CN102242138B - 半滑舌鳎抗菌肽hepcidin的重组表达及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种半滑舌鳎抗菌肽hepcidin的重组表达及其应用，所述的表达载体中插入了用于重组表达序列为SEQ ID NO：1的半滑舌鳎抗菌肽hepcidin的核苷酸片段，并在宿主菌中表达半滑舌鳎抗菌肽hepcidin的重组蛋白，并摸索出一种纯化重组蛋白的简单有效的方法，蛋白表达出的蛋白应用在抗病菌类产品上。本发明筛建立和筛选出能有效地进行抗菌肽重组表达的载体及宿主菌，实现了半滑舌鳎抗菌肽在原核生物体内的融合表达及简单有效的纯化，与传统的多肽合成方法及从天然资源提取多肽的方法相比，本发明的制备方法使得大批量、低成本的规模化生产成为可能，可应用于海洋养殖鱼类、养殖禽畜类的饲料添加剂和细菌性疾病的防治。

Description

半滑舌鳎抗菌肽hepcidin的重组表达及其应用

技术领域

本发明属于抗菌重组蛋白技术领域，具体涉及一种半滑舌鳎抗菌肽hepcidin的重组表达及其应用。

背景技术

海水养殖品种生活于富含各种微生物的水环境中，长期的生存适应使其形成了有效的防卫功能，而其中抗菌肽作为是鱼、虾、贝类等动物非特异性免疫防御系统的重要成分之一，在防御海洋性细菌和病毒入侵方面起着重要作用。抗菌肽(antimicrobial peptides)是一类具有很强的广谱抗菌的天然小肽类物质，自1975年瑞典科学家Boman等从蚕蛹身上分离得到第一个抗菌肽天蚕素(Cecropin)以来，人们又在细菌、真菌、植物、无脊椎动物以及脊椎动物中发现了至少900余种抗菌肽。抗菌肽具有抗菌谱广、杀菌活力高、作用迅速、不产生耐药性等特点。

Hepcidin(HEPC，HAMP)是近年来发现的一类由肝脏合成的、富含半胱氨酸的抗菌肽，是β-defensin蛋白家族中的一员(Verga F，et al，Gene.205，364：37-44)。2000年，Krause等(Krause A，et al，FEBS Lett，2002，480：147-150)首先从人血液中分离纯化得到了这一多肽，将其称之为肝脏表达的抗菌多肽(liver expressed antimicrobial peptide，LEAP-1)。2001年，Park等从人尿中也分离到这一多肽，并将其命名为hepcidin(Park C H，et al，J Biol Chem，2001，276：7806-7810)。研究证明，不同种属来源的hepcidin抗菌肽家族在成熟肽同一位点上含有典型特征的八个半胱氨酸残基的保守序列，有抗各种真菌和革兰氏阳性、阴性菌的活性。目前，在鱼类、两栖类、鸟类、哺乳类中都有hepcidin基因的发现。鱼类hepcidin是2002年发现的，由Shiker等首次报道从杂交斑纹鲈鱼(Morone chrysops×M.saxatilis)的鳃中分离得到其成熟肽片段(Shiker H，etal，Eur J Biochem，2002，269：2232-2237)，其肽序列与人的hepcidin同源，成熟肽由21个氨基酸残基组成，含8个半胱氨酸，形成4个分子内二硫键，具有广谱抗菌活性。

抗菌肽的抗菌功效显著，应用前景很广泛，但是由于天然抗菌肽的含量很低，无法大量提取，化学合成价格昂贵，限制了抗菌肽的广泛应用。近年来海水养殖业中抗生素的大量应用，一方面造成水产品中含有过量违禁的抗生素药品，产品质量下降，另一方面引起致病菌的抗药性，养殖环境恶化，已严重影响到水产业的健康发展。与抗生素不同的是，抗菌肽的靶位点主要是病原体细胞膜，不易产生抗性，而且对真核细胞几乎没有作用。抗菌肽在海水养殖鱼类的疾病防治上将是一种应用前景广阔的抗菌药物。因此，利用基因功能技术生产具有高效杀菌效果的抗菌肽，并应用于水产养殖业以及各种禽畜动物的饲养中，已成为我国水产养殖业和畜牧业的必然选择。

