CN107827968B

CN107827968B - 一种从六线鱼中分离的多肽

Info

Publication number: CN107827968B
Application number: CN201711299055.7A
Authority: CN
Inventors: 胡发文; 李莉; 王雪; 刘元文; 菅玉霞; 潘雷; 高凤祥; 郭文
Original assignee: Shandong Marine Biology Institute
Current assignee: Shandong Marine Biology Institute
Priority date: 2017-12-08
Filing date: 2017-12-08
Publication date: 2020-11-03
Anticipated expiration: 2037-12-08
Also published as: CN107827968A

Abstract

本发明提供一种从大泷六线鱼中分离的多肽，该多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。本发明的多肽用于制备抗病害微生物制品和饲料添加剂。本发明提供一种从大泷六线鱼中分离的，具有抗菌活性的多肽，该多肽对嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌、金黄色葡萄球菌等水产病害菌具有明显的抗性，且对大泷六线鱼不会产生强的应激反应，可用作大泷六线鱼的饲料添加剂来使用。

Description

一种从六线鱼中分离的多肽

技术领域

本发明属于抗菌多肽筛选技术领域，具体涉及一种从六线鱼中分离的多肽。

背景技术

大泷六线鱼(Hexagrammos otakii)又名欧氏六线鱼、六线鱼，俗称黄鱼，隶属鲉形目(Scorpaeniformes)、六线鱼科(Hexagrammidate)、六线鱼属(Hexagrammos)，为冷温性近海底层岩礁鱼类。主要分布于黄海和渤海沿岸，也见于朝鲜、日本和俄罗斯远东诸海。此鱼耐低温，生存温度2-26℃，在中国主要产自山东和辽宁等地的近海多岩礁海区。其肉质细嫩、味道鲜美，素有“北方石斑”之称，深受广大消费者喜爱，经济价值较高。大泷六线鱼是中国北方网箱养殖的理想种类，也是开拓礁湾增殖和发展游钓业的理想品种，作为北方特有的名贵海水鱼类具有广阔的推广前景。

近年来，抗生素作为一种对病原菌疗效显著的药物在临床上广泛应用。但随着抗生素的长期使用，大量耐药性菌株不断产生而导致抗生素疗效下降、剂量提高，同时抗生素的滥用情况不断加剧等问题也引起了人们的重视。

鉴于新药开发的速度较慢，因此抗菌肽作为一种新型的抗生素替代物引发了学者的强烈兴趣。抗菌肽是从昆虫、被囊动物、两栖动物、鸟类、鱼类、哺乳动物、植物乃至人等多种生物体内组织和细胞中提取出的具有一定免疫作用的小分子类物质，又被称做肽抗生素(peptide antibiotics)或抗微生物肽(antimicrobial peptides)。其独特的氨基酸组成及结构中的两亲性和阳离子特点使多肽可以和细胞核内大分子如核酸、蛋白质等，以及病毒或细菌表面带负电荷的成分相结合，进而破坏细胞膜结构或胞内大分子而扰乱细胞的正常功能并导致细胞死亡。

在水产领域中，抗菌肽常被用作饲料添加剂来使用，使饲喂的动物对病菌具有更好的抵抗力，从而避免发生病害。但外源的抗菌肽常会因为生物不相容性使饲喂的动物产生应激反应；使养殖动物出现生长率降低等问题。因此，有必要筛选养殖动物来源的抗菌多肽，并对其结构、功能和作用机理进行分析就具有现实的研究意义。

发明内容

本发明提供一种从大泷六线鱼中分离的多肽，该多肽具有抗菌的效果，可用做大泷六线鱼的饲料添加剂。

本发明所提供的多肽，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2；

编码上述多肽的基因，其一种序列为SEQ ID NO:1；

本发明的多肽在制备抗病害微生物制品和饲料添加剂的应用。

所述的病害微生物，为水产养殖中的病害微生物，例如嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌、金黄色葡萄球菌。

所述的饲料，为大泷六线鱼的饲料。

本发明提供一种从大泷六线鱼中分离的，具有抗菌活性的多肽，该多肽对嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌、金黄色葡萄球菌等水产病害菌具有明显的抗性，且对大泷六线鱼不会产生强的应激反应，可用作大泷六线鱼的饲料添加剂来使用。

