CN105104803A - 一种基于抗菌肽制备的水产饲料 - Google Patents

一种基于抗菌肽制备的水产饲料 Download PDF

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逯佩凤
周玉岩
宋宏斌
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Abstract

本发明公开一种基于抗菌肽制备的水产饲料,所述水产饲料按重量份数计包括:豆粕25-30份;面粉24.55-30份;次粉10~15份;菜籽粕20~30份;柠檬酸5-8份;鱼粉15-35份;米糠粕10-14份;酵母提取物3-5份;60%氯化胆碱0.5-1份;肉骨粉5-10份;磷酸二氢钙1-2份;中药制剂0.05-0.1份;多维多矿预混剂0.5~1.5份;氯化钾0.3~0.5份;鱼油1~2份豆油1~2份;抗菌肽制剂0.025-0.15份。本发明水产饲料结合特定的抗菌肽制备得到,适用于养殖鱼、虾等,增强水生生物免疫力,有效预防疾病,解决了养殖过程中使用抗生素带来的食品安全、生态安全等问题。

Description

一种基于抗菌肽制备的水产饲料
技术领域
本发明涉及饲料制备技术领域,尤其涉及一种基于抗菌肽制备的水产饲料。
背景技术
我国是目前世界最大的水产品养殖国,水产养殖占全世界养殖总量和70%左右,而为提高水产动物的抗病性和生长率,在养殖过程中通常使用一定剂量的抗生素等,从而产生的细菌耐药性,水产品食品安全,生态安全等系列问题,使得养殖环境进入恶性循环,养殖效益下降。
抗菌肽(antibacterialpeptides,ABP)是生物免疫防御系统在受到外界刺激时产生的一类具有生物活性的小分子多肽,分子量多在2000~7000Da,由20~60个氨基酸残基组成,是生物体天然免疫防御系统的重要组成部分。乞今为止,已在许多生物包括昆虫、鸟类、动物、植物及原核生物中发现2500多种抗菌肽。抗菌肽具有强碱性、热稳定性以及广谱杀菌、抗菌等特点,对生物的天然免疫起关键作用,作用机理独特,不仅能杀死革兰氏阳性及阴性菌,还具有抗真菌、病毒、原虫及抑制癌细胞的活性。对耐药菌株有明显的杀伤作用,同时对生物体的正常细胞无害,提高动物免疫力等特点,具有广阔的发展前景。作为一种新型饲料添加剂,其在水产养殖业的应用受到了普遍关注。与抗生素相比,具有无污染、无毒副作用、不产生耐药性等优点,符合绿色环保饲料的要求,是理想的抗生素替代品
因此,现有技术还有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种基于抗菌肽制备的水产饲料,旨在解决目前水产养殖过程中传统饲料带来的水产生物免疫力下降、药物残留、微生态失衡等问题。
本发明的技术方案如下:
一种基于抗菌肽制备的水产饲料,其中,所述水产饲料按重量份数计包括:
豆粕25-30份;
面粉24.55-30份;
次粉10~15份
菜籽粕20~30份
柠檬酸5-8份;
鱼粉15-35份;
米糠粕10-14份;
酵母提取物3-5份;
60%氯化胆碱0.5-1份;
肉骨粉5-10份;
磷酸二氢钙1-2份;
中药制剂0.05-0.1份;
多维多矿预混剂0.5~1.5份
氯化钾0.3~0.5份
鱼油1~2份
豆油1~2份
抗菌肽制剂(CAD)0.025-0.15份;
所述的基于对虾抗菌肽制备的水产饲料,其中,所述抗菌肽制剂效价为20000~40000u/g,其以玉米淀粉为载体。
所述的基于对虾抗菌肽制备的水产饲料,其中,所述抗菌肽制剂中抗菌肽的氨基酸序列为:KWKLFKKIEKVGQRVRDAVISAGPAVATVAQATALAKN