原核E.coli表达系统以培养方便，周期短，遗传背景清楚，发酵成本低廉等特点，成为基因功能产业化中的理想表达系统。但是抗菌肽由于分子量小，碱性氨基酸多，在水溶液中以自由卷曲形式存在，易被蛋白酶降解，而且大多数抗菌肽对宿主本身有毒害作用，同时表达后的蛋白纯化及复性过程复杂难以操作，这些因素均限制了抗菌肽重组蛋白的大规模生产及应用。因此，构建合适的融合表达载体，并筛选大量表达且有活性的抗菌肽工程菌株，简化纯化过程，降低生产成本，以实现大规模生产并应用于水产养殖业和畜牧业中，已成为目前研究人员的关注热点之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种半滑舌鳎抗菌肽hepcidin的重组表达及其应用，针对现有技术中抗菌肽合成工序复杂、成本高、不易大规模生产的不足，利用克隆得到的半滑舌鳎抗菌肽hepcidin成熟肽的基因序列，构建原核表达载体，从而获得大量且有活性的抗菌肽，应用于水生生物或禽畜动物养殖中，或作为抗生素的替代品用于生物的病害防治，细菌性甚至病毒性疾病的防治。

本发明技术方案如下：

一种重组表达载体，其特征在于，所述的表达载体用于表达序列为SEQ IDNO：1的半滑舌鳎抗菌肽hepcidin。

所述的表达载体中插入了用于重组表达序列为SEQ ID NO：1的半滑舌鳎抗菌肽hepcidin的核苷酸片段。

所述的核苷酸片段的序列为SEQ ID NO：2。

为了减少促进重组蛋白二硫键形成，本发明的表达载体优选为原核表达载体pET32a(+)。

为了缓解目的基因表达产物的毒性，本发明的表达载体转化入的宿主菌优选为BL21(DE3)pLysS。

重组产生的抗菌肽在制备抗病菌类产品上的应用，所述的抗病菌类产品为饲料添加剂、兽药、防腐剂或医药产品中的任一种。

本发明筛建立和筛选出能有效地进行抗菌肽重组表达的载体及宿主菌，实现了半滑舌鳎抗菌肽在原核生物体内的融合表达，与传统的多肽合成方法及从天然资源提取多肽的方法相比，本发明的制备方法使得抗菌肽大批量、低成本的规模化生产成为可能。本发明可应用于海洋养殖鱼类、养殖禽畜类的饲料添加剂和细菌性疾病的防治，解决了养殖业长期存在的病害危害以及水产品和禽畜产品抗生素累积超标的问题，并以高科技带动了养殖业及养殖饲料工业的行业技术进步。

附图说明

图1：本发明的重组抗菌肽对各种菌株的抑制作用图。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克(Sambrook)等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。

抗菌肽由于分子量小，碱性氨基酸多，在水溶液中以自由卷曲形式存在，易被蛋白酶降解，而且大多数抗菌肽对宿主本身有毒害作用，同时表达后的蛋白纯化及复性过程复杂难以操作，这些因素均限制了抗菌肽重组蛋白的大规模生产及应用。本发明经过长期的筛选后，确定以可促进重组蛋白二硫键形成的原核表达载体pET32a(+)来构建重组质粒；及能够缓解目的基因表达产物毒性的宿主菌BL21(DE3)pLysS来表达半滑舌鳎抗菌肽hepcidin。

实施例1重组表达载体的构建、鉴定以及抗菌肽的表达、纯化

1、重组质粒的构建与鉴定：根据半滑舌鳎抗菌肽hepcidin的成熟肽cDNA序列(SEQ ID NO：2)，按照大肠杆菌偏爱密码子加以修改，利用一对特异引物P1和P2在其两端分别引入限制性内切酶位点EcoRI和NotI位点，扩增半滑舌鳎抗菌肽的成熟肽，引物序列为：

P1：5′-GGAATTCCGTGTGAAGCGC-3′

P2：5′-TATGCGGCCGCTTAGTATTTACAAC-3′；

PCR反应体积为25ul，扩增条件：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃共28个循环；72℃7min。PCR产物经琼脂糖电泳检测后，产物回收并与pMD18-T载体连接，转化DH5α，在LB(Amp+)平板培养后上经PCR反应挑取阳性克隆，测序确定并提取质粒。该质粒与pET32a(+)质粒均用EcoRI和NotI双酶切2h后，酶切产物分别回收，并进行连接，进行PCR鉴定、测序，得到用于表达序列为SEQ ID NO：1的半滑舌鳎抗菌肽hepcidin的重组表达载体。

2、重组蛋白的诱导表达：

将重组表达载体转化进宿主菌BL21(DE3)pLysS，用含100ug/mL的氨苄青霉素与34ug/mL氯霉素的LB培养基扩大培养后，在添加有终浓度为100ug/mL的氨苄青霉素与34ug/mL氯霉素的LB平板中培养，以P1，P2为引物进行PCR反应，筛选转化入重组表达载体的BL21(DE3)pLysS工程菌株。

