CN107586329B

CN107586329B - 一种从银鲳中分离的多肽

Info

Publication number: CN107586329B
Application number: CN201711071024.6A
Authority: CN
Inventors: 张曼; 王亚军; 胡佳宝; 余娜; 匡思雯; 曹小欢; 乐琪君; 郑俊勇; 李渊博; 陶顺顺
Original assignee: Xiangshan Gangwan Aquacultural Seeding Co ltd; Ningbo University
Current assignee: Xiangshan Gangwan Aquacultural Seeding Co ltd; Ningbo University
Priority date: 2017-11-03
Filing date: 2017-11-03
Publication date: 2020-08-28
Anticipated expiration: 2037-11-03
Also published as: CN107586329A

Abstract

本发明提供一种从银鲳中分离的具有抗菌性能的多肽，该多肽的序列为SEQ ID NO:1；编码上述多肽的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:2。本发明所提供的抗菌肽对水产领域中常见的病害菌具有明显的抗性，可用作银鲳的饲料添加剂来使用。

Description

一种从银鲳中分离的多肽

技术领域

本发明提供一种从银鲳中分离的抗菌多肽，属于功能性多肽筛选领域。

背景技术

银鲳(Pampus argenteus)隶属鲈形目(Perciformes)，鲳亚目(Stromateoidei)，鲳科(Stromateidae)，鲳属(Pampus)，俗称“车片鱼”、“叉扁鱼”(江浙地区)、“镜鱼”、“平鱼”(河北、山东)、“白鲳”(台湾、福建、广东)。体呈卵圆形，侧扁，口小，被小圆鳞，全身具银色光泽，一般在水深30～70米的水域集群栖息。我国沿海皆产，以东海资源量最高。东海银鲳肉厚、刺少、味佳，营养丰富，有较高的经济价值。过去银鲳的年渔获量曾达到近40万吨，然而进入上世纪90年代以后，由于过度捕捞其资源量出现明显下降，海洋捕捞产量长期维持零增长，加之海洋环境逐年恶化，银鲳资源衰退更为迅速。

为了利用和保护这一重要的鱼种，近三十年来国内外学者们对银鲳开展了众多的研究。但对于银鲳的人工养殖和繁育研究国内起步较晚，直到2000年以后，施兆鸿、彭士明、徐善良等人开始了对银鲳人工养殖和繁育的探索。近几年宁波大学和东海水产研究所两家科研院所先后开展了小规模工厂化养殖试验。经过不断的努力已初步克服了银鲳的饵料营养、越冬与度夏、亲鱼培育等关键技术问题，并于2011年取得重大突破，采用温度、光照综合诱导方法调控银鲳性腺发育成熟，使人工养殖的银鲳亲鱼达到自行产卵，获得了批量受精卵。2015年5月又在国内首次实现了全人工子一代规模化繁育，育苗成活率得到提高。但目前有关银鲳亲鱼性腺发育及产卵调控技术尚不稳定，易受病害、营养、水质等条件影响。因此，病害防治作为银鲳养殖的一个重要环节以提上了研究日程。

在水产养殖病害防治技术领域中，抗生素作为一种对病原菌疗效显著的药物一直得到广泛应用。但随着抗生素的长期使用，大量耐药性菌株不断产生而导致抗生素疗效下降、剂量提高，同时抗生素的滥用情况不断加剧等问题也引起了人们的重视。鉴于新药开发的速度较慢，因此抗菌肽作为一种新型的抗生素替代物就成为了研究热点。

抗菌肽是从昆虫、被囊动物、两栖动物、鸟类、鱼类、哺乳动物、植物乃至人等多种生物体内组织和细胞中提取出的具有一定免疫作用的小分子类物质，又被称做肽抗生素(peptide antibiotics)或抗微生物肽(antimicrobial peptides)。其独特的氨基酸组成及结构中的两亲性和阳离子特点使多肽可以和细胞核内大分子如核酸、蛋白质等，以及病毒或细菌表面带负电荷的成分相结合，进而破坏细胞膜结构或胞内大分子而扰乱细胞的正常功能并导致细胞死亡。

在水产领域中，抗菌肽常被用作饲料添加剂来使用。但外源的抗菌肽常会因为生物不相容性使饲喂的动物产生应激反应；使养殖动物出现生长率降低等问题。因此，有必要筛选养殖动物自身来源的抗菌多肽，并对其结构、功能和作用机理进行分析就具有现实研究意义。

