KR101323873B1 - 성장률이 우수한 나노클로롭시스 속 신균주 및 이의 용도 - Google Patents

성장률이 우수한 나노클로롭시스 속 신균주 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 성장증식 능력이 뛰어나고 생체 내에서 중요한 기능을 담당하는 아미노산 및 불포화지방산을 다량 함유하고 있는 나노클로롭시스 속 신균주 및 이의 용도에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 성장능력이 월등히 우수한 로티퍼(Rotifer) 배양용 나노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) KCTC 11963BP 미세조류(일명, 'KMMCC-33'라고 함), 상기 미세조류 및 이의 배양액을 포함하는 로티퍼 사료용 조성물, 상기 로티퍼 사료용 조성물을 유효성분으로 포함하는 수산사료용 제제 및 상기 본 발명의 신규한 미세조류를 이용한 로티퍼 대량 배양방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 신규한 나노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) KCTC 11963BP 미세조류는 다른 종래 미세조류에 비해 성장률이 월등히 우수하고 해수의 염분 조건 하에서도 성장 가능한 내염성을 가지고 있으며, 이를 먹이로 하여 배양한 로티퍼는 각종 생리활성 기능을 하는 아미노산과 불포화지방산을 풍부히 함유하고 있어, 궁극적으로 로티퍼와 같은 플랑크톤의 배양과 이러한 플랑크톤을 먹이로 하는 어류의 양식 산업에 사료로서 매우 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

Description

성장률이 우수한 나노클로롭시스 속 신균주 및 이의 용도{Novel Nannochloropsis sp. capable high growth and use thereof}
본 발명은 성장증식이 뛰어난 나노클로롭시스 속 신균주 및 이의 용도에 관한 것으로서, 대량배양이 용이하고 로티퍼의 먹이로 사용할 수 있는 신균주 나노클로롭시스 속 KCTC 11963BP 미세조류, 이를 포함하는 로티퍼 사료용 조성물, 로티퍼를 배양하는 방법 및 수산사료용 제제에 관한 것이다.
수산생물이 자연계에서 먹이의 대상으로 삼는 살아 있는 동식물을 먹이생물이라 하는데, 해양미세조류는 천해양식 동물의 종묘 생산 시 중요한 먹이생물이 된다. 또한, 해양미세조류는 해양생태계의 1차 생산자로서 해양의 생물생산력을 좌우하는 역할을 한다.
로티퍼(Rotifer)는 1960년대에 최초로 개발된 참돔 Pagrus major 치어의 먹이생물로서, 크기가 작고 운동성이 약한 특징이 있으며, 고밀도 배양이 가능하여 해산 어류의 인공 종묘 생산 시 가장 널리 이용되는 초기 동물성 먹이생물 중 하나이다(Fukusho K. 1989. Biology and mass production of the rotifer, Brachionus plicatilis. Int J Aqu Fish Technol 1, 232-240).
이러한 로티퍼의 대량배양을 위한 먹이생물로 미세조류와 효모가 현재 이용되고 있는데, 미세조류의 경우 Nannochloropsis , Chlorella 및 Nannochloris 가 사용되고 있고, 효모로는 빵효모인 Saccharomyces cerevisiae 와 해양효모인 Candida utilis 가 대표적이다.
그러나 효모는 미세조류에 비해 보다 경제적이라는 점에서 사용하기 용이하지만, 로티퍼의 성장에 필요한 불포화지방산이 부족한 문제점이 있다(Watanabe T, et al. 1980. Relationship between dietary value of brine shrimp Artemia salina and their content of ω-yeast highly unsaturated fatty acids. Bull Jap Soc Sci Fish 46, 35-41). 따라서 이러한 문제점을 해결하기 위해 빵효모에 오징어유를 유화시킨 ω-yeast를 개발하였으나(Hirayama K and Funamoto H. 1983. Supplement effect of several nutrient on nutritive deficiency of baker's yeast for population growth of the rotifer Brachionus plicatilis. Nippon suisan Gakkaishi 49, 505-510), 이 역시 미세조류에 비해 영양가가 떨어지고 수질 오염을 발생시키는 문제점이 있어서 대부분의 부화장에서는 로티퍼의 대량 배양을 위해 고비용이 든다는 단점에도 불구하고 여전히 살아 있는 미세조류를 선호하고 있다.