附图说明

图1：HO-AP-1在APD中的比对结果图；

图2：大泷六线鱼血清中皮质素的含量图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：抗菌多肽的筛选

通过向饲养的大泷六线鱼进行体外注射细菌免疫,分别提取实验组和对照组中肝脏，然后进行差异显示PCR(DDRT-PCR)获得差异表达的基因。

具体步骤如下：

1)准备实验用鱼

将大泷六线鱼放入网箱进行养殖，选择体重150-200g左右的鱼，投喂玉筋鱼等鲜杂鱼，早晚各投喂1次，投喂量为鱼体重3％，养殖两周左右准备体外注射菌株进行感染实验；

2)将嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌、金黄色葡萄球菌分别接种至蛋白胨培养基中进行培养，振荡培养至细菌对数生长期后,等体积混合各种菌的培养液进行高温灭菌获得菌悬液。

3)将饲养的大泷六线鱼进行腹腔注射细菌免疫作为实验组，而对照组注射等量的灭菌培养基。注射时先将鱼的腹腔部位用酒精擦拭消毒,然后取一支一次性注射器排尽空气,吸取o.5-1ml灭活菌液,接着将针头沿腹鳍基部插入进行腹腔注射免疫。最后把注射好的鱼恢复活力再进行养殖来诱导免疫反应。

在注射后5d，取出对照组和实验组的肝胰脏,然后用生理盐水把肝胰脏表面的血液清洗干净并放入无水乙醇中脱水,接着将肝胰脏剪成小块放入液氮中速冻,用干冰送到商业公司进行差异显示PCR(DDRT-PCR)操作。

考虑到目前已经研究的抗菌肽编码基因都再200bp以下，在筛选出的有差异表达的核苷酸片段库中，选择片段大小为200bp以下的核苷酸,翻译的氨基酸序列输入到抗菌肽数据库(antimicrobial peptide database,APD)进行相关分析，对相似度高于40％的核苷酸片段进行进一步的抗菌性分析。

最终筛选了多条疑似具有抗菌肽效果的核苷酸片段，其中一条的核苷酸序列如下：

ATTCATTCTATTTTGTCTTGTAGGGGTTGCTGCTGCAATTCTAGAGATACGGATTGTGGTCCTTGCTGTTTTAAG(SEQ ID NO:1)；

其编码的氨基酸序列为：IHSILSCRGCCCNSRDTDCGPCCFK(SEQ ID NO:2)；

将具有上述序列的多肽命名为HO-AP-1。

将HO-AP-1输入到抗菌肽数据库(antimicrobial peptide database,APD)中进行比较，发现其最高相似度为50％(图1)；而blastp的结果，最高相似度为50％(图1)；而NCBI的blastp结果也表明筛选的多肽为大泷六线鱼所特有的。

实施例2：HO-AP-1多肽的抗菌性检测

检测HO-AP-1多肽对嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌、金黄色葡萄球菌的抗菌性能。

具体步骤如下：

1、菌株的活化处理：通过在固体培养基上划线培养，获得嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌、金黄色葡萄球菌的纯化单菌落。分别挑选于25ml液体LB培养基中扩大培养，将培养后的菌液稀释成浓度为5×10⁵CFU/mL，依次取60μl加入到96孔板的各孔内准备进行实验。

2、将重组表达的HO-AP-1多肽定量后，用液体培养基依次做倍比稀释。将稀释好的抗菌肽各取40μl依次加入到96孔板的各个孔中，此时每个孔的反应体系为100μl。96孔板盖盖后，28℃振荡培养24h后，观察并用酶标仪在600nm处测量OD值并记录实验结果。以抑制细菌生长的最小浓度来定义最小抑菌浓度(MIC)。利用发酵的菌液和没有发酵的液体培养基分别用来做阴性和阳性对照，各自代表抑菌率为0和100％。同时用牙鲆抗菌肽hepcidin试验组作为对照。

结果表明筛选的HO-AP-1对嗜水气单胞菌、副溶血弧菌和迟缓爱德华氏菌具有明显的抑菌能力(表1)。

表1：抗菌肽对多种水产致病菌的最低抑菌浓度

实施例3：HO-AP-1多肽的重组表达

1、在HO-AP-1多肽的核苷酸序列的(SEQ ID NO:1)连接入毕赤酵母表达载体中。将含抗菌肽基因的载体和酵母表达载体均用XhoI和XbaI双酶切，酶切产物回收并连接，进行PCR鉴定、测序。