所述的基于对虾抗菌肽制备的水产饲料,其中,所述抗菌肽由如下核苷酸序列的基因编码得到:ATGAAATGGAAGTTGTTCAAAAAGATTGAAAAGGTTGGTCAAAGAGTTAGAGACGCTGTCATCTCTGCTGGTCCTGCTGTTGCCACTGTTGCTCAAGCTACTGCCTTGGCTAAGAACTAA
所述的基于对虾抗菌肽制备的水产饲料,其中,所述抗菌肽的制备过程如下:
A、将该抗菌肽的编码基因与质粒PHIL-S1构建为表达载体;
B、将融合表达载体转化入毕赤酵母GS115,构建表达工程菌;
C、发酵培养表达工程菌,并进行甲醇诱导表达;
D、发酵产物经亲和层析得到纯化的抗菌肽融合蛋白,抗菌肽融合蛋白经纯化得到抗菌肽产品。
所述的基于对虾抗菌肽制备的水产饲料,其中,所述水产饲料按重量份数计包括:
豆粕30份;
面粉24.625份;
柠檬酸5份;
鱼粉25份;
米糠粕10份;
酵母提取物3份;
60%氯化胆碱0.5份;
肉骨粉8份;
磷酸二氢钙1份;
中药制剂0.05份;
多维多矿预混剂0.5份
氯化钾0.3份
鱼油1份
豆油1份
抗菌肽制剂(CAD)0.025份。
所述的基于对虾抗菌肽制备的水产饲料,其中,所述豆粕的粗蛋白重量百分比为48%。
所述的基于对虾抗菌肽制备的水产饲料,其中,所述中药制剂按重量百分比计由以下成分组成:
金银花15-20%;
五味子6-10%;
丹参20-25%;
仙人掌35-40%;
蜂胶5-15%。
所述的基于对虾抗菌肽制备的水产饲料,其中,所述中药制剂按重量百分比计由以下成分组成:
金银花18%;
五味子10%;
丹参20%;
仙人掌40%;
蜂胶12%。
有益效果:本发明提供一种基于抗菌肽制备的水产饲料,本发明结合特定的抗菌肽制剂制备得到水产饲料,适用于养殖鱼、虾等水生动物,增强水生动物的免疫力,有效预防疾病,提高养殖效益,有效解决动物规模化健康养殖与食品安全与生态安全问题。同时本发明的水产饲料可提高养殖动物增重率、成活率,降低饲料系数,并大幅提高水产品质量,从而提高养殖效益。
具体实施方式
本发明提供一种基于对虾抗菌肽制备的水产饲料,为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确,以下对本发明进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
本发明提供一种基于抗菌肽制备的水产饲料,其中,所述水产饲料按重量份数计包括:
豆粕25-30份;
面粉24.55-30份;
柠檬酸5-8份;
鱼粉25-35份;
米糠粕10-14份;
酵母提取物3-5份;
60%氯化胆碱0.5-1份;
肉骨粉5-10份;
磷酸二氢钙1-2份;
中药制剂0.05-0.1份;
多维多矿预混剂0.5~1.5份
氯化钾0.3~0.5份
鱼油1份
豆油1份
抗菌肽制剂(CAD)0.025-0.15份;
其中,所述抗菌肽制剂效价为20000~40000u/g,其以玉米淀粉为载体。进一步分析得到上述抗菌肽制剂中抗菌肽的氨基酸序列为:KWKLFKKIEKVGQRVRDAVISAGPAVATVAQATALAKN
通过对编码基因序列分析,所述抗菌肽由如下核苷酸序列的基因编码得到:ATGAAATGGAAGTTGTTCAAAAAGATTGAAAAGGTTGGTCAAAGAGTTAGAGACGCTGTCATCTCTGCTGGTCCTGCTGTTGCCACTGTTGCTCAAGCTACTGCCTTGGCTAAGAACTAA
该抗菌肽的制备可通过如下过程实现:
构建表达载体:根据该抗菌肽的编码序列ATGAAATGGAAGTTGTTCAAAAAGATTGAAAAGGTTGGTCAAAGAGTTAGAGACGCTGTCATCTCTGCTGGTCCTGCTGTTGCCACTGTTGCTCAAGCTACTGCCTTGGCTAAGAACTAA与pHIL-S1质粒重组,转化大肠杆菌DH5α,在含有Amp平板上挑选转化子,提取质粒,用EcoRⅠ及XhoⅠ酶切,和PCR扩增,电泳获得141bp的特异区带。再与pPICZα-A质粒重组,得到pACAD5,经酶切,电泳后,确认本抗菌肽基因正确,用锂盐法将pACAD5基因转化于毕赤酵母GS115,用Zeocin平板筛选转化子,获得抗菌肽CAD基因毕赤酵母工程菌株。
发酵培养表达工程菌,并进行甲醇诱导表达。在培养基中37℃、200转/分发酵培养表达工程菌约24小时至OD600达到0.6;加入终浓2%甲醇、继续诱导表达96小时。
抗菌肽的纯化,采用CM-SephroseFF树脂,是阳离子交换树脂,用0.1mol/L乙酸-乙酸铵饱和后,注入抗菌肽发酵液,吸附饱和后,用0.1~1.0mol/L的乙酸-乙酸盐梯度洗脱,流速5mL/min,收集,喷雾干燥即得
另外,所述酵母提取物的加工过程是将以糖蜜为原料发酵的新鲜酵母,每10L计,经过滤、洗脱离心处理后,离心机转速为5000r/min,离心20min,在离心洗脱后的菌体中加入木瓜蛋白酶30000IU、胰蛋白酶100000IU,在反应器中保温反应,温度控制在45℃,反应20小时;随后提高温度到95℃,再保温反应2小时,然后喷雾干燥,喷雾干燥的喷头转速为15000r/min,进口温度为220℃,出口温度为100℃,负压90mpa,即得到酵母提取物,将所得的酵母提取物冷却后包装。
本发明使用的豆粕优选二级豆粕(cp48,粗蛋白质含量≥48%)。
优选实施例中,所述水产饲料按重量份数计包括:
豆粕30份;
面粉14.625份;
次粉10份
柠檬酸5份;
鱼粉25份;
米糠粕10份;
酵母提取物3份;
60%氯化胆碱0.5份;
肉骨粉8份;
磷酸二氢钙1份;
中药制剂0.05份;
多维多矿预混剂0.5份
氯化钾0.3份
鱼油1份
豆油1份
抗菌肽制剂(CAD)0.025份;
其中,所述中药制剂按重量百分比计由以下成分组成:
金银花15-20%;
五味子6-10%;
丹参20-25%;
仙人掌35-40%;
蜂胶5-15%。
优选实施例中,所述中药制剂按重量百分比计由以下成分组成:
金银花18%;
五味子10%;
丹参20%;
仙人掌40%;
蜂胶12%。
本发明饲料的生产过程为:按配方比例取料:按重量百分比计,配方各组分所含重量份数为:豆粕30份、面粉14.625份、次粉10份柠檬酸5份、鱼粉25份、米糠粕10份、酵母提取物3份、60%氯化胆碱0.5份、肉骨粉8份、磷酸二氢钙1份、中药制剂(按中药组方先粉碎混合)0.05份、多维多矿预混剂0.5份、氯化钾0.3份、鱼油1份、豆油1份、抗菌肽制剂(CAD)0.025份混合均匀、熟化制粒、包装。
实施例一:选取规格一致,体质健壮的凡纳滨对虾共128000尾,平均体重为0.8g,随机分配于二个长方形网箱;实验共2个处理组,每个处理组4个重复。正式实验时,每日投喂4次(6:00,12:00,18:00,23:00),投饵量为体重的3%~6%,并根据水温,天气,摄食情况进行调整,各组保持基本一致的投喂量,昼夜充气。饲养试验期间,水温27.0℃~31.0℃,pH8.07~8.51,溶氧6.48~7.47mg/L,饲养时间为6周。
技术效果:
表1抗菌肽对凡纳滨对虾生长性能的影响
对照组 抗菌肽饲料组
初始体重g 0.8±0.1 0.8±0.1
增重率 /% 468.1±21.1a 509.1±15.7b