따라서 대량배양이 용이하고 단백질 및 고도불포화지방산 함량이 높아 로티퍼의 성장능력이 뛰어난 신규한 미세조류의 개발이 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 성장률이 우수한 로티퍼의 먹이생물로 적합한 신규한 미세조류인 나노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.)을 처음으로 분리 및 동정함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 성장률이 우수한 로티퍼(Rotifer) 배양용 나노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) KCTC 11963BP 미세조류를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 상기 나노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) KCTC 11963BP 미세조류 또는 이의 배양액을 포함하는 로티퍼(Rotifer) 사료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 상기 로티퍼(Rotifer) 사료용 조성물을 유효성분으로 포함하는 수산사료용 제제를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 단백질 또는 지질의 활용을 목적으로 배양하는 것을 특징으로 하는 상기 나노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) KCTC 11963BP 미세조류를 대량 배양하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 로티퍼(Rotifer) 배양용 신균주 나노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) KCTC 11963BP 미세조류를 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 로티퍼는 Brachionus plicatilis일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 미세조류는 로티퍼의 성장에 필요한 아미노산 및 불포화지방산의 함량을 증가시켜 로티퍼의 성장을 촉진시킬 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 미세조류는 염분이 15~35psu(practical salinity unit)인 조건에서 내염성을 가질 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 나노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) KCTC 11963BP 미세조류 또는 이의 배양액을 포함하는 로티퍼(Rotifer) 사료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 로티퍼(Rotifer) 사료용 조성물을 유효성분으로 포함하는 수산사료용 제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 나노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) KCTC 11963BP 미세조류를 먹이로 이용하여 로티퍼(Rotifer)를 대량 배양하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 단백질 또는 지질의 활용을 목적으로 배양하는 것을 특징으로 하는 나노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) KCTC 11963BP의 대량배양 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 신규한 나노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) KCTC 11963BP 미세조류는 다른 종래 미세조류에 비해 성장률이 월등히 우수하고 해수의 염분 조건 하에서도 성장 가능한 내염성을 가지고 있으며, 이를 먹이로 하여 배양한 로티퍼는 각종 생리활성 기능을 하는 아미노산과 불포화지방산을 풍부히 함유하고 있어, 궁극적으로 로티퍼와 같은 동물플랑크톤의 배양과 이러한 동물플랑크톤 먹이로 하는 어패류의 양식 산업에 먹이생물 및 사료로서 매우 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명에 따른 나노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) KCTC 11963BP(KMMCC 33)와 다른 미세조류들을 먹이로 사용하여 배양한 로티퍼의 성장률을 측정한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 2는 본 발명에서 분리 및 동정한 신균주의 계통발생학적 분석을 계통수(Phylogenetic tree)로 나타낸 것이다.
도 3a는 본 발명에 따른 신규주인 나노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) KCTC 11963BP(KMMCC 33)를 염분이 30psu인 배양조건에서의 성장률을 나타낸 그래프이다.
도 3b는 본 발명에 따른 신규주인 나노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) KCTC 11963BP(KMMCC 33)를 염분이 15psu인 배양조건에서의 성장률을 나타낸 그래프이다.
본 발명은 아미노산 및 불포화지방산의 함량이 풍부하고 로티퍼의 성장증식 능력이 뛰어나 수상생물의 먹이 공급 부족을 해결할 수 있는 신규한 로티퍼(Rotifer) 배양용 나노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) 미세조류를 제공한다는 데 그 특징이 있다.
일반적으로 로티퍼는 댐, 저수지 등 유속이 완만한 담수역에서 주로 발견되는 윤형동물문(Rotifera)의 동물플랑크톤으로, 지금까지 알려진 바로는 전 세계적으로 2500 여종이 분포하고 있다.
