CN103074362B - 一种动物饲料抗菌肽的生产工艺及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种动物饲料抗菌肽的生产工艺及其应用，尤其是抗菌肽家族中Gallinacin系列中的GAL-6的生产工艺及其应用。该工艺利用基因重组技术，将动物源性的GAL-6基因克隆到质粒pGEM-3Zf，并以pGEM-3Zf-GAL-6为模板，用PCR方法获得GAL-6基因，构建表达质粒pPIC9K-GAL-6，并转化毕赤酵母；经多级放大培养至中试生产后，全面优化发酵培养条件，放大到生产化发酵培养，经纯化后得到高纯度、活性好的成品GAL-6蛋白制剂。该蛋白制剂的应用采用动物饮水或颗粒饲料制粒后喷涂的方法以克服高温、高压等对蛋白制品的破坏性。与现有技术相比，本发明具有工艺简单、适合大规模工业化生产等特点。

Description

一种动物饲料抗菌肽的生产工艺及其应用

技术领域

本发明涉及动物饲料添加剂，尤其涉及一种动物饲料抗菌肽的生产工艺及其应用。

背景技术

2005年7月，四川省资阳、内江等地爆发猪链球菌病疫情致人死亡，这再次迫使人们追问：动物滥用抗生素的威胁链到底有多长？由于抗生素饲料添加剂可以提高动物生产效率，在食用动物饲养中被广泛使用。1996年，全世界抗生素饲料添加剂的用量已经占全部饲料添加剂用量的45.8％，抗生素生产总产量的50％左右用于畜牧业。但是，由于持续低水平饲喂抗生素，抗生素饲料添加剂造成的细菌耐药性、畜产品药物残留、过敏中毒反应以及“三致”作用等危害日益严重，越来越受到人们的关注和许多国家的限制。

1986年，瑞典成为第一个不准使用抗生素作为饲料添加剂的国家，全面禁止在畜禽饲料中使用抗生素。1997年，联合国粮农组织(FAO)要求停止或禁止使用抗生素饲料添加剂。1998年12月又提议在10年内淘汰抗生素饲料添加剂。从2000年1月起，丹麦的抗生素只限于按处方用于治疗动物疾病。欧盟委员会决定从2006年1月1日起，在欧盟成员国全面停止使用所有抗生素生长促进剂，包括离子载体类抗生素。

2004年，世界卫生组织(WHO)、FAO和世界动物卫生组织(OIE)联合召开了一次专题讨论会，讨论了非人用抗生素的使用和抗生素的耐药性问题。讨论会的报告建议，在食用动物生产中停止使用也用于治疗人类疾病的抗生素饲料添加剂，直到进行风险评估后认为对人类健康没有影响后才可以使用。报告还建议，进行国家水平的风险评估研究，建立监测制度，对抗生素饲料添加剂使用和食用动物细菌的耐药性情况进行监测。

同时，世界各国对进口动物性食品抗生素残留要求也越来越严格。2002年8月瑞士对我国输入的禽肉产品继诺沙星、氯霉素后又开始检测硝基呋喃，且检测限量标准由原来的5ppb提高到1ppb。到2003年，欧盟共发布了37个有关食品中农兽药最高残留限量(MRL)的指令，制定出了194种农兽药在肉、蛋、乳等190种食品中共28689项MRL标准，其中有3/4以上的MRL标准设定在检测线上。俄罗斯对进口冻肉类检测兽药残留的数量原来仅为10种，现在增加到59种，其中有35种不得检出。最近，日本通过了《食品卫生法》及其修正案，推行“可用农药清单制度”和“一律基准制度”，对农产品使用的农兽药列出详细清单，农产品被检出农兽药残留超标或检出清单中未设定限量的农兽药残留将不允许进口，并将现有的130种农产品、229种农兽药、9000个残留标准增加到135种农产品、724种农兽药、19000个残留标准。同时日本厚生劳动省宣布对我国出口鸡肉产品实施批批检验。

2002年初，欧盟从中国进口的虾、对虾中发现强力抗生素的药物残留，认为对人体健康构成潜在威胁，导致欧洲部分地区陷入食品恐慌。受到进口限制影响的中国动物产品包括：兔肉、禽肉、蜂蜜、软体动物肉类、甲壳类、冻虾、对虾和宠物产品等。2006年3月22日至31日，欧盟残留监控团对我国海南等10个省市的动物源性食品残留监控工作进行考察，其考察结果直接影响我国禽畜产品在海外的声誉及市场份额。

从现状和发展趋势看，在食用动物中禁用、限用抗生素饲料添加剂已经成为世界共识，是大势所趋。

从利弊分析和发达国家的做法看，抗生素饲料添加剂的发展呈现三个趋势，一是使用将日益受到限制，二是积极选择替代品，三是对进口动物性食品抗生素残留检验越来越严格。但禁用抗生素饲料添加剂会导致饲养成本的增加，主要原因：一是由于动物发病率提高加大治疗费用，二是由于饲养管理更加严格会增加管理费用。据美国学者2002年的统计结果，使用抗生素作为饲料添加剂，动物可以平均增重4％～5％；如果停止使用抗生素饲料添加剂，肉鸡的生产过程每年将多花30亿美元。因此，为确保养殖业的健康发展，在动物饲养过程中推行更为安全、有效的替代添加剂刻不容缓。