发明内容

本发明提供一种从银鲳中分离的多肽，该多肽具有良好的抗菌效果，从而弥补现有技术的不足。

本发明所提供的具有抗菌活性的多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2；

编码上述多肽的基因，其核苷酸序列为SEQ ID NO:1；

本发明的多肽用于制备抑制细菌生长的制品；

所述的细菌，优选为革兰氏阴性菌；

所述的抑菌制品为饲料添加剂；

所述的饲料添加剂，为银鲳的人工饲料添加剂。

本发明所提供的多肽对水产领域中常见的病害细菌具有明显的抗性，可用作银鲳的饲料添加剂来使用。

附图说明

图1：多肽PA1-1的抗菌肽数据库的序列比对图；

图2：微量肉汤稀释法的96孔板的实验图。

具体实施方式

现在通过具体实施例对本发明进行详细的描述

实施例1：抗菌肽的筛选及检测

通过向银鲳进行腹腔注射细菌进行免疫,分别提取实验组和对照组的肝脏组织，进行抑制性消减杂交后获得差异表达基因的文库。

考虑到天然抗菌肽通常是由小于50个氨基酸残基组成的多肽,分子量约为2000-5000道尔顿。因此，从银鲳抑制性消减杂交后获得的cDNA文库中选择片段大小为200bp或以下的cDNA片段,将其编码的多肽的氨基酸序列输入到抗菌肽数据库(antimicrobialpeptide database,APD)进行相关分析，对相似度高于30％的核苷酸片段进行进一步的抗菌性分析。

最终获得的5条相似度满足要求的多肽，其中一条多肽命名为PA-3，其氨基酸序列为LLNRYYLLNFRRRHYPLSPCTYSNCLC(SEQ ID NO:1)；

编码上述多肽的核苷酸片段，其序列如下：

CTGCTTAACCGGTACTATCTTCTCAACTTCCGACGTAGGCATTATCCACTGTCTCCCTGTACCTACTCTAATTGCCTGTGC(SEQ ID NO:2)，

对PA-3多肽进行检索，其在抗菌肽数据库(antimicrobial peptide database,APD，http://aps.unmc.edu/AP/main.php)中与编号为AP00078的抗菌肽的相似度最高，为32.43％(图1)，表明其为从银鲳中分离的新型多肽。

PA-3多肽的氨基酸残基共有27个，具体如下：

L-L-N-R-Y-Y-L-L-N-F-R-R-R-H-Y-P-L-S-P-C-T-Y-S-N-C-L-C；

其中下划线为疏水性氨基酸，可以看出本发明多肽的N端和C端都是疏水性残基。抗菌肽可以形成一系列的二级结构，在这些二级结构的形成中，抗菌肽的疏水性氨基酸起了重要作用。疏水性使水溶性的抗菌肽能够穿过细胞双分子层，这种疏水相互作用在抗菌肽穿透生物膜的过程中起重要作用。

其次，本发明的多肽中并不存在负电荷氨基酸，而具有5个正电荷氨基酸。一般来说正电荷较多的阳离子抗菌肽活力高于正电荷较少的抗菌肽；通过提高正电荷数目而使抗菌肽活性增强，同时也发现当减少正电荷时会导致抗菌肽失活。因此，申请人推测该多肽相比于其它筛选的多肽具有更好的抗菌性能。

通过商业公司进行多肽的合成，合成的多肽的N末端添加乙酰基，C末端添加酰胺基。合成的多肽的纯度为95％以上，能够用于生物活性检测。

实施例2：微量肉汤稀释法检测PA-3多肽的抗菌性

使用微量肉汤稀释法检测PA-3多肽的抗菌性，根据文献(钱云霞等，海水养殖鱼类细菌性疾病研究概况，海洋湖沼通报，2001第二期，78-87)的记载来选择待检测的细菌。其中弧菌病的致病菌选用鳗弧菌；腹水病选用迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)，链球菌症选用金黄色葡萄球菌；以及杀鲑气单胞菌(Aeromonas salmonicida)；同时检测多肽对诺卡氏菌(Nocardia kampachi)和大肠杆菌(Escherichia coli)进行抗菌性的检测。