饲料系数 1.52±0.06a 1.33±0.07b
成活率/% 85.0±4.5 a 97.8±3.6 b
表2抗菌肽饲料对凡纳滨对虾肌血清非特异性免疫指标的影响
对照组 抗菌肽饲料组
碱性磷酸酶U/L 120.57±14.50a 206.86±13.40b
溶菌酶U/ml 64.49±7.69a 92.75±13.10c
SOD U/ml 32.75±1.93a 44.05±2.03c
技术效果:在相同条例下,抗菌肽试验组双对照组显著提高了凡纳滨对虾成活率12.8%(P<0.05);提高了凡纳滨对虾增重率8.75%(P<0.05),降低饲料系数0.19(P<0.05);对血清非特异性免疫指标有提高作用;证明本发明饲料有明显增加成率、增加体重及降低饲料系数的作用。
实施例二:试将验异育银鲫其饲养于16只1.0m×0.5m×0.6m的玻璃鱼缸中,随机分组。每个鱼缸放养30尾异育银鲫,初始体重为16.25±1.33g。试验采用饱食方式,每天投喂4次。试验期间水温为25.0±1.5℃,各组水质一致,实验共计56天。
优选实施例中,所述水产饲料按重量份数计包括:
豆粕40份;
菜籽粕10份
面粉13.425份;
次粉10份
柠檬酸3份;
鱼粉11份;
米糠粕10份;
酵母提取物3份;
60%氯化胆碱0.5份;
磷酸二氢钙1.5份;
中药制剂0.05份;
多维多矿预混剂0.5份
氯化钾0.3份
鱼油1份
豆油1份
抗菌肽制剂(CAD)0.025份;
优选实施例中,所述中药制剂按重量百分比计由以下成分组成:
金银花18%;
五味子10%;
丹参20%;
仙人掌40%;
蜂胶12%。
技术效果:
表3抗菌肽饲料对异育银鲫生长指标与干物质消化率的影响
项 目 对照组 抗菌肽饲料组
初始体重(g) 17.11±0.94 17.33±1.57
终末体重(g) 80.41±4.39 89.64±5.34
增重率 (%) 350.21±13.32a 381.51±21.52c
内脏指数 11.34±1.32 10.84±1.33
肠道指数 2.01±0.27a 1.64±0.21b
肝胰脏指数 2.76±0.40a 2.12±0.23c
干物质表观消化率(%) 66.78±2.62a 74.35±2.02bc
表4抗菌肽饲料对异育银鲫血液白细胞的吞噬活性的影响
项 目 对照组 抗菌肽饲料组
PP(%) 34.31±3.45a 45.94±5.32c
PI 9.23±3.13 11.23±2.78
表5抗菌肽饲料对异育银鲫血清和肝胰脏LSZ活力的影响
项 目 对照组 抗菌肽饲料组
血 清 0.557±0.036a 0.687±0.032b
肝胰脏 0.288±0.016a 0.363±0.067b
表6抗菌肽饲料对异育银鲫血清和肝胰脏SOD活力的影响
项目 对照组 抗菌肽饲料组
血清 72.42±3.81 75.49±3.84
肝胰脏(U/mgprot) 202.97±31.94 237.29±32.74
表7抗菌肽饲料对异育银鲫肠绒毛的高度、宽度和密度的影响
本试验抗菌肽饲料的使用,可以显著提高异育银鲫的增重率,其增重率较对照组提高9.24%;可以提高异育银鲫血液中白细胞的吞噬能力,血清和肝胰脏LSZ、SOD的活力进而改善鱼体的免疫状态,提高了机体免疫水平;可以改善异育银鲫肠道环境,对肠绒毛高度、宽度和密度的正向促进作用,促进了营养物质的消化吸收,提高养殖效益。
本发明提供的基于抗菌肽制备的水产饲料,其为结合特定的抗菌肽制备得到水产饲料,适用于养殖鱼、虾等水生动物,增强水生生物的免疫力,有效预防疾病,解决了养殖过程中使用抗生素带来的食品安全、生态安全、养殖效益等问题。同时本发明的水产饲料具有提高养殖动物的生长水平,提高消化率的功效,能够大幅提高水产品养殖效益,保障食品安全。