多年来在畜禽或水产养殖中，之所以对抗生素产生依赖，是人们希望用抗生素来发挥防病保健和提高动物的生产效率。但是在过去的50多年中，人类的防病观念和防病策略存在着严重的片面性或错误，即一味地强调“抑制或杀灭有害微生物”，却忽视了由动物的正常菌群、免疫与营养构成的“微生态三角”的防病保健、营养等重要作用。因此调节肠道中细菌活性的措施是有效的，可用来策略性地改善动物生产性能和维持现代家畜生产体系中的生产效率。

目前，饲料抗生素的替代方式主要有两种，其一为饲喂微生物添加剂即益生素(菌)来改善肠道微生物的比例，抑制有害微生物，促进动物生长；其二为使用饲用酸化剂，改善肠道内容物的酸碱度，抑制有害菌，促进有益菌生长。但总体而言，以上两种措施相对于抗生素的作用仍然有一定的差距。

各种动物在长期的自然进化过程中在体内已建立了平衡的微生物菌群共生生态系统，并建立了一套维持其体内菌群稳态的机制，抗菌肽是这一机制中的主要因子之一在维持肠道正常菌群平衡中起着非常重要的作用，并可能与肠道粘膜免疫有一定的关系。与抗生素相比，抗菌肽的抑菌活性更高、抑菌范围更广，对于动物的生产性能也具有明显的促进作用；更为重要的是，抗菌肽不会产生任何的耐药性；因此，研制和开发出合适的抗菌肽，将是饲料抗生素的最佳替代品。

抗菌肽又称防御素(defensin)，是人体内主要的防御素，包括α抗菌肽和β抗菌肽两种。其中β抗菌肽主要来源于皮肤、呼吸道等上皮组织，目前已发现4种人体β抗菌肽。抗菌肽也是广泛存在于动、植物体内的内源性抗微生物多肽。富含精氨酸，具有稳定的分子结构和众多的生物活性，是生物体天然免疫的重要组成成分。根据抗菌肽氨基酸数量、半胱氨酸位置以及分子内二硫键连接方式不同可分为植物抗菌肽、昆虫抗菌肽、α-抗菌肽、β-抗菌肽和θ-抗菌肽

自从1972年瑞典科学家Boman等首先在果蝇中发现抗菌肽及其免疫功能以来，迄今为止，已在各种生物体内发现300多种内源性抗菌肽。这些多肽可大致分为四类：杀菌肽类、富含pro残基的蛙皮素、富含gly残基的蜂毒素和富含cys残基的抗菌肽。Harwing S 1994年首次发现鸡抗菌肽的存在

抗菌肽具有广谱的抗细菌活性、高效的抗真菌、病毒和原虫的活性，并且不易产生抗药性；高等动物抗菌肽更是具有“种”的特异性，不同动物的肠道内源性抗菌肽能抑制其相应的外源性病原菌，而对动物肠道中共生生态系统中的微生物和动物细胞无杀伤作用。应用各种专一性抗菌肽作为的饲料添加剂，可使动物在收到各种外源性的病原菌入侵或应激时能够保持特异性的生长。(温刘发等，2001)。

许多研究者已试图将抗菌肽应用于畜牧业生产中，用以取代抗生素。温刘发等(2001)通过在断奶仔猪的饲料中用抗菌肽代替抗生素，对仔猪的腹泻、生产性能等作了比较。结果表明，抗菌肽在仔猪断奶应激期间抗腹泻效果不比抗生素差，适量的抗菌肽比抗生素促生长的效果要好，但高剂量的抗菌肽则降低了仔猪的生长。黄永彤等(2004)发现，抗菌肽对肉鸡有促进生长和提高免疫力作用，与中草药抗生素相比，在出栏率、平均体重、饲料效率等方面均无显著性差异，且在出栏前3d停喂，抽检无残留。温刘发等(2001)通过饮水方式给粤黄鸡添加抗菌肽的饲养试验结果表明，抗菌肽可促进小鸡生长和减少排泄物氮含量。陈晓生等(2005)于肉鸭日粮中添加液体的蚕抗菌肽AD-酵母制剂发现，血清代谢激素的活动显著增强，IGF-1浓度升高，营养物质合成加强；甲状腺素T3升高，脂肪、T4降低；尿素氮浓度显著降低，体内氮排出减少。陈晓生等(2005)发现抗菌肽能使肉鸭的产肉率提高，腹脂率、内脏器官比重降低，在适当剂量时，使用效果与金霉素基本一致。陈晓生等(2005)发现，添加抗菌肽制剂2ml/kg能有效提高肉鸭生产性能，尤其是小鸭阶段(1～2周龄)效果显著；2、3ml/kg添加量均可显著提高产肉率。从尿素氮和总蛋白浓度结果看，添加抗菌肽会使机体在蛋白质合成量变化不大的情况下减少机体蛋白质的分解代谢，从而促进生长。王广军等(2005)研究了抗菌蛋白在南美白对虾养殖中的应用效果。结果表明，在饲料中添加抗菌蛋白，无论是在日生长速度、相对增重率、饲料系数、成活率，还是抗病力方面均有显著提高。

