KR20140132226A

KR20140132226A - 신규한 담수산 패오닥틸럼 트리코누툼 균주 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20140132226A
Application number: KR1020130051494A
Authority: KR
Inventors: 허성범; 윤주연
Original assignee: 부경대학교 산학협력단
Priority date: 2013-05-07
Filing date: 2013-05-07
Publication date: 2014-11-17

Abstract

본 발명은 필수 아미노산과 불포화지방산의 함량이 높고, 배양성장률이 빠르면서 크기도 작아 양식업 자치어의 기초 먹이인 로티퍼의 먹이로서 매우 유용한 신균주 담수산 패오닥틸럼 트리코누툼 KCTC 12162BP 미세조류에 관한 것이다. 본 발명의 미세조류는 종래 사용하던 해수산 패오닥틸럼 트리코누툼에 비해 필수 아미노산 및 불포화지방산 함량이 우수하고 크기도 작아, 궁극적으로 로티퍼와 같은 동물플랑크톤의 배양과 이러한 동물플랑크톤 및 식물플랑크톤을 먹이로 하는 어패류의 양식 산업에 먹이생물 및 사료로서 매우 유용하다. 또한 고도불포화지방산 특히 EPA의 함량이 높아 EPA 대량생산을 위한 균주로 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

Description

신규한 담수산 패오닥틸럼 트리코누툼 균주 및 이의 용도 {Novel Phaeodactylum tricornutum derived from fresh water and use thereof}

본 발명은 필수 아미노산과 불포화지방산 특히 EPA의 함량이 높고 크기가 작아 양식업에 있어 자치어의 기초 먹이인 로티퍼의 먹이로서 매우 유용하고 EPA 대량생산에 적합한 신균주 담수산 패오닥틸럼 트리코누툼 KCTC 12162BP 미세조류에 관한 것이다.

수산생물이 자연계에서 먹이의 대상으로 삼는 살아 있는 동식물을 먹이생물이라 하는데, 해양미세조류는 천해양식 동물의 인공 종묘 생산 시 중요한 먹이생물이 된다. 또한, 해양미세조류는 해양생태계의 1차 생산자로서 해양의 생물생산력을 좌우하는 역할을 한다.

로티퍼(Rotifer)는 1960년대에 최초로 개발된 참돔 Pagrus major 치어의 먹이생물로서, 크기가 작고 운동성이 약한 특징이 있으며, 고밀도 배양이 가능하여 해산 어류의 인공 종묘 생산 시 가장 널리 이용되는 초기 동물성 먹이생물 중 하나이다(Fukusho K. 1989. Biology and mass production of the rotifer, Brachionus plicatilis. Int J Aqu Fish Technol 1, 232-240).

이러한 로티퍼의 대량배양을 위한 먹이생물로 미세조류와 효모가 현재 이용되고 있는데, 미세조류로는 Nannochloropsis , Chlorella 및 Nannochloris 가, 효모로는 빵효모인 Saccharomyces cerevisiae 와 해양효모인 Candida utilis 가 대표적이다.

그러나 효모는 미세조류에 비해 보다 경제적이라는 점에서 사용하기 용이하지만, 로티퍼의 성장에 필요한 불포화지방산이 부족한 문제점이 있다(Watanabe T, et al. 1980. Relationship between dietary value of brine shrimp Artemia salina and their content of ω-yeast highly unsaturated fatty acids. Bull Jap Soc Sci Fish 46, 35-41). 따라서 이러한 문제점을 해결하기 위해 빵효모에 오징어유를 유화시킨 ω-yeast를 개발하였으나(Hirayama K and Funamoto H. 1983. Supplement effect of several nutrient on nutritive deficiency of baker's yeast for population growth of the rotifer Brachionus plicatilis. Nippon suisan Gakkaishi 49, 505-510), 이 역시 미세조류에 비해 영양가가 떨어지고 수질 오염을 발생시키는 문제점이 있어서 대부분의 부화장에서는 로티퍼의 대량 배양을 위해 고비용이 든다는 단점에도 불구하고 여전히 살아 있는 미세조류를 선호하고 있다.

따라서 대량배양이 용이하고 단백질 및 고도불포화지방산 함량이 높아 로티퍼의 성장능력이 뛰어난 신규한 미세조류의 개발이 필요한 실정이다.

