CN111202169B

CN111202169B - 一种包含牦牛β-防御素4的非蛋白氮饲料添加剂

Info

Publication number: CN111202169B
Application number: CN202010165475.1A
Authority: CN
Inventors: 王利; 郑姚
Original assignee: Southwest Minzu University
Current assignee: Southwest Minzu University
Priority date: 2020-03-11
Filing date: 2020-03-11
Publication date: 2023-06-06
Anticipated expiration: 2040-03-11
Also published as: CN111202169A

Abstract

本发明属于饲料添加剂领域，具体涉及一种包含牦牛β‑防御素4的非蛋白氮饲料添加剂。具体技术方案为：非蛋白氮饲料添加剂的组分包括：预糊化淀粉、非蛋白氮、抗菌肽。抗菌肽的氨基酸序列为：MRLHHLLLALLFLVLSAGSGFTQVVRNPQSCRWNMGVCIPFLCRVGMRQIGTCFGPRVPCCRRW。本发明首次从牦牛体内获得了抗菌肽：β‑防御素4，并利用该抗菌肽制备了一种牦牛专用的非蛋白氮饲料添加剂，节省了蛋白饲料，饲用效果良好，有效避免了直接饲喂尿素导致的中毒问题；并提高了牦牛的免疫能力。

Description

一种包含牦牛β-防御素4的非蛋白氮饲料添加剂

技术领域

本发明属于饲料添加剂领域，具体涉及一种包含牦牛β-防御素4的非蛋白氮饲料添加剂。

背景技术

牦牛作为特殊的高原养殖动物，是当地居民的主要收入来源之一。但高原地区的可饲资源短缺，粮食产量少，难以满足当地畜牧业对饲料、尤其是对蛋白质饲料的需求。

牦牛属于反刍动物，其瘤胃等特殊生理结构中的微生物可以将非蛋白氮转化为菌体蛋白供宿主使用。非蛋白氮(例如尿素)的来源广泛、成本低廉，且不依赖于土地生产，具有巨大的生产潜力，可有效解决高原地区资源短缺的问题。

但如果直接将尿素作为非蛋白氮饲料添加剂进行饲喂，容易在牦牛体内过溶解，导致氨浓度增加，进而使牦牛吸收过多的氨，出现氨中毒的现象，反而得不偿失。而这一问题也成为制约尿素在牦牛饲料添加剂应用的重要因素。

β-防御素4(BNBD4)是内源性抗菌肽家族的一员，具有广谱抗微生物和细胞毒活性，对机体的免疫功能至关重要。目前对β-防御素4的研究大部分还停留在理论研究阶段，偶有应用，也是直接作为饲料添加剂进行饲喂。尚未有利用β-防御素4本身的特性，将β-防御素4与非蛋白氮联合应用的研究。

发明内容

本发明的目的是提供一种包含牦牛β-防御素4的非蛋白氮饲料添加剂。

为实现上述发明目的，本发明所采用的技术方案是：一种抗菌肽，所述抗菌肽的氨基酸序列为：MRLHHLLLALLFLVLSAGSGFTQVVRNPQSCRWNMGVCIPFLCRVGMRQIGTCFGPRVPCCRRW。

相应的，所述抗菌肽在饲料或饲料添加剂中的应用。

相应的，利用权利要求1所述抗菌肽制备的饲料添加剂，组分包括：预糊化淀粉、非蛋白氮、所述抗菌肽。

优选的，所述非蛋白氮为尿素。

优选的，所述非蛋白氮先经预糊化淀粉包被处理后，再与所述抗菌肽混合。

相应的，所述饲料添加剂的制备方法，包括如下步骤：

(1)将预糊化淀粉与非蛋白氮混匀，进行膨化处理，冷却后获得膨化物料；

(2)将预糊化淀粉与水混匀，制备第一淀粉混合液，将所述膨化物料加入第一淀粉混合液中，充分混匀，冷却、干燥，获得包被物料；

(3)将预糊化淀粉、抗菌肽充分混合后，再加入纯水，充分混匀，获得第二淀粉混合液；

(4)将所述包被物料加入第二淀粉混合液中，充分混匀，低温干燥、冷却即可。

优选的，步骤(1)中，预糊化淀粉与非蛋白氮的质量比为1～2:1。

优选的，步骤(2)中，每100mL第一淀粉混合液中添加80～120g膨化物料。

优选的，步骤(3)中，按质量比，预糊化淀粉：β-防御素4＝1.5～2:1。

优选的，步骤(4)中，每100mL第二淀粉混合液中添加80～100g包被物料。

本发明具有以下有益效果：本发明首次从牦牛体内获得了β-防御素4，并验证其具有良好的抑菌效果。并利用该β-防御素4制备了一种牦牛专用的非蛋白氮饲料添加剂，将β-防御素4与非蛋白氮联合应用，节省了蛋白饲料，饲用效果良好，有效避免了直接饲喂尿素导致的中毒问题；并提高了牦牛的免疫能力。