也有研究者对抗菌肽和抗生素的抗菌作用进行了比较，均显示了良好的结果。马卫明等(2005)检测了猪小肠抗菌肽对鸡大肠杆菌(O1)C83845株、鸡白痢沙门氏菌C79-13株、大肠杆菌(O2)、大肠杆菌(O78)、猪致病性大肠杆菌自然分离株、鸡致病性大肠杆菌自然分离株、白色葡萄球菌、金黄色葡萄球菌ATCC25923株、猪致病性沙门氏菌自然分离株、绿脓杆菌ATCC27853株、鱼致病性嗜水气单胞菌等11株细菌的作用。结果发现，猪小肠抗菌肽对以上各株细菌均有不同程度的抑制作用，杀菌率59.5％～98.5％不等。汪以真等(2004)将抗菌肽与抗生素在体外抗大肠杆菌(E.coli)K88、大肠杆菌ATCC25922、猪霍乱沙门氏菌ATCC50020、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌ATCC25923的效果进行了研究。结果表明，抗生素抗金黄色葡萄球菌的效果要好于抗菌肽，但对大肠杆菌的效果要差得多。

以上研究均实证了抗菌肽具有很强的抗菌及提高动物生产性能的作用，具有良好的替代饲料中抗生素的潜力。但是，目前国内外研究还限于实验室阶段，很少能应用到生产实际中去。除了研究局限于抗菌肽的提取，数量太少成本太高外，饲料制粒的高温高压高湿也限制了生物蛋白的使用。

Gallinacin是抗菌肽家族一员，简称GAL～，广泛存在于生物界，在所有抗菌肽类物质中其抗菌谱最广。Gallinacin一般由29个～54个氨基酸残基组成，包括6个～8个保守的半胱氨酸，并通过半胱氨酸分子间二硫键使肽环形成反向平行的β-片状结构，有的Gallinacin(如昆虫和植物抗菌肽)还含有一个α-螺旋结构。其除具有一般抗菌肽的抗微生物、抗病毒活性和细胞毒活性外，还具有免疫调节、激素调节，以及对炎症、创伤及神经损伤的修复等作用(Nozdrachev A D等)。根据分子内半胱氨酸的位置和连接方式、前体性质及表达位置的差异抗菌肽可分为α-抗菌肽、β-抗菌肽、θ-抗菌肽、昆虫抗菌肽和植物抗菌肽5种类型。

在禽类中发现的抗菌肽均为β-抗菌肽。在鸵鸟的异嗜性白细胞中分别纯化得到β-抗菌肽Osp-1～4(Sugiarto H等)。企鹅的β-抗菌肽Sphe-1和Sphe-2存在于企鹅的胃内，其浓度在食物储存期比消化期明显增高。所以企鹅在食物缺乏期其胃内容物可保存至少两周不变质。这表明Sphe-1和Sphe-2在企鹅胃内容物中起到抗微生物作用。鸡的β-Gallinacin几乎是无处不在的，它广泛分布于肝脏、气管、肺脏、肾脏、睾丸、卵巢、血管、输卵管、子宫、脑、胸腺、法氏囊、肌肉、皮肤、骨髓、心脏等器官的组织细胞中。Gal 1、Gal 2在骨髓和肺脏里表达，Gal 3最先在骨髓、舌、气管和法氏囊中表达，Gal 4～7也能在骨髓中表达，Gal 5可以在舌、气管、肺脏、脑中很少量地表达。与此相反，Gal8～13不能在骨髓中表达，但可以在肝脏、肾脏、睾丸、卵巢及雄性和雌性的生殖系统表达。也就是说，鸡的β-抗菌肽基因可以分为两类，即能够在骨髓和呼吸系统高效表达的Gal 1～7和能在肝脏和泌尿生殖系统表达的Gal 8～13。

禽GAL-1，GAL-2，GAL-3，GAL-6，GAL-8，GAL-9蛋白作为一种内源性抗菌肽，具有广谱抗菌功能。具有很强的抗细菌能力，对真菌、病毒及癌细胞也有一定的抑杀作用。其热稳定性好、水溶性好、抗菌机制独特、对动物正常细胞无害，具有成为优良饲料添加剂的潜质。应用无毒无公害的新型抗菌肽代替抗生素作饲料添加剂，已成为当前国内外饲料学科的一项研究重点。

发明内容

本发明的目的就是为了提供一种工艺简单、适合大规模工业化生产的动物饲料抗菌肽的生产工艺及其应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