其中大肠杆菌、鳗弧菌、迟缓爱德华氏菌、杀鲑气单胞菌为革兰氏阴性菌；而金黄色葡萄球菌、诺卡氏菌为革兰氏阳性菌。

使用微量肉汤稀释法检测PA-3多肽的抗菌性，其具体步骤如下：

一、待测菌悬液的制备：

1)菌液培养：分别取各待测菌的种子液10μL加入10mL MH肉汤培养基中，置37℃温箱过夜静止培养24小时左右；

2)OD600值测定：利用紫外分光光度仪测定OD值，MH肉汤调整菌液浓度使其OD600值落在0.08-0.1之间(菌液浓度约1×10⁸cfu/mL)；

3)稀释获得待测菌悬液：将培养的菌液再进行稀释，使菌液浓度为1×10⁵cfu/mL，此时的菌液即为待测菌悬液；

二、准备PA-3多肽溶液

将PA-3多肽用水溶液，调整起始浓度分别为400μg/ml和300μg/ml；

三、抗菌性的测定

使用3块96孔培养板进行多肽的抗菌性检测，其中第一块板用于检测大肠杆菌和鳗弧菌；第二块板检测迟缓爱德华氏菌和金黄色葡萄球菌；第三快板用于检测杀鲑气单胞菌和诺卡氏菌；

每个菌做两个不同起始浓度的检测，每个浓度做两个平行列，同时做该菌的阳性对照和阴性对照，其中阳性对照是不添加多肽溶液的发酵菌液；阴性对照为灭菌的MH肉汤培养基；在培养板上的具体排列如图2所示。

具体步骤如下：

1)在96孔板的每个孔中加入含TTC(氯化三苯四氮唑)的灭菌的MH肉汤培养基100；

2)在培养板的1/2、7/8列的A孔中加入起始浓度为400μg/ml的多肽溶液，然后对多肽进行连续二倍稀释，即加入多肽溶液的第一孔充分混均后，取100μl加入到同一列的另一个孔中；再充分混合均匀。照此重复到最后一孔，从最后一孔吸取100μl弃去。此时每孔多肽浓度从上到下依次为200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.513μg/ml；

按照上述的步骤，在3/4列、9/10列的A孔中加入起始浓度为300的多肽溶液，然后从上到下每孔进行二倍稀释，每孔的多肽浓度从上到下依次为150、75、37.5、18.75、9.375、4.687、2.3435、1.172μg/ml；

在培养板的1-5列分别加入第一种待测菌悬液100μl、第7-11列分别加入第二种待测菌的悬液100μl；这样1/2、7/8列孔从上到下多肽的浓度分别为100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.513、0.756μg/ml；而3/4列、9/10列孔中多肽的浓度从上到下依次为75、37.5、18.75、9.375、4.687、2.3435、1.172、0.586μg/ml；

第5列和第11列分别作为阳性对照孔；而第6列和第12列加入没有接入菌株，且灭菌的MH肉汤培养基作为阴性对照孔(图2)；

将制备好的培养板在37℃培养24h后，观察结果：

在有菌生产的情况下，TTC会显示红色；如果没有细菌生长，则TTC不显色。

在阳性对照孔都呈现红色，而阴性对照孔没有出现红色的情况下，确定检测结果可靠。

根据PA-3多肽两个梯度的结果，各个菌株的最低抑菌浓度(MIC)结果见表1

表1：第一浓度下PA-3多肽的最低抑菌浓度范围

由上述的结果可看出，本发明所筛选的PA-3多肽对革兰氏阴性菌的抑菌效果明显好于革兰氏阳性菌。

本发明所筛选的PA-3多肽可用作银鲳的饲料添加剂，与其它对革兰氏阳性菌的抑制剂一起使用会有更全面的抑菌效果。

序列表

<110> 宁波大学

<120> 一种从银鲳中分离的多肽

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 27

<212> PRT

<213> 银鲳(Pampus argenteus)

<400> 1

Leu Leu Asn Arg Tyr Tyr Leu Leu Asn Phe Arg Arg Arg His Tyr Pro

1 5 10 15

Leu Ser Pro Cys Thr Tyr Ser Asn Cys Leu Cys

20 25

<210> 2

<211> 81

<212> DNA

<213> 银鲳(Pampus argenteus)

<400> 2

ctgcttaacc ggtactatct tctcaacttc cgacgtaggc attatccact gtctccctgt 60

acctactcta attgcctgtg c 81

Claims

1. 一种具有抗菌活性的多肽，所述的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。

2.编码权利要求1所述的多肽的核酸片段。

3.如权利要求2所述的核酸片段，其特征在于，所述的核酸片段的序列为SEQ ID NO:2。

4.权利要求1所述的多肽在制备抑制革兰氏阴性菌的制品中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述制品为饲料添加剂。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的饲料添加剂，为银鲳的人工饲料添加剂。