将挑取的工程菌株单克隆接种于LB培养液中(含100ug/mL的氨苄青霉素与34ug/mL氯霉素)37℃培养过夜。将活化菌以1∶50接种于15mL的2×YT培养液中(含100ug/mL的氨苄青霉素与34ug/mL氯霉素)37℃震荡培养，当OD600约为0.6时加诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.1mM，25℃诱导表达20h，菌液经12,000rmp离心10min收集细胞。

3、重组蛋白的分离纯化：

称取收集的细胞湿重，按照1g∶10～50mL的比例加入裂解液(Tris-Hcl 50mM，EDTA 20mM，Nacl 100mM，Triton-1000.5％)重悬细胞，并超声波破碎细胞，12,000rmp，离心10min收集裂解上清液。利用Amersham Biosciences公司AKTAprime plus层析系统，将上清液过预平衡的金属螯合柱，淋洗至基线后进行梯度洗脱，洗脱液(50mM NaH2PO4，50mM Na2HPO4，PH7.0)中咪唑浓度分别为60、200mM，收集洗脱液，获得纯化的重组抗菌肽。

按重组抗菌肽的表达量占整个菌体总蛋白量进行分析，结果表明，应用本发明的pET32a(+)载体和宿主菌BL21(DE3)pLysS宿主菌，半滑舌鳎抗菌肽hepcidin重组蛋白的表达效率为35％；而选用其他的载体或宿主菌，例如pCRT7表达载体和大肠杆菌TOP10F′感受态细胞，重组蛋白的表达效率仅为20％。

实施例2重组蛋白的抑菌活性测定

应用琼脂孔穴扩散法来检测半滑舌鳎抗菌肽hepcidin重组蛋白的抑菌活性：将处于对数生长期的供试菌悬浮液(OD600＝0.2～0.3)200uL与55℃的LB固体培养基(或海水培养基2216E)25mL混匀后铺板，待其凝固后，用牛津杯(直径8mm)打孔，孔中滴加约1.5uM纯化的重组抗菌肽，37℃(或28℃)培养8-12h，以同体积的PBS做为阴性对照，第2天测量抑菌圈直径。

供试菌包括常见菌：大肠杆菌GM109(E.coli)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureu)，以及主要的海洋病原菌：哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)，副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)，迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)，鳗弧菌(Vibrio anguillarum)，结果表明重组抗菌肽能有效的抑制这六种菌株的生长(图1)。

实施例3：重组产生的抗菌肽在制备抗病菌类产品上的应用

将含有融合蛋白表达载体的大肠杆菌，经常规培养、诱导表达、以本发明提供的纯化方法得到抗菌肽半成品后，可经微滤、超滤、喷雾干燥、冻干等方法生产为粉剂，或以生化方法精制、纯化后得到液体制剂。获得的抗菌肽半成品或兽药级的成品可直接作为抗菌药物，以常规用药量应用于水生生物或其他养殖禽畜疾病的防治。

以常规方式选择鱼粉、骨粉、玉米粉、糠、麸皮、豆饼等作为水生生物或养殖禽畜的基础饲料，将上述获得的融合蛋白粉剂作为饲料添加剂，直接添加于上述水生生物或养殖禽畜的基础饲料中混合，使其所占比例为基础饲料重量的10-15％，制得具有病害防治功能的水生生物或养殖禽畜饲料。液体制剂半成品或成品可通过浸泡、喷洒的方式作用于水生生物喂食前的基础饲料，或通过饮用的方法直接作用于养殖禽畜均可达到防治病害的作用。例如，将重组表达的半滑舌鳎抗菌肽hepcidin蛋白作为饲料添加剂，添加到半滑舌鳎的饲料中，添加的质量比为5％，然后同时对进行抗菌肽hepcidin蛋白添加组和对照组进行病菌感染实验，结果表明，添加组死亡率仅为4％，而对照组的半滑舌鳎的死亡率却高达15％。

Claims (6)

1.一种重组表达载体，其特征在于，所述的重组表达载体包含编码如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列的核苷酸分子。

2.如权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于所述的核苷酸分子的序列为SEQ ID NO：2。

3.如权利要求1所述的重组表达载体，其特征在于，通过将权利要求1中的核苷酸分子构建入原核表达载体pET32a(+)制备获得。

4.权利要求3所述的重组表达载体在表达重组半滑舌鳎抗菌肽hepcidin中的应用，其特征在于，将所述的重组表达载体转化入BL21(DE3)pLysS宿主菌，并重组表达半滑舌鳎抗菌肽hepcidin。

5.权利要求1所述的重组表达载体表达产生的重组半滑舌鳎抗菌肽hepcidin在制备抗病菌类产品中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的抗病菌类产品为饲料添加剂、兽药、防腐剂中的任一种。

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