一种动物饲料抗菌肽的生产工艺，是利用基因重组技术，将动物源性的GAL-6基因克隆到质粒pGEM-3Zf，并以pGEM-3Zf-GAL-6为模板，用PCR方法获得GAL-6基因，构建表达质粒pPIC9K-GAL-6并转化毕赤酵母；经多级放大培养至中试生产后，全面优化发酵培养条件，放大到生产化发酵培养，经提取纯化得到高纯度、高活性成品GAL-6蛋白制剂。

上述动物饲料抗菌肽的生产工艺，包括以下步骤：

1).毕赤酵母pPIC9K-GAL-6表达质粒的构建：

将动物源性的GAL-6基因克隆到质粒pGEM-3Zf，并以pGEM-3Zf-GAL-6为模板，用上、下游引物扩增GAL-6基因；反应条件是：94℃变性3分钟；然后94℃变性40s，40℃退火40s，72℃延伸60s，进行5～30个循环；然后94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸60s，进行20～40个循环；最后72℃延伸5分钟，4℃保温；PCR产物通过EcoRI和NotI酶切位点与质粒pPIC9K连接重组，转化感受态大肠杆菌；挑阳性克隆抽提质粒后进行EcoRI和NotI双酶切鉴定，经PCR扩增得到基因DNA片段长502bp，电泳分析结果显示在400bp～600bp处有特异性条带，与预测片段长度一致，重组质粒酶切鉴定片段长度与理论预测一致，核苷酸序列分析结果完全正确，并测定DNA序列；重组质粒命名为pPIC9K-GAL-6；

2).电转化毕赤酵母及筛选多拷贝阳性克隆：

参照Invitrogen公司Multi-Copy Pichia Expression Kit说明书操作；用Sal I酶切重组质粒pPIC9K-GAL-6，使其完全线性化，经酚/氯仿抽提、乙醇沉淀纯化后电转化感受态毕赤酵母GS；电击参数为：电压1500V，电容25μF，电阻200Ω；涂布MD平板，30℃静置培养48h；挑单克隆菌落接种至96孔细胞培养板，经同步化后分别接种至含0、1.0、2.0、4.0g/LG418的YPD平板上，30℃静置培养至长出单克隆菌落；

3).PCR法鉴定：

在高浓度G418-YPD平板上挑单克隆至20μL0.25％SDS溶液中，混匀后90℃加热3min，离心后取1μL上清作模板，用上游引物和下游引物进行PCR反应；反应体系50μL，含1％Triton X-100；反应条件：95℃变性5min；95℃变性60s，55℃退火60s，72℃延伸60s，进行20～50个循环；最后72℃延伸3min，4℃保温；根据PCR结果酶切后电泳鉴定重组质粒；

4).实验室培养：

在高浓度G418-YPD平板上挑单克隆于YPD培养液中，30℃，250r/min振荡培养12h，得到一级种子液；将一级种子液接种至1200mL BMGY培养液中，振荡培养16h，至OD600＝10～12，得到二级种子液；将二级种子液接种至20L BMMY培养液中，用28％氨水调节pH至5.0；发酵培养条件为：温度30℃，搅拌速度200r/min，溶氧度35％，自动补加氨水维持pH5.1；继续培养18h至OD600＝100～120，待溶氧度快速上升，培养液中甘油耗尽时开始补加50％甘油溶液，速度80mL/h，时间2～3h，至OD600＝150～160时停止补加甘油，待其完全耗尽时立即开始补加甲醇进行诱导表达，速度30mL/h，时间30h；诱导表达结束后，发酵液放入冷却罐，按放罐发酵液质量3％的量加入固体NaCl，搅拌至盐溶解，待温度降到10℃以下，14000r/min离心收集菌体，按照菌体6倍质量加入10℃以下蒸馏水，70r/min搅拌10min，完成细胞破碎，14000r/min离心收集上清液；

5).重组GAL-6的纯化和鉴定：

将步骤4)中收集的上清液超滤浓缩5～15倍，进行Sephadex G50凝胶过滤层析，上样结束后用平衡液平衡至基线，平衡液用20mmol/L Na₂HPO₄，pH＝7.0，流速5mL/min；然后用洗脱液线性梯度洗脱，洗脱液为20mmol/L Na₂HPO₄和1mol/LNaCl，pH＝7.0；对应NaCl梯度0.1～0.2mol/L；收集目的蛋白洗脱峰组份，然后进行阴离子交换层析，层析柱Q Sepharose FF预先用20倍柱体积平衡液预平衡，平衡液为20mmol/L Na₂HPO₄，pH＝7.0，流速5mLPmin；上样结束后用平衡液冲洗至基线，再洗脱液线性梯度洗脱，洗脱液为20mmol/L Na₂HPO₄和1mol/LNaCl，pH＝7.0，对应NaCl梯度0.1～0.2mol/L；收集洗脱峰组份，用Bradford法进行蛋白定量，做15％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，扫描分析纯度，纯度应大于95％；做Western Blot进一步验证纯化的目的蛋白；