이러한 로티퍼는 수산생물의 먹이생물로 사용되고 있는데, 먹이생물이란 수서생물(aquatic creature)이 어린 시기에 먹게 되는 식물 및 동물플랑크톤을 의미한다. 또한, 로티퍼는 수산생물, 특히 자어에게 필요한 영양분을 고루 갖추고 있어 시중에 판매되고 있는 배합사료보다 훨씬 우수한 먹이생물이 될 수 있다.
뿐만 아니라 실제로 수산 분야에서 증식 및 양식 대상 생물이 되는 어류의 자어를 비롯하여, 무척추동물 중 일부는 수정난에서 부화된 후 먹이로서 로티퍼를 섭취해야만 생존할 수 있다. 이처럼 로티퍼 없이는 수산 증양식 분야의 생물들을 사육하는 것 자체가 불가능하므로, 로티퍼는 이들 수서생물 종묘의 대량 생산시 유용한 먹이생물로서 그 산업적 가치를 인정받고 있다.
한편, 해산어의 종묘 생산 과정에서 먹이생물로 이용 가능한 로티퍼는 배양하는 과정에서 로티퍼의 먹이가 되는 미세조류의 종류에 따라 큰 영향을 받고 있어(Hirayama et.al., 1979) 본 발명에서는 로티퍼의 대량 배양을 가능하게 할 수 있는 신규한 로티퍼 배양용 미세조류를 발굴하기 위해, 연안에서 식물플랑크톤을 수집한 후, 성장이 활발한 신규한 미세조류를 분리 및 동정하였고, 염기서열을 분석하여 계통학적 분류를 조사한 결과, 동일한 염기서열을 갖는 미세조류는 존재하지 않았으며, 계통학적으로 나노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.)에 속하는 것을 확인할 수 있었다.
따라서 본 발명자들은 본 발명에서 분리 및 동정한 신규한 미세조류를 2011.06.14일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁하여 기탁번호 KCTC 11963BP를 부여받았고 이를 “나노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) KCTC 11963BP 미세조류”로 명명하였다.
본 발명에서 분리 및 동정한 상기 나노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) KCTC 11963BP 미세조류는 다른 균주에 비해 로티퍼의 성장 증식이 뛰어나고 아미노산 및 불포화지방산 함량이 우수한 특징이 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 본 발명의 상기 신규 미세조류의 성장 특징이 다른 미세조류들에 비해 현저하게 우수한지를 확인하기 위해 부경대학교 한국해양미세조류은행(Korea Marine Microalgae Culture center, KMMCC)으로부터 분양 받은 KMMCC-13: Nannochloropsis oceanica, KMMCC-16: Nannochoris oculata, KMMCC-119: Nannochoris sp., KMMCC-395: Nannochoris sp., KMMCC-120: Chlorella vulgaris 미세조류들과 본 발명의 신규 미세조류를 대상으로 성장률을 비교한 결과, 본 발명의 신규 미세조류인 나노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) KCTC 11963BP를 먹이로 사용한 로티퍼의 성장률이 가장 높음을 알 수있다(도 1 참조).
또한, 본 발명에서 분리 및 동정한 나노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) KCTC 11963BP 미세조류는 내염성을 갖는 특징이 있으며, 특히 10psu ~ 35psu의 염도 조건 하에서도 활발한 성장을 보이는 특징이 있다.
본 발명에서 동정된 신규 미세조류는 로티퍼의 배양을 위한 먹이용 미세조류로 사용할 수 있는데, 현재 순수 해수역에 서식하는 로티퍼는 10 여종이 있는 것으로 알려져 있고, 담수 유래종 중 일부는 담수와 해수의 중간 정도 수준의 염도를 나타내는 영역, 즉 자연 수역의 기수(汽水, brackish water) 영역에 적응하여 서식하는 것으로 알려져 있다.
따라서 해수뿐만 아니라 기수 영역에 서식하는 로티퍼의 배양을 위해서는 이의 먹이가 되는 미세조류도 내염성을 갖는 것이 필수적일 수 있다.
이에 본 발명자들은 본 발명에서 동정한 나노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) KCTC 11963BP 미세조류의 내염성 정도를 측정하기 위해, 본 발명의 일실시예에서 15psu 및 30psu의 염도 조건 하에 미세조류의 성장 정도를 조사한 결과, 유독 높은 내염성을 보이는 Nannochloropsis 류의 대조군 몇 개를 제외하면 15psu 및 30psu의 염도 조건 하에서도 높은 성장률을 보이는 것으로 나타났다(도 3a 및 도 3b).