附图说明

图1为β-防御素4PCR扩增产物示意图；

图2为β-防御素4的三级结构预测示意图；

图3为不同浓度梯度IPTG诱导生成β-防御素4的SDS-PAGE检测结果示意图；

图4为β-防御素4纯化结果示意图；

图5为未进行基因改造的大肠杆菌生长情况示意图；

图6为转化后的大肠杆菌生长情况示意图。

具体实施方式

实施例一：牦牛β-防御素4基因的提取和鉴定

1、随机选取三头健康的四川阿坝州红原麦洼牦牛，2.5～3岁，屠宰后使用无菌工具采取其心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织样品，于DEPC水中除去血渍，于液氮中进行保存。参考Genebank中黄牛BNBD4基因序列(NM_174775.1)设计PCR引物，引物信息如下：F:TCTTCTCCAGCATCAGCC；R:CTGGTTACGCCTCAGTCT。采用RNAiso Plus试剂对心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏组织进行充分研磨，然后根据总RNA提取试剂盒说明书提取组织总RNA。

根据反转录试剂盒说明书合成cDNA。以麦洼牦牛肺组织cDNA为模板，进行PCR扩增反应。反应体系为25μL，PCR反应程序为：98℃、2min；98℃、2min；55.6℃、10s；72℃、10s,共35个循环；72℃、2min；4℃保存。PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，得到250bp左右的扩增片段，结果如图1所示。其中，M代表DNA相对分子质量标准，通道1、2代表β-防御素4扩增产物。

2、用NCBI的ORF Finder程序(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)对开放阅读框进行分析，并用DNAMAN将麦洼牦牛β-防御素4基因核苷酸序列翻译成氨基酸序列。β-防御素4基因的开放阅读框为195bp，可编码64个氨基酸。

所述氨基酸序列如下：

MRLHHLLLALLFLVLSAGSGFTQVVRNPQSCRWNMGVCIPFLCRVGMRQIGTCFGPRVPCCRRW。

3、蛋白质基本理化性质分析。利用在线工具ProtParam预测牦牛β-防御素4的理化性质。结果表明，β-防御素4蛋白的分子量为7.3kDa，分子式为C₃₂₅H₅₂₁N₉₉O₇₅S₉，总原子个数为1029。理论等电点为11.17，碱性氨基酸残基(Arg+Lys)总数为8，该蛋白为碱性蛋白质。

4、蛋白质的二级、三级结构预测。采用在线软件SOPMA对BNBD4进行二级结构的预测结果显示，在BNBD4二级结构中无规则卷曲占46.8％，β-折叠占31.25％，α-螺旋占21.9％。利用SWISS-MODEL在线分析工具对BNBD4的三级结构进行预测，结果显示，BNBD4结构域区构成主要为无规则卷曲和β折叠、α螺旋结构，具体如图2所示。

实施例二：牦牛β-防御素4的原核表达与纯化

需要说明的是，牦牛β-防御素4对大肠杆菌具有毒害作用，会抑制其生长。实施例二、三使用大肠杆菌作为表达菌种，主要是考虑到原核表达系统技术成熟、操作简单、耗时较短，时间与经济成本相对较低。为了减少牦牛β-防御素4对大肠杆菌生长的抑制作用，实施例二、三均在大肠杆菌的生长对数期时加入诱导剂。另外，实施例三中，发明人利用牦牛β-防御素4对大肠杆菌的毒害作用，提出了一种新的检验牦牛β-防御素4作用的方法：直接将在大肠杆菌内表达牦牛β-防御素4，当表达量达到一定浓度时，大肠杆菌无法生存。这种方法方便快捷，检验效果明显直观，且检验完后，因大肠杆菌已经死亡，后续的无害化处理也相对更简单。