2、阳性质粒经SacI单酶切线性化后加入毕赤酵母感受态细胞悬液中。电转化后均匀涂布于含100μg/mL Zeocin的YPDS选择平板上，30℃孵育3-5天。待YPDS平板上的阳性转化子生长较大，将各转化子依次点种至含Zeocin 200μg/mL、500μg/mL、1000μg/mL的YPDS选择平板，以在高浓度Zeocin平板上正常生长的菌落为可能高拷贝重组菌株。

3、将筛选到的阳性重组菌单菌落活化后按1％-10％接种量接种于三角瓶，28-30℃，200r/min摇床培养16-24h后以5％-20％接种量接入发酵罐中，温度28-30℃，转速500-1500r/min，培养基pH值5.0-6.0，通气量0.1-1.0VVM，溶氧>20％情况下进行发酵，在培养18-24h后流加50％甘油4h，待溶氧突然升至100％时流加甲醇至发酵结束，整个发酵持续48-72h。

4、发酵结束后100℃灭菌10-20min，放料，5000r/min离心10min，收集发酵上清即为抗菌肽半成品。抗菌肽半成品经微滤、超滤、喷雾干燥、冻干等方式获得粉剂。

实施例4：HO-AP-1多肽对大泷六线鱼应激性的影响

考虑到外源抗菌肽会使鱼体产生应激反应，从而影响饲料利用率和生长率。将HO-AP-1多肽作为饲料添加剂添加到大泷六线鱼饲料中进行投喂，通过测量血清中皮质醇素的含量来检测HO-AP-1多肽对大泷六线鱼的应激效果。

选用当年人工孵化的同一批大泷六线鱼作为实验鱼，平均体重为110±10g。将添加HO-AP-1多肽的饲料作为实验组，而添加牙鲆抗菌肽hepcidin的饲料作为实验组；每组养殖10条鱼。

其中使用的饲料组成配比如下：人工配合粉末饲料28-30份、玉筋鱼16-18份、甲壳类8-10份、牡蛎肉8-10份、贻贝肉8-10份、沙蚕8-10份；

血清中皮质醇是评价鱼类抗应激能力的重要指标，鱼类遭受应激源刺激时，皮质醇含量会显著升高，进而促进血糖含量增加，血糖的增加为肌肉和神经提供更多能量，使得鱼类适应应激环境。在此基础上，鱼体对应激源产生了适应性，其生物学功能恢复正常；或随应激程度的加深，鱼类个体或群体水平上出现的诸如生长速率、繁殖能力及抗病能力降低等变化。

血清中皮质醇含量的测定采用北京北方生物技术研究所的试剂盒进行检测。

实验组和对照组的鱼投喂的多肽含量为40mg/Kg，早晚各投喂1次，投喂量为鱼体重3％。实验结束后，每组取5尾鱼，尾静脉采集血液制备血清，测定血清中皮质醇素的含量。采用SPSS17.0对数据进行方差分析。当差异达到显著时用Tukey检验进行多重比较分析。图2的结果表明，对照组饲料中皮质醇含量显著高于实验组饲料(P<0.05)；表明筛选的内源抗菌肽能有效的减少鱼体的应激反应，可用于制备大泷六线鱼的饲料添加剂。

序列表

<110> 山东省海洋生物研究院

<120> 一种从六线鱼中分离的多肽

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 75

<212> DNA

<213> 六线鱼(Hexagrammos otakii)

<400> 1

attcattcta ttttgtcttg taggggttgc tgctgcaatt ctagagatac ggattgtggt 60

ccttgctgtt ttaag 75

<210> 2

<211> 25

<212> PRT

<213> 六线鱼(Hexagrammos otakii)

<400> 2

Ile His Ser Ile Leu Ser Cys Arg Gly Cys Cys Cys Asn Ser Arg Asp

1 5 10 15

Thr Asp Cys Gly Pro Cys Cys Phe Lys

20 25

Claims

1.一种多肽，其特征在于，所述的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

2.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的多肽。

3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。

4.权利要求1所述的多肽在制备抗病害微生物制品中的应用；所述的微生物为嗜水气单胞菌、副溶血弧菌、迟缓爱德华氏菌、金黄色葡萄球菌中的任一种。

5.权利要求1所述的多肽在制备饲料添加剂中的应用，所述的饲料为大泷六线鱼的饲料。