6).生产化大规模培养工艺：

将步骤4)中获得的一级种子液接种至50L种子罐，BMGY培养液，转速250r/min培养16h，至OD600＝10～12，移种至1000L反应器中进行生产化大规模培养；采用BMMY发酵培养液，用28％氨水调节pH至5.0；发酵培养条件为：温度30℃，搅拌速度600r/min，溶氧度35％，自动补加氨水维持pH＝5.1；继续培养18h至OD600＝100～120，待溶氧度快速上升，培养液中甘油耗尽时开始补加50％甘油溶液，速度80mL/h，时间2～3h，进行高密度培养，至OD600＝150～160时停止补加甘油，待其完全耗尽时立即开始补加甲醇诱导产酶，速度30mL/h，时间30h，发酵液放入冷却罐，依放罐发酵液质量3％的量加入固体NaCl，搅拌至盐溶解，待温度降到10℃以下，14000r/min离心收集菌体，按照菌体6倍质量加入10℃以下蒸馏水，70r/min搅拌10min，完成细胞破碎，14000r/min离心收集上清液，纯化后即得到GAL-6蛋白制剂产品。

步骤3)中所述的上游引物的序列为5′AGGGAGACAGAAGGCAGCGGTGAT3′(5′AoxI Primer)；下游引物的序列为5′TCCCAGGAGAAGCCAGTGAGTCAT3′(3′AoxI Primer)。

上述动物饲料抗菌肽的应用，是在给动物饮水时，按每升水加5-10毫克抗菌肽GAL-6的量将抗菌肽GAL-6混合在动物饮水中，让动物饮用，以提高动物免疫力，取代动物饲料抗生素，减少动物疾病。

上述动物饲料抗菌肽的应用，是在给动物饲喂颗粒饲料时，按每公斤饲料添加5-10毫克抗菌肽GAL-6的量，采用制粒过程的后喷方法将抗菌肽溶于适量水中喷晒在制粒冷却后的动物饲料表面，饲喂动物，以提高动物免疫力，取代或减少动物饲料抗生素，减少动物疾病。

上述动物饲料抗菌肽的应用，是在给动物饲喂粉状饲料时，按每公斤饲料添加5-10毫克抗菌肽GAL-6的量，将其直接混合在动物饲料里，饲喂动物，以提高动物免疫力，取代或减少动物饲料抗生素，减少动物疾病。

Gal-6蛋白是一种在鸡的食道、嗉囊中高度表达，在腺胃中适度表达中的β-抗菌肽——能够有效抑制空肠弯杆菌(Campylobacter jejuni)、鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌等多种主要食物源性病原体；抗真菌的效果也很显著，杀菌曲线显示Gal-6在6分钟内能够降低C型产气荚膜梭菌(C.perfringens)的存活率(A.van Dijk等)。对该蛋白的研究首次证明了β-抗菌肽能够在食道中高表达，并有抵抗食物源性病原体的强力抑菌活性。

在现代畜禽饲养业日益呈集约化的今天，病原传播和入侵及各种应激作用日益强化，使得畜禽肠道表达量有限的抗菌肽难以对动物自身的保健起很大作用。寻找各种饲养动物内源性抗菌肽，并以现代生物技术方法工业化生产这些在抗病原菌上具有动物“种”专一性或特异性的产品，将是“后抗生素时代”的一条出路。而大规模生产Gal-蛋白无疑则是目前所知的替代抗生素最佳方案，其对于整个饲料行业乃至人类的身体健康和安全意义深远。

与现有技术相比，本发明具有以下特点：

1.首次在毕赤酵母中进行GAL-6基因的高效表达，经纯化后的目的蛋白产量高于酿酒酵母几十倍。

2.首创全面优化的动物饲料抗菌肽的大规模生产化发酵培养和纯化工艺。

3.拥有自主知识产权的饲料表面喷涂技术，使得该产品能通过颗粒饲料的高温、高压高湿制粒过程而不遭破坏。

4.本发明将提供一种高效抗生素替代物-动物饲料抗菌肽的生产工艺和使用方法。

附图说明

图1为本发明的工艺流程图；

图2为pPIC9K-GAL-6的DNA序列；

图3为Gal-6基因的RT-PCR结果；

图4为Gal-6基因的2％琼脂糖凝胶电泳验证结果；

图5为PCR筛选阳性菌株。

具体实施方式

下面结合附图及具体实施例，对本发明作进一步说明。

实施例

本发明的工艺流程图如图1所示，具体生产工艺的技术路线如下：

1).毕赤酵母pPIC9K-GAL-6表达质粒的构建：将从鸡组织细胞或购买获得的动物源性的GAL-6基因克隆到质粒pGEM-3Zf，并以克隆质粒pGEM-3Zf-GAL-6为模板，用上、下游引物扩增GAL-6基因。反应条件是94℃变性3分钟；然后94℃变性40s，40℃退火40s，72℃延伸60s，进行10个循环；然后94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸60s，进行30个循环；最后72℃延伸5分钟，4℃保温。PCR产物通过EcoRI和NotI酶切位点与质粒pPIC9K连接重组，转化感受态大肠杆菌。挑阳性克隆抽提质粒后进行EcoRI和NotI双酶切鉴定，经PCR扩增得到基因DNA片段长502bp，电泳分析结果显示在400bp～600bp处有特异性条带，与预测片段长度一致，重组质粒酶切鉴定片段长度与理论预测一致核苷酸序列分析结果完全正确，并测定DNA序列。重组质粒命名为pPIC9K-GAL-6。