상기에서 염도 단위로 사용한 "psu"는 실용 염분 단위인 practical salinity unit를 의미하는 것으로서, 해수 1kg에 녹아 있는 용존 물질의 g 질량의 비(psu)로 염분을 나타낸 것이다. 일반적으로 해수의 평균 염도는 35psu의 염분을 나타낸다고 알려져 있으나 연안은 강우량에 따라 염분의 변화가 심하다.
따라서 본 발명에 따른 신규 미세조류는 연안의 염분 농도의 채집되었지만, 10psu ~ 35psu의 염도 조건 하에서도 활발한 성장을 보이는 것으로 나타나 해수 조건 하에서도 배양이 용이한 특징이 있다. 일반적으로 해수보다는 낮은 농도의 기수에서 채취되고 분리되는 생물은 곧바로 해수에 옮기면 염분 적응에 실패하여 폐사하는 경우가 많으나 본 발명의 신규 미세조류는 해수의 염분 농도에서도 잘 성장할 수 있어 염분 적응에 실패할 우려가 없다.
나아가 본 발명자들은 신규한 나노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) KCTC 11963BP 미세조류가 실제로 영양학적인 면에서 로티퍼의 배양에 유용한지 확인하기 위해 본 발명의 미세조류에 함유된 아미노산 및 지방산의 성분과 함량을 분석하였다.
본 발명의 일실시예에 따른 결과에 의하면, 본 발명의 신규 미세조류의 필수아미노산 및 고도불포화지방산 특히 EPA와 DHA는 모두 다른 대조군에 비해 비교적 높으며(표 3, 4 참조), 이 신규 미세조류를 먹이로 배양한 로티퍼의 경우에도 아미노산과 고도불포화 지방산(polyunsaturated fatty acids, PUFA)이 높게 나타났다. 특히, 유생 생체 내에서 중요한 기능을 담당하고 있는 불포화지방산의 함량이 월등히 많이 함유되어 있는 것으로 나타났다(표 3, 4 참조).
고도불포화지방산 중 EPA(eicosapentaenoic acid) 및 DHA(decosahexaenoic acid)는 등푸른 생선류에 많이 포함되어 있는 것으로 알려져 있으며, 특히 어린 동물들의 성장발육과 면역력 증강에 필수적인 역할을 하는 것으로 알려져 있고, 양식용 어류의 경우에도 치어기에 충분한 양의 EPA나 DHA를 공급받지 못하면 면역기능이 저하되어 치사율이 높고 성어기에 성장 장애가 두드러질 뿐만 아니라 체색이 불량하여 상품성이 현저히 저하되는 문제가 있어 EPA나 DHA는 치어의 먹이용 영양성분으로서 반드시 공급되어져야 하는 성분들이다.
이러한 점에 비추어 볼 때, 본 발명에서 분리 및 동정한 신규한 나노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) KCTC 11963BP 미세조류는 로티퍼 내의 아미노산과 불포화지방산, 특히 EPA(eicosapentaenoic acid) 및 DHA(decosahexaenoic acid)의 함량을 풍부히 할 수 있어, 본 발명의 미세조류로 양식한 치어 등의 수산생물은 영양학적인 면에서 우수할 수 있다.
그러므로 본 발명은 본 발명에 따른 신규한 나노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) KCTC 11963BP 미세조류 또는 이의 배양액을 포함하는 로티퍼 사료용 조성물을 제공할 수 있다.