应当理解的是,本发明的应用不限于上述的举例,对本领域普通技术人员来说,可以根据上述说明加以改进或变换,所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims (9)

1.一种基于抗菌肽制备的水产饲料,其特征在于,所述水产饲料按重量份数计包括:
豆粕25-30份;
面粉24.55-30份;
次粉10~15份
菜籽粕20~30份
柠檬酸5-8份;
鱼粉15-35份;
米糠粕10-14份;
酵母提取物3-5份;
60%氯化胆碱0.5-1份;
肉骨粉5-10份;
磷酸二氢钙1-2份;
中药制剂0.05-0.1份;
多维多矿预混剂0.5~1.5份
氯化钾0.3~0.5份
鱼油1~2份
豆油1~2份
抗菌肽制剂(CAD)0.025-0.15份。
2.根据权利要求1所述的基于抗菌肽制备的水产饲料,其特征在于,所述抗菌肽制剂效价为20000~40000u/g,其以玉米淀粉为载体。
3.根据权利要求2所述的基于抗菌肽制备的水产饲料,其特征在于,所述抗菌肽制剂中抗菌肽的氨基酸序列为:KWKLFKKIEKVGQRVRDAVISAGPAVATVAQATALAKN。
4.根据权利要求3所述的基于对虾抗菌肽制备的水产饲料,其特征在于,所述抗菌肽由如下核苷酸序列的基因编码得到:
ATGAAATGGAAGTTGTTCAAAAAGATTGAAAAGGTTGGTCAAAGAGTTAGAGACGCTGTCATCTCTGCTGGTCCTGCTGTTGCCACTGTTGCTCAAGCTACTGCCTTGGCTAAGAACTAA。
5.根据权利要求4所述的基于对虾抗菌肽制备的水产饲料,其特征在于,所述抗菌肽的制备过程如下:
A、将该抗菌肽的编码基因与质粒PHIL-S1构建为表达载体;
B、将融合表达载体转化入毕赤酵母GS115,构建表达工程菌;
C、发酵培养表达工程菌,并进行甲醇诱导表达;
D、发酵产物经亲和层析得到纯化的抗菌肽融合蛋白,抗菌肽融合蛋白经纯化得到抗菌肽产品。
6.根据权利要求3所述的基于抗菌肽制备的水产饲料(虾),其特征在于,所述水产饲料按重量份数计包括:
豆粕30份;
面粉14.625份;
次粉10份
柠檬酸5份;
鱼粉25份;
米糠粕10份;
酵母提取物3份;
60%氯化胆碱0.5份;
肉骨粉8份;
磷酸二氢钙1份;
中药制剂0.05份;
多维多矿预混剂0.5份;
氯化钾0.3份;
鱼油1份;
豆油1份;
抗菌肽制剂(CAD)0.025份。
7.根据权利要求3所述的基于抗菌肽制备的水产饲料(鱼),其特征在于,所述水产饲料按重量份数计包括:
豆粕40份;
菜籽粕10份
面粉13.425份;
次粉10份
柠檬酸3份;
鱼粉11份;
米糠粕10份;
酵母提取物3份;
60%氯化胆碱0.5份;
磷酸二氢钙1.5份;
中药制剂0.05份;
多维多矿预混剂0.5份;
氯化钾0.3份;
鱼油1份;
豆油1份;
抗菌肽制剂(CAD)0.025份。
8.根据权利要求6所述的基于抗菌肽制备的水产饲料,其特征在于,所述中药制剂按重量百分比计由以下成分组成:
金银花15-20%;
五味子6-10%;
丹参20-25%;
仙人掌35-40%;
蜂胶5-15%。
9.根据权利要求8所述的基于抗菌肽制备的水产饲料,其特征在于,所述微生态制剂按重量百分比计由以下成分组成:
金银花18%;
五味子10%;
丹参20%;
仙人掌40%;
蜂胶12%。
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