Forward Primer Tm：60Bases：5′AGGGAGACAGAAGGCAGCGGTGAT 3′

Reverse Primer Tm：57Bases：5′TCCCAGGAGAAGCCAGTGAGTCAT 3′

2).电转化毕赤酵母及筛选多拷贝阳性克隆：参照Invitrogen公司Multi-CopyPichia Expression Kit说明书操作。用Sal I酶切重组质粒pPIC9K-GAL-6，使其完全线性化，经酚/氯仿抽提、乙醇沉淀纯化后电转化感受态毕赤酵母GS，电击参数：电压1500V，电容25μF，电阻200Ω，涂布MD平板，30℃静置培养48h。挑单克隆菌落接种至96孔细胞培养板，经同步化后分别接种至含0、1.0、2.0、4.0g/LG418的YPD平板上，30℃静置培养至长出单克隆菌落。

3).PCR法鉴定：在高浓度G418-YPD平板上挑单克隆(约107个细胞)至20μL0.25％SDS溶液中，混匀后90℃加热3min，离心后取1μL上清作模板，用上、下游引物进行PCR反应。反应体系50μL，含1％Triton X-100。反应条件：95℃变性5min；95℃变性60s，55℃退火60s，72℃延伸60s，进行35个循环；最后72℃延伸3min，4℃保温。根据PCR结果酶切后电泳鉴定重组质粒。

上游引物：5′AGGGAGACAGAAGGCAGCGGTGAT 3′(5′AoxI Primer)

下游引物：5′TCCCAGGAGAAGCCAGTGAGTCAT 3′(3′AoxI Primer)

4).实验室培养：在高浓度G418-YPD平板上挑单克隆于YPD培养液中，30℃，250r/min振荡培养12h，此为一级种子液。将一级种子液接种至1200mLBMGY培养液中，振荡培养16h，至OD600＝10～12，此为二级种子液。将二级种子液接种至20LBMMY培养液中，用28％氨水调节pH至5.0。设置发酵培养条件：温度30℃，搅拌速度600r/min，溶氧度35％，自动补加氨水维持pH5.1。继续培养18h至OD600＝100～120，待溶氧度快速上升，培养液中甘油耗尽时开始补加50％甘油溶液，速度80mL/h，时间2～3h，至OD600＝150～160时停止补加甘油，待其完全耗尽时立即开始补加甲醇，速度30mL/h，时间30h。发酵液放入冷却罐，依放罐发酵液质量3％的量加入固体NaCl，搅拌至盐溶解，待温度降到10℃以下，14000r/min离心收集菌体，按照菌体6倍质量加入10℃以下蒸馏水，70r/min搅拌10min，完成细胞破碎，14000r/min离心收集上清液；待纯化。

5).重组GAL-6的纯化和鉴定：将4)中细胞破碎后离心所收集上清液超滤浓缩10倍，进行Sephadex G50凝胶过滤层析，平衡液用20mmol/L Na₂HPO₄pH7.0，流速5mL/min，洗脱液(20mmol/L Na₂HPO₄pH7.0，1mol/L NaCl)线性梯度洗脱，对应NaCl梯度0.1～0.2mol/L；收集目的蛋白洗脱峰组份，然后进行阴离子交换层析，层析柱Q Sepharose FF预先用20倍柱体积平衡液(20mmol/L Na₂HPO₄pH7.0)预平衡，流速5mL/min，上样结束后用平衡液冲洗至基线，洗脱液(20mmol/LNa₂HPO₄ pH7.0，1mol/L NaCl)线性梯度洗脱，对应NaCl梯度0.1～0.2mol/L。收集洗脱峰组份，用Bradford法进行蛋白定量，做15％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，扫描分析纯度，纯度大于95％。做Western Blot进一步验证纯化的目的蛋白。