상기 로티퍼 사료용 조성물은 유효성분으로서 신규한 나노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) KCTC 11963BP 미세조류 또는 상기 미세조류의 배양액을 포함할 수 있는데, 상기 미세조류의 배양액은 미세조류를 포함한 배양액일 수 있고, 또는 배양액 중의 배양배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리 또는 여과과정을 거쳐 수득한 농축 균체을 포함할 수 있으며 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동(frozen)하거나 또는 냉동건조(lyophilized)하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다. 바람직하게 상기 미세조류 및 상기 미세조류의 배양액은 살아있는 미세조류를 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 로티퍼 사료용 조성물을 유효성분으로 포함하는 수산사료용 제제를 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 수산 사료용 제제는 양식 어패류의 먹이생물, 사료첨가제 또는 각 양식 어패류에 따라 시판되는 사료조성물에 상기 본 발명의 사료용 제제를 첨가한 형태로서 제조될 수 있으며, 상기 양식 어패류 이에 제한되지는 않으나 로티퍼를 먹이로 하는 어류라면 모두 포함할 수 있으며, 예를 들면, 어류의 자치어, 갑각류(새우, 게, 가재, 닭새우 등) 및 두족류(문어, 오징어, 낙지 등)의 유생일 수 있다.
본 발명은 본 발명에서 발굴한 신규한 나노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) KCTC 11963BP 미세조류를 이용한 로티퍼의 대량 배양 방법을 제공할 수 있다.
상기 로티퍼의 대량 배양 방법은 로티퍼 배양 방법과정에서 종래 먹이 대신 본 발명의 신규 나노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) KCTC 11963BP 미세조류를 먹이로 사용하여 배양할 수 있으며, 로티퍼 배양 방법으로는 회분(batch)배양 방법, 반 연속 배양 방법 및 고밀도 배양 방법이 있으며, 이들 중 어느 하나의 방법으로 배양할 수 있다.
상기 회분 배양 방법은 가장 일반적인 배양 방법으로 비교적 소형의 배양수조를 여러 개 사용하여 배양하는 방법이고, 상기 반 연속 배양 방법은 비교적 대형의 수조에서 배양하고 일정기간 동안 매일 같은 수조에서 일정량의 로티퍼를 수확한 후 수확한 만큼의 양에 해당되는 배양수를 로티퍼의 먹이나 새로운 배양수를 보충하여 배양하는 방법이다. 또한 상기 고밀도 배양 방법은 로티퍼의 개체밀도를 ml당 10,000~20,000개체로 유지하면서 배양하는 방법으로 이는 로티퍼 개체수가 증가함으로써 발생되는 산소부족과 암모니아의 농도 증가를 제어하는 시스템을 설치하여 배양하는 방법이다.
따라서 본 발명에서 제공하는 로티퍼 대량 배양 방법은 상기 기술된 방법 중 어느 것으로도 배양 할 수 있으며, 본 발명의 신규 미세조류 또는 이를 포함하는 로티퍼 사료용 조성물을 로티퍼 배양수에 첨가하거나 로티퍼의 사료에 첨가하여 사용함으로써 배양할 수 있다.
나아가 본 발명은 단백질 또는 지질의 활용을 목적으로 배양하는 것을 특징으로 하는 나노클로롭시스 속 KCTC 11963BP의 대량 배양 방법을 제공할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
신균주인 나노클로롭시스 속 KCTC 11963 BP 의 분리
<1-1> 균주의 분리
본 발명자들은 생육 발달이 활발하고 대량배양이 가능한 로티퍼의 배양용 먹이로 사용 가능한 새로운 미세조류를 발굴하기 위해 부산 다대포 연안에서 한천 고체 배지(LDM 배지, 표1 참조)에 도말하여 배양한 후, 생장을 보이는 균주를 분리한 후, 해수용 배양액으로 알려진 f/2배지(표 2 참조)를 이용하여 균주를 배양시켰다. 또한 형태학적 분석 및 균학적 특성을 분석하였다.
<1-2> 선별된 균주의 동정
a. 형태학적 동정
상기 실시예 <1-1>에서 분리된 균주를 대상으로 현미경을 통해 균주의 형태학적 모양을 관찰하였다.
관찰 결과, 동정된 균주의 세포는 소형 녹조류로 구형의 형태를 갖는 것으로 관찰되었고, 직경은 2~5μm이며 편모가 없어 운동성을 가지지 않는 것으로 관찰되었다(결과 미도시).
b. 분자생물학적 동정
상기 실시예 <1-1>에서 선별된 균주의 분자생물학적 동정을 위해 당업계에서 사용되고 있는 18S ribosomal RNA의 염기서열을 분석하였다.