1、重组质粒pET-32a-BNBD4在E.coli BL21(DE3)中的诱导表达。

根据大肠杆菌表达系统优化基因序列，构建表达载体。用KpnI和EcoRI对pET-32a(+)载体质粒和目的片段进行双酶切，连接转化到大肠杆菌TOP10当中，挑选阳性克隆子，用酶切进行验证之后，测序鉴定成功后返回重组质粒。全基因合成于北京擎科新业生物技术有限公司完成。使用DEPC H₂O将重组质粒pET32a-BNBD4稀释为4ng/μL的质粒溶液。取2μL质粒溶液化学转化于100μL BL21(DE3)感受态中，获得转化后的菌株。取菌液200μL均匀涂板于LB平板(含50mg/ml Amp)，37℃培养12h。随后挑取单菌落接种于LB液体培养基(含50mg/ml Amp)，37℃、180r/min下摇床培养6～8h。随后将60μl菌液接种至新的6ml LB液体培养基(50mg/ml Amp)中，在180r/min下活化至OD₆₀₀为6.0～8.0，即指数生长期。随后加入不同浓度梯度IPTG诱导(0.5mM、1mM、1.5mM)，在37℃、180r/min下分别诱导6h、16h。诱导结束后，收集2ml菌体沉淀，进行SDS-PAGE检测。结果显示，IPTG各浓度均出现目的蛋白，见图3所示。图3中，“OM”代表未加入IPTG，“0.5M-16”代表加入0.5mM的IPTG诱导16h，以此类推。

2、重组蛋白的纯化。将步骤1获得的含重组质粒大肠杆菌接种于100mL LB液体培养基(含有100μg/mL Amp)中，在37℃、180r/min下培养过夜。次日取培养物按照1：100(体积比)的比例接种于300mL LB液体培养基(含有100μg/mL Amp)中，于37℃、180r/min下培养4h至菌液浑浊(OD₆₀₀＝0.6)。随后加入0.5Mm IPTG诱导表达6h，7830r/min离心30min，收集沉淀。加入10μL PBS(PH＝7.4)重悬，反复冻融5次，7830r/min离心30min，再次收集沉淀。随后加入8M bingding buffer，-20℃放置过夜。随后取出在7830r/min下离心25min，收集上清液，用0.22μm滤膜过滤，按照康为世纪的His标签蛋白纯化试剂盒(包涵体蛋白)说明书对目的蛋白进行纯化，分别使用5倍体积的8M bingding buffer、4M bingding buffer、2Mbingding buffer、1M bingding buffer、0M bingding buffer冲洗杂蛋白并同时进行柱上复性，再使用适量Elution buffer洗脱蛋白，每1mL收集1管，共7mL洗脱蛋白。SDS-PAGE进行检测。结果如图4所示，通道1～7表示收集管1～7，显示第3、4收集管含有重组蛋白。

实施例三：牦牛β-防御素4重组蛋白的体外抗菌效果展示

1、向50mL LB液体培养基中加入1500μL实施例二步骤1获得的含重组质粒的大肠杆菌，在37℃、180r/min下培养过夜。随后加入0.5mM的IPTG诱导表达6h，测定OD₆₀₀，使OD₆₀₀均为1.0，归一化初始浓度。10倍梯度稀释获得5个梯度(10⁸CFU/mL、10⁷CFU/mL、10⁶CFU/mL、10⁵CFU/mL、10⁴CFU/mL)，每梯度取5μL涂布于LB平板(含100μg/mL Amp、0.5mM IPTG)，37℃培养过夜，作为处理组。以含pET32a空载质粒的大肠杆菌在相同条件下进行培养，作为对照组。对照组结果如图5所示，实验组结果如图6所示。从图5、6可以看出，实验组从第2个稀释梯度开始，菌落明显少于对照组，证明重组蛋白β-防御素4对大肠杆菌具有明显的抑菌作用。

2、以金黄色葡萄球菌、大肠杆菌分别作为待测菌，取生长至对数期的菌液50μL/孔，分别接种于LB液体培养基中，在各培养基中分别添加终浓度为：0.5、1、2、4、6、8、16、32、64、128μg/mL的实施例二步骤2获得的重组蛋白，每组设置3个重复，作为处理组。同时以无菌LB液体培养基为空白对照组，以加等量无菌水的LB液体培养基为阴性对照组，以添加100μg/mL Amp(氨苄青霉素)的LB液体培养基为阳性对照组，每组均设置3个重复。于37℃、180r/min下培养过夜，分别测试各组的OD₆₀₀。

结果证明，0.5μg/mL的重组蛋白β-防御素4即对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌产生明显的抑菌作用。

实施例四：包含牦牛β-防御素4的非蛋白氮饲料的制备

1、按质量比为1～2:1，将预糊化淀粉与尿素粉末(纳米级)充分混匀，放入膨化机中、在110～120℃下进行膨化处理，并对膨化后的物料通风冷却，粉碎并过300目筛，获得膨化物料。

2、按预糊化淀粉：纯水的质量比为1～1.5:1，制备第一淀粉混合液。将步骤1获得的膨化物料加入第一淀粉混合液中，每100mL第一淀粉混合液中添加80～120g膨化物料，充分混匀后，风冷干燥，过200目筛，获得包被物料。