6).生产化大规模培养工艺：将步骤4)中获得的一级种子液接种至50L种子罐，BMGY培养液，转速250r/min培养16h，至OD600＝10～12，移种至1000L反应器中进行培养，采用BMMY发酵培养液，用28％氨水调节pH至5.0。设置发酵培养条件：温度30℃，搅拌速度200r/min，溶氧度35％，自动补加氨水维持pH5.1。继续培养18h至OD600＝100～120，待溶氧度快速上升，培养液中甘油耗尽时开始补加50％甘油溶液，速度80mL/h，时间2～3h，进行高密度培养，至OD600＝150～160时停止补加甘油，待其完全耗尽时立即开始补加甲醇，诱导产酶，速度30mL/h，时间30h，发酵液放入冷却罐，依放罐发酵液质量3％的量加入固体NaCl，搅拌至盐溶解，待温度降到10℃以下，14000r/min离心收集菌体，按照菌体6倍质量加入10℃以下蒸馏水，70r/min搅拌10min，完成细胞破碎，14000r/min离心收集上清液；将离心所收集上清液超滤浓缩10倍，进行SephadexG50凝胶过滤层析，平衡液用20mmol/L Na2HPO4pH7.0，流速5mL/min，洗脱液(20mmol/L Na₂HPO₄ pH7.0，1mol/L NaCl)线性梯度洗脱，对应NaCl梯度0.1～0.2mol/L；收集目的蛋白洗脱峰组份，然后进行阴离子交换层析，层析柱Q SepharoseFF预先用20倍柱体积平衡液(20mmol/L Na2HPO4pH7.0)预平衡，流速5mL/min，上样结束后用平衡液冲洗至基线，洗脱液(20mmol/L Na₂HPO₄pH7.0，1mol/L NaCl)线性梯度洗脱，对应NaCl梯度0.1～0.2mol/L。收集洗脱峰组份，用Bradford法对洗脱液进行蛋白定量检测，蛋白含量大于3000mg/l，平皿琼脂糖孔穴扩散法进行活性检测，活性大于2000单位/mgGal-6，做15％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，扫描分析纯度大于95％。洗脱液进行0.22微米微孔过滤除菌，紫外线照射10min，4℃低温保藏。

Gal基因重组构建的示意验证图：

1、Gal-1基因RT-PCR产物经过2％琼脂糖凝胶电泳验证，在140bp左右有条带。与GAL-1基因的成熟肽片断大小相同，如图3所示。

2、Gal-1基因片段的回收、验证及与克隆载体的连接。

在暗室将目的条带切下，用胶回收试剂盒回收目的条带，2％琼脂糖凝胶电泳验证结果如图4所示。

3、筛选阳性菌株

挑取平板上的白色单菌落，接种培养基12小时。然后挑取单菌落做菌落PCR验证。以验证筛选的阳性菌株，结果如图5所示。

抗菌肽的动物试验应用及效果示例：

1、抗菌肽对艾维茵肉仔鸡生产性能的作用示例

①材料与方法

选取6000只健康1日龄艾维茵肉仔鸡，随机分成2组，每组3个重复，每个重复1000只鸡。试验期为42天。试验基础日粮为玉米-豆粕型，在此基础上加入5mg/kg的抗菌肽和黄霉素。其他条件两组相同。

②结果如表1所示

表1抗菌肽和黄霉素对肉仔鸡生产性能影响的对比

由表1可见，整个试验期，抗菌肽组肉鸡成活率都高于黄霉素组，且差异显著；在饲养前期及整个试验期，抗菌肽添加组肉鸡都表现出良好的生长趋势，显著高于黄霉素组；抗菌肽添加组的前期及全期料比均显著低于黄霉素组。

试验结果表明，在肉仔鸡日粮中添加5mg/kg抗菌肽能有效提高肉鸡成活率，改善饲料消化吸收，提高肉鸡的生产性能。由于抗生素的过度使用，细菌耐药性正在惊人的增强。试验观察到，与抗生素相比，抗菌肽能提高肉鸡成活率及生产性能，很少有耐药性产生。从经济效益上看，抗菌肽添加剂量小、作用快、成本低，可作为抗生素替代物，广泛应用于饲料行业。

2、抗菌肽对断奶仔猪生产性能的作用示例：

①材料与方法

选取4周龄断奶杜洛克仔猪，随机分成3组，对照组23头仔猪，抗生素组22头、抗菌肽组20头。试验期为30天。试验基础日粮为玉米-豆粕型，在此基础上加入5mg/kg的抗菌肽和抗生素。其他条件各组均相同。

②结果如表2所示。

表2抗菌肽对断奶仔猪生产性能的作用

由表2可见，对照组的腹泻率明显高于抗生素组和抗菌肽组，抗菌肽组的抗腹泻效果优于抗生素组。抗菌肽组的日增重和料肉比显著优于对照组和抗生素组。试验结果表明，抗菌肽具有较好的抗断奶仔猪腹泻的功能，并且对于仔猪的生长有较好的促进作用。

Claims (1)

1.一种动物饲料抗菌肽的生产工艺，其特征在于，包括以下步骤：

1).毕赤酵母pPIC9K-GAL-6表达质粒的构建：

将从鸡组织细胞获得的GAL-6基因克隆到质粒pGEM-3Zf，并以pGEM-3Zf-GAL-6为模板，用上、下游引物扩增GAL-6基因；反应条件是：94℃变性3分钟；然后94℃变性40s，40℃退火40s，72℃延伸60s，进行5～30个循环；然后94℃变性40s，55℃退火40s，72℃延伸60s，进行20～40个循环；最后72℃延伸5分钟，4℃保温；PCR产物通过EcoRI和NotI酶切位点与质粒pPIC9K连接重组，转化感受态大肠杆菌；重组质粒命名为pPIC9K-GAL-6；