그 결과, 본 발명에서 동정한 균주는 나노클로롭시스 속에 속하는 균주인 것으로 나타났고, 분류상 위치는 Eustigmatophyceae - Eustigmatales - Monodopsidaceae - Nannochloropsis에 속하는 것으로 조사되었으며, 특히 Nannochloropsis sp.에 속하는 것으로 분석되었다. 이에 본 발명자들은 상기 동정한 균주의 염기서열을 분석하였고, 그 염기서열을 서열번호 1에 나타내었으며, 이러한 염기서열을 갖는 균주는 기존에 존재하지 않는 신규한 균주임을 확인함으로써, 2011년 06월 14일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁하여 기탁번호 KCTC 11963BP를 부여받았다. 이하 본 발명에서는 상기 동정한 신균주를 “Nannochloropsis sp. KCTC 11963BP”로 명명하였다.
c. 균학적 동정
상기 동정한 신균주인 Nannochloropsis sp. KCTC 11963BP 균주의 균학적 특징을 조사하였는데, 조사 결과, 광합성에 의한 광독립 영양생육을 할 수 있는 것으로 나타났고, 생육 온도는 20~28℃의 범위인 것으로 나타났다.
또한 생육 가능한 염분은 여과해수와 증류수를 혼합하여 15 psu와 30psu로 구분하여 제조한 후, 이들 조건에서 생육을 조사한 결과, 15 psu와 30psu 모두에서 생육 가능한 것으로 조사되었으며(도 3a 및 도3b 참조), 생육 조도는 60 μmol m-2s-1 ~ 100 μmol m-2s-1의 범위인 것으로 조사되었다.
특히 상기 염분 조건 하에서의 생육 조사는 본 발명의 신균주인 Nannochloropsis sp. KCTC 11963BP (일명, 'KMMCC-33'라고 함)와 대조군으로 부경대학교 한국해양미세조류은행으로부터 분양받은 KMMCC-79: Chlorella salina, KMMCC-95: C. vulgaris , KMMCC-58: Nannochloris sp., KMMCC-16: N. oculta, KMMCC-117: Nannochloris sp., KMMCC-119: Nannochloris sp., KMMCC-395: Nannochloris sp., KMMCC-13: Nannochloropsis oceanica를 사용하였다.
< 실시예 2>
본 발명에 따른 신균주의 로티퍼에 대한 먹이 효율 측정
본 발명자들은 본 발명에서 동정한 신균주인 Nannochloropsis sp. KCTC 11963BP가 다른 균주들에 비해 성장률이 우수하다는 사실을 확인함에 따라 실제적으로 이러한 신균주가 로피터의 먹이로 적합한지 조사하기 위해, 본 발명의 신균주를 로티퍼의 먹이로 공급한 후, 로티퍼의 성장률을 분석하였다. 이때 비교를 위해 사용한 상기 미세균주들 또한 로티퍼 배양을 위해 사용되는 균주로서 KMMCC-13: Nannochloropsis oceanica, KMMCC-16: Nannochoris oculata, KMMCC-119: Nannochoris sp., KMMCC-395: Nannochoris sp., KMMCC-120: Chlorella vulgaris를 사용하였으며, 이들 균주는 부경대학교 한국해양미세조류은행으로부터 분양받아 사용하였다.
보다 구체적으로 로티퍼 1마리 당 미세조류의 일일 공급량은 각 미세조류의 세포용적을 고려하여 크기가 가장 작은 N. oculata, Nannochloris sp. (KMMCC-119) 및 Nannochloris sp. (KMMCC-395)는 30×104 cells, N. oceanica와 Nannochloropsis sp.는 22×104 cells, 크기가 가장 큰 C. vulgaris는 15× 104 cells의 양으로 충분히 공급하였다. 이후 로티퍼는 26℃, 15 psu, 60μmol m-2s-1 연속 조명으로 250 mL 삼각 flask(100 mL 수량)에 10 개체/mL로 접종하여 3반복으로 5일간 정치배양하였다. 그런 뒤, 로티퍼의 성장은 매일 1 mL를 3회 무작위로 취하여 Lugol's 용액으로 고정한 후 입체 현미경 하에서 1 mL 당 개체수를 계수하여 Guillard의 방법으로 성장률을 계산하였다[sgr 〓 3.322×log(N1/N0)/t, (t : 접종 후 배양 일수, N0, N1 : 접종 후 및 t 일 후의 세포 밀도)].