3、收集实施例二步骤2获得的重组蛋白β-防御素4。按质量比，预糊化淀粉：β-防御素4＝1.5～2:1，将预糊化淀粉和β-防御素4充分混合后，再加入混合物质量1～1.5倍的纯水，充分混匀，获得第二淀粉混合液。需要说明的是，为方便操作，此处所用的β-防御素4来自实施例二步骤2。在实际生产时，为提高产量，可以用毕赤酵母菌表达生产β-防御素4。

4、将步骤2获得的包被物料加入第二淀粉混合液中，添加量为：每100mL第二淀粉混合液中添加80～100g包被物料。充分混匀后，在80～90℃下低温干燥，干燥至含水量低于20％后，挤压成型，风干冷却，切割至所需大小和形状即可。

按上述方法制备12组饲料，各组中，第一淀粉混合液中均添加65g尿素；各组中，按质量比，步骤2的预糊化淀粉：水均为1:1；步骤3的混合物：水均为1:1。同时设置对照组1，未进行上述步骤1，将未经处理的尿素加入第一淀粉混合液中，进行后续步骤；设置对照组2，未进行上述步骤2，使用膨化物料代替包被物料加入第二淀粉混合液中；设置对照组3，未进行上述步骤1、2，将未经处理的尿素代替包被物料加入第二淀粉混合液中。每组设置三个重复。各组饲料的具体组分如表1所示。表1中的淀粉代表预糊化淀粉。

表1各组饲料组分对照表

5、在40℃下，采用Menke等1979年的方法进行活体外人工瘤胃产气法进行24h体外实验，分别在1、6、12、24h取发酵液，离心后-20℃下冷冻，检测NH₃-N(即氨氮浓度，采用Broderick等，1980年的方法)浓度(mg/mL)，以测试上述各组饲料中尿素的释放速度。以等量同批次未经处理的尿素作为阴性对照组，以等量市购缓释尿素作为阳性对照组1(购自济南孟氏伟业化工有限公司)，以大豆蛋白作为阳性对照组2，每组设置3个重复。结果如表2所示。

表2各组饲料尿素释放速度对照表

实施例五：包含牦牛β-防御素4的非蛋白氮饲料的饲喂效果展示

从实施例四中选择体外实验效果较好的组2、3、5、8、9、11制备的饲料作为饲料添加剂，代替精饲料中30％的植物蛋白，分别饲喂2.5～3岁的健康公牦牛，每组2头重复。各牦牛初始体重为160±20kg。各牦牛在正式试验前，都进行驱虫处理。各牦牛饲喂条件相同，半舍饲，精饲料与干草混合饲喂。精料选用成都施普诺生物技术有限公司，先饲喂当日精料，每日投喂2次精饲料和饲料添加剂。精饲料和饲料添加剂饲喂总量为：2.5kg/头/天。随后自由采食干草，自由饮水。共计饲喂4个月。观察各组牦牛中途是否染病(偶有食欲不振等不计为染病，以出现明显症状且2天内无法自愈，需要药物介入作为染病标准)，如有，统计染病数量，按每头牛次进行统计，例如，同一头牛在试验期间出现3次染病，记为3牛次。统计各组死亡数量。试验结束时对各组牦牛进行称重，计算平均重量(终体重)。以不添加饲料添加剂的组别为对照组。结果如表3所示。

表3各组牦牛生长情况

Claims

1.一种抗菌肽，其特征在于：所述抗菌肽的氨基酸序列为：MRLHHLLLALLFLVLSAGSGFTQVVRNPQSCRWNMGVCIPFLCRVGMRQIGTCFGPRVPCCRRW。

2.权利要求1所述抗菌肽在制备饲料或饲料添加剂中的应用，其特征在于：所述饲料或饲料添加剂的组分包括：预糊化淀粉、尿素、所述抗菌肽。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于：所述尿素先经预糊化淀粉包被处理后，再与所述抗菌肽混合。

4.权利要求2或3所述饲料或饲料添加剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

（1）将预糊化淀粉与尿素混匀，进行一定的膨化处理，冷却后获得膨化物料；

（2）将预糊化淀粉与水混匀，制备第一淀粉混合液，将所述膨化物料加入第一淀粉混合液中，充分混匀，冷却、干燥，获得包被物料；

（3）将预糊化淀粉、抗菌肽充分混合后，再加入纯水，充分混匀，获得第二淀粉混合液；

（4）将所述包被物料加入第二淀粉混合液中，充分混匀，低温干燥、冷却。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤（1）中，预糊化淀粉与尿素的质量比为1～2:1。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤（2）中，每100mL第一淀粉混合液中添加80～120g膨化物料。

7.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤（3）中，按质量比，预糊化淀粉：β-防御素4=1.5～2:1。

8.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤（4）中，每100mL第二淀粉混合液中添加80～100g包被物料。