2).电转化毕赤酵母及筛选多拷贝阳性克隆：

用Sal I酶切重组质粒pPIC9K-GAL-6，使其完全线性化，经酚/氯仿抽提、乙醇沉淀纯化后电转化感受态毕赤酵母GS；电击参数为：电压1500V，电容25μF，电阻200Ω；涂布MD平板，30℃静置培养48h；挑单克隆菌落接种至96孔细胞培养板，经同步化后分别接种至含0、1.0、2.0、4.0g/L G418的YPD平板上，30℃静置培养至长出单克隆菌落；

3).PCR法鉴定：

在高浓度G418-YPD平板上挑单克隆至20μL0.25％SDS溶液中，混匀后90℃加热3min，离心后取1μL上清作模板，用上游引物和下游引物进行PCR反应；反应体系50μL，含1％Triton X-100；反应条件：95℃变性5min；95℃变性60s，55℃退火60s，72℃延伸60s，进行20～50个循环；最后72℃延伸3min，4℃保温；根据PCR结果酶切后电泳鉴定重组质粒；

4).实验室培养：

在高浓度G418-YPD平板上挑单克隆于YPD培养液中，30℃，250r/min振荡培养12h，得到一级种子液；将一级种子液接种至1200mL BMGY培养液中，振荡培养16h，至OD₆₀₀＝10～12，得到二级种子液；将二级种子液接种至20L BMMY培养液中，用28％氨水调节pH至5.0；发酵培养条件为：温度30℃，搅拌速度200r/min，溶氧度35％，自动补加氨水维持pH5.1；继续培养18h至OD₆₀₀＝100～120，待溶氧度快速上升，培养液中甘油耗尽时开始补加50％甘油溶液，速度80mL/h，时间2～3h，至OD₆₀₀＝150～160时停止补加甘油，待其完全耗尽时立即开始补加甲醇进行诱导表达，速度30mL/h，时间30h；诱导表达结束后，发酵液放入冷却罐，按放罐发酵液质量3％的量加入固体NaCl，搅拌至NaCl溶解，待温度降到10℃以下，14000r/min离心收集菌体，按照菌体6倍质量加入10℃以下蒸馏水，70r/min搅拌10min，完成细胞破碎，14000r/min离心收集上清液；

5).重组GAL-6的纯化和鉴定：

将步骤4)中收集的上清液超滤浓缩5～15倍，进行Sephadex G50凝胶过滤层析，上样结束后用平衡液平衡至基线，平衡液用20mmol/L Na₂HPO₄，pH＝7.0，流速5mL/min；然后用洗脱液线性梯度洗脱，洗脱液为20mmol/L Na₂HPO₄和1mol/L NaCl，pH＝7.0；对应NaCl梯度0.1～0.2mol/L；收集目的蛋白洗脱峰组份，然后进行阴离子交换层析，层析柱Q Sepharose FF预先用20倍柱体积平衡液预平衡，平衡液为20mmol/L Na₂HPO₄，pH＝7.0，流速5mL/min；上样结束后用平衡液冲洗至基线，再洗脱液线性梯度洗脱，洗脱液为20mmol/L Na₂HPO₄和1mol/L NaCl，pH＝7.0，对应NaCl梯度0.1～0.2mol/L；收集洗脱峰组份，用Bradford法进行蛋白定量，做15％SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，扫描分析纯度，纯度大于95％；做Western Blot进一步验证纯化的目的蛋白；

6).生产化大规模培养工艺：

将步骤4)中获得的一级种子液接种至50L种子罐，BMGY培养液，转速250r/min培养16h，至OD₆₀₀＝10～12，移种至1000L反应器中进行生产化大规模培养；采用BMMY发酵培养液，用28％氨水调节pH至5.0；发酵培养条件为：温度30℃，搅拌速度200r/min，溶氧度35％，自动补加氨水维持pH＝5.1；继续培养18h至OD₆₀₀＝100～120，待溶氧度快速上升，培养液中甘油耗尽时开始补加50％甘油溶液，速度80mL/h，时间2～3h，进行高密度培养，至OD₆₀₀＝150～160时停止补加甘油，待其完全耗尽时立即开始补加甲醇诱导产酶，速度30mL/h，时间30h，发酵液放入冷却罐，依放罐发酵液质量3％的量加入固体NaCl，搅拌至NaCl溶解，待温度降到10℃以下，14000r/min离心收集菌体，按照菌体6倍质量加入10℃以下蒸馏水，70r/min搅拌10min，完成细胞破碎，14000r/min离心收集上清液，纯化后即得到GAL-6蛋白制剂产品。