또한 본 발명에서 모든 실험 결과의 통계 처리는 One-way ANOVA test를 실시하였으며, 처리 평균간의 유의성(P<0.05)은 Duncan's multiple range test로 하였다. 모든 통계분석은 SPSS (SPSS Inc., 2008; Ver. 17) program을 사용하였다.
그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 배양 5일 만에 로피터의 성장은 본 발명에서 동정한 신균주인 Nannochloropsis sp. KCTC 11963BP(KMMCC-33)를 공급한 로티퍼의 경우 성장률은 0.6806(최고밀도 301 개체/mL)으로 가장 높은 성장률을 보였으며, 이러한 결과는 다른 균주들을 사용한 대조군들에 비해 유의적으로 높은 성장률을 보였다.
이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에서 동정한 Nannochloropsis sp. KCTC 11963BP 균주는 성장이 활발할 뿐만 아니라 로티퍼의 성장도 다른 미세균주들에 비해 월등히 향상시킬 수 있는 특징을 가지고 있어 종래 로티퍼 먹이용 미세균주들에 비해 그 효과가 현저하게 우수하다는 사실을 알 수 있었다.
< 실시예 3>
영양 성분 분석
나아가 본 발명자들은 본 발명에서 동정한 Nannochloropsis sp. KCTC 11963BP 균주 및 이를 먹이로 배양한 로티퍼의 영양성분을 분석하기 위해 아미노산과 지방산을 분석하였는데, 이를 위해 상기 기술된 동일한 방법으로 배양된 Nannochloropsis sp. KCTC 11963BP 균주 및 이를 먹이로 배양한 로티퍼를 대수성장기 종료시에 수확한 다음, 수확한 세포들을 분석 전까지 -80℃에서 냉동 보관하여 이후 실험을 수행하였으며, 이때 비교분석을 위해 본 발명에서 동정한 균주 이외에 KMMCC-13: Nannochloropsis oceanica, KMMCC-16: Nannochoris oculata를 사용한 시료들을 사용하였다. 즉, 비교분석을 위해 사용한 각 균주들 및 이들 균주로 배양한 로티퍼를 대조군 시료로 사용하였다.
먼저 아미노산 분석을 위해 상기 냉동 보관한 각 수확 세포 20 mg을 시험관에 넣고, 6N HCl 15 mL를 가하여 밀봉한 후 110℃에서 24시간 가수분해하였다. 이 분해액을 여과한 후 감압 건조하여 HCl을 완전히 제거한 다음, sodium dilution buffer(pH 2.2)로 25 mL가 되도록 정량한 다음, 이 용액을 일정량 취하여 아미노산 자동분석기 S433(Sykam, Germany)를 이용하여 닌히드린(ninhydrin) 방법으로 분석하였다. 분석조건은 column size 4 mm× 150 mm, 흡광도 570 nm 및 440 nm, 용액 흐름 속도 0.25 mL/min, 버퍼 흐름 속도 0.45 mL/min, 반응기 온도 120℃, 반응기 크기 15 m, 분석시간을 65분으로 하여 분석하였다.
또한, 지방산 분석은 15 mL 시험관에 상기에서 사용한 동일한 일정량의 시료(20 ㎎ 이상)에 10% BF3- methanol 2 mL를 첨가하고 질소로 충전한 다음, 85℃에서 1시간 30분간 가열하여 메틸 에스테르화 하였다(Morrison and Smith, 1964; Budge, 1999). 시료는 약 40℃로 냉각한 후 물과 헥산을 첨가하여 지방산을 분리 추출하였다. 추출된 지방산은 HP autosampler가 설치된 HP GC 6890 Plus(Agilent, USA)를 이용하여 분석하였는데, 지방산 분석에 사용된 GLC는 DB-225(20 m× 0.1 mm, i.d., 0.1 ㎛ film thickness, J&W Scientific, Agilent Technologies, USA)를 이용하였다. 분석 조건은 컬럼 온도가 60~195℃ (25℃/min)가 되도록 하였고, 승온 조건 195~205℃ (3℃/min), 205~230℃ (8℃/min), 주입 온도 250℃, 검출 온도 250℃, 수송 가스 He (60cm/sec)을 사용하였다. 지방산의 분석은 동일조건에서 분석한 standard(PUFA 1, 10 및 37 component FAME Mix, Supelco, Ontaro, Canada)를 이용하여 동정하였다.
