGATACCGAGGGTTACTACACGATCGGCATTGGCCACCTGCTGACCAAAAGCCCGAGCCTGAGTGTGGCCAAAAGCGAACTGGACAAAGCCATTGGTCGCAACTGCAACGGTGTGATCACCAAGGATGAGGCCGAAAAACTGTTCAACCAGGACGTGGATGCCGCCGTTCGCGGTATTCTGCGTAACGCCAAACTGAAACCGGTGTACGACAGTCTGGATGCCGTGCGTCGCTGCGCCCTGATCAACATGGTGTTTCAGATGGGCGAAACCGGTGTGGCAGGCTTTACCAATAGCCTGCGCATGCTACAGCAGAAACGCTGGGATGAAGCCGCCGTGAATCTGGCCAAAAGCCGCTGGTATAACCAGACCCCGAATCGCGCCAAACGCGTGATCGCCACATTTCGCACCGGCACCTGGGATGCCTATAAAAATCTG

SEQIDNO.10：

ATGGGTCATCACCATCATCATCACGGGTCGGACTCAGAAGTCAATCAAGAAGCTAAGCCAGAGGTCAAGCCAGAAGTCAAGCCTGAGACTCACATCAATTTAAAGGTGTCCGATGGATCTTCAGAGATCTTCTTCAAGATCAAAAAGACCACTCCTTTAAGAAGGCTGATGGAAGCGTTCGCTAAAAGACAGGGTAAGGAAATGGACTCCTTAAGATTCTTGTACGACGGTATTAGAATTCAAGCTGATCAGGCCCCTGAAGATTTGGACATGGAGGATAACGATATTATTGAGGCTCACCGCGAACAGATTGGAGGT

Claims (7)

1.一种抗菌肽-溶菌酶融合蛋白，其特征在于：该蛋白从N端-C端依次包含了抗菌肽thanatin蛋白、3GSA柔性肽、T4溶菌酶蛋白，氨基酸序列如SEQIDNO.1所示。

2.根据权利要求1所述的抗菌肽-溶菌酶融合蛋白，其特征在于：该蛋白是抗菌肽thanatin蛋白编码基因、3GSA柔性肽编码基因、T4溶菌酶蛋白编码基因在基因水平融合后在原核表达的可溶性重组蛋白。

3.权利要求1所述的抗菌肽-溶菌酶融合蛋白的编码基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQIDNO.6所示。

4.权利要求1所述的抗菌肽-溶菌酶融合蛋白的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)采用人工合成的方法获得依次包含抗菌肽thanatin基因序列、3GSA柔性肽基因序列、T4溶菌酶基因序列的tha-3GSA-T4基因序列，如SEQIDNO.6所示；

(2)以pETDuet质粒为载体，构建pETDuet-Sumo-tha-3GSA-T4重组质粒，并转化至大肠杆菌Top10中，通过鉴定、筛选，得到阳性克隆；

(3)将阳性克隆转化至大肠杆菌宿主菌BL21中，通过氨苄青霉素抗生素的筛选获得表达菌株；

(4)挑取pETDue-sumo-tha-3GSA-T4/BL21单克隆至LB培养基，LB培养基中含50ug/ml氨苄青霉素，37℃培养至OD₆₀₀为0.75-0.85，加入终浓度0.1mM的IPTG进行蛋白诱导，诱导条件为16℃培养16-20h，得到在上清表达的Sumo-tha-3GSA-T4融合蛋白；

(5)对得到的Sumo-tha-3GSA-T4融合蛋白进行纯化，然后切除Sumo标签，得到抗菌肽-溶菌酶融合蛋白。

5.权利要求1所述的抗菌肽-溶菌酶融合蛋白在制备提高仔猪成活率的药物中的应用。

6.权利要求1所述的抗菌肽-溶菌酶融合蛋白在制备降低保育猪腹泻率的药物中的应用。

7.权利要求1所述的抗菌肽-溶菌酶融合蛋白制备降低保育猪呼吸道病发病率的药物中的应用。