분석 결과, 로티퍼의 먹이로 사용할 각 미세조류에 대한 아미노산 분석과 지방산 분석 결과는 하기 표 3 및 4에 기재하였으며, 아미노산 함량은 본 발명에서 규명한 신균주와 다른 균주들 간에 유의적인 차이가 없었고 지방산 함량의 경우 본 발명의 신균주 Nannochloropsis sp. KCTC 11963BP가 고도불포화산(polyunsaturated fatty acid, PUFA)이 40.68%로 가장 높았고 EPA와 DHA 각각 34.88%와 0.29%로 가장 높게 나타났다.
Figure 112011086628017-pat00001
Figure 112011086628017-pat00002
Figure 112011086628017-pat00003
Figure 112011086628017-pat00004
또한, 본 발명의 나노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) KCTC 11963BP 균주를 먹이로 배양한 로티퍼를 대상으로 조사한 아미노산 함량과 지방산 함량은 하기 표 5 및 6에 각각 나타내었다.
Figure 112011086628017-pat00005
Figure 112011086628017-pat00006
총 아미노산 함량은 50.54%로 높았고, 특히 아미노산 성분 중 필수아미노산 에서는 leusine과 lysine이, 비필수아미노산에서는 glutaminc acid와 aspartic acid의 함량이 비교적 높은 것으로 나타났다. 지방산은 고도불포화지방산은 47.36%로 높았고, 이중 EPA와 DHA 함량은 각각 15.27%와 3.29%로 매우 높았다.
이러한 결과를 토대로 본 발명자들은 본 발명에서 분리 및 동정한 신균주인 Nannochloropsis sp. KCTC 11963BP를 로티퍼의 먹이용 미세균주로 사용할 경우 로티퍼의 성장을 촉진시키는 효과가 있고, 로피터의 아미노산 성분과 지방산 성분 역시 다른 미세조류를 사용한 경우에 비해 더 풍족히 함유하고 있다는 사실을 통해 영양학적인 관점에서도 로티퍼의 먹이용 미세균주로 더욱 적합하다는 것을 알 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
한국생명공학연구원 KCTC11963BP 20110614
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Claims (7)

  1. 로티퍼(Rotifer) 배양용 나노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) KMMCC 33 미세조류(기탁번호: KCTC 11963BP).
  2. 제1항에 있어서,
    상기 로티퍼는 브라키오누스 플리카틸리스(Brachionus plicatilis)인 것을 특징으로 하는 나노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) KMMCC 33 미세조류(기탁번호: KCTC 11963BP).
  3. 제1항에 있어서,
    상기 미세조류는 로티퍼의 성장에 필요한 아미노산 및 불포화지방산의 함량을 증가시켜 로티퍼의 성장을 촉진시키는 것을 특징으로 하는 나노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) KMMCC 33 미세조류(기탁번호: KCTC 11963BP).
  4. 제1항에 있어서,
    상기 미세조류는 염분이 15~35psu(practical salinity unit)인 조건에서 내염성을 갖는 것을 특징으로 하는 나노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) KMMCC 33 미세조류(기탁번호: KCTC 11963BP).
  5. 제1항의 나노클로롭시스 속(Nannochloropsis sp.) KMMCC 33 미세조류(기탁번호: KCTC 11963BP) 또는 이의 배양액을 포함하는 로티퍼(Rotifer) 사료용 조성물.
  6. 제5항의 로티퍼(Rotifer) 사료용 조성물을 유효성분으로 포함하는 수산사료용 제제.
  7. 삭제
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