한국등록특허 제0326593호

이에 본 발명자들은 필수 아미노산과 불포화지방산의 함량이 높고 크기가 작아 로티퍼의 먹이생물로 적합한 신규한 미세조류인 담수산 패오닥틸럼 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum) KCTC 12162BP을 처음으로 분리 및 동정함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 필수 아미노산 및 불포화지방산 함량이 우수한 로티퍼(Rotifer) 배양용 패오닥틸럼 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum) KCTC 12162BP 미세조류를 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 상기 패오닥틸럼 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum) KCTC 12162BP 미세조류 또는 이의 배양액을 포함하는 로티퍼(Rotifer) 사료용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 상기 로티퍼(Rotifer) 사료용 조성물을 유효성분으로 포함하는 수산사료용 제제를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 패오닥틸럼 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum) KCTC 12162BP 균주를 먹이로 공급하여 EPA를 대량생산하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 로티퍼(Rotifer) 배양용 신균주 패오닥틸럼 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum) KCTC 12162BP 미세조류를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 필수 아미노산의 함량은 9 ~ 15 ug/mg, 불포화지방산은 EPA의 함량 20 ~ 26 ug/mg 및 DHA의 함량은 3 ~ 9 ug/mg일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 미세조류의 크기는 길이 10 ~ 17 μm, 폭 5 ~ 7 μm 이고, 담수에서 배양 가능할 수 있다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 패오닥틸럼 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum) KCTC 12162BP 미세조류 또는 이의 배양액을 포함하는 로티퍼(Rotifer) 사료용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명에 따른 상기 로티퍼(Rotifer) 사료용 조성물을 유효성분으로 포함하는 수산사료용 제제를 제공한다.

나아가 본 발명은 패오닥틸럼 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum) KCTC 12162BP 균주를 이용하여 EPA를 대량생산하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 신규한 패오닥틸럼 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum) KCTC 12162BP 미세조류는 다른 종래 미세조류에 비해 필수 아미노산 및 불포화지방산 함량이 우수하고 크기도 작아, 궁극적으로 로티퍼와 같은 동물플랑크톤의 배양과 이러한 동물플랑크톤을 먹이로 하는 어패류의 양식 산업에 먹이생물 및 사료로서 매우 유용하게 사용할 수 있는 효과가 있다.

도 1은 본 발명의 신균주를 분리한 뒤 형태학적 분석 및 균학적 특성을 분석하기 위하여 사진 촬영한 결과이다.
도 2는 본 발명의 일실시예에 따라서 본 발명 신균주의 세포밀도와 성장률을 측정한 결과이다.(KMMCC 0278: 본 발명의 신규 미세조류, KMMCC 0626: 비교를 위해 사용한 대조군 해수산 미세조류)
도 3은 본 발명의 일실시예에 따라서 본 발명의 신균주를 로티퍼의 먹이로 공급한 뒤 개체밀도와 성장률을 측정한 결과이다. (KMMCC 0278: 본 발명의 신규 미세조류, KMMCC 0626: 비교를 위해 사용한 대조군 해수산 미세조류)

본 발명은 필수 아미노산 및 불포화지방산의 함량이 풍부하고 크기가 작아 로티퍼의 먹이용으로 적합한 신규한 로티퍼(Rotifer) 배양용 패오닥틸럼 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum) 미세조류를 제공한다는 데 그 특징이 있다.

일반적으로 로티퍼는 댐, 저수지 등 유속이 완만한 담수역에서 주로 발견되는 윤형동물문(Rotifera)의 동물플랑크톤으로, 지금까지 알려진 바로는 전 세계적으로 2500 여종이 분포하고 있다.

이러한 로티퍼는 수산생물의 먹이생물로 사용되고 있는데, 먹이생물이란 수서동물(aquatic animal)의 사육 시 어린 자치어 시기에 먹게 되는 식물 및 동물플랑크톤을 의미한다. 또한, 로티퍼는 자치어에게 필요한 영양분을 고루 갖추고 있어 시중에 판매되고 있는 배합사료보다 훨씬 우수한 먹이생물이 될 수 있다.

뿐만 아니라 실제로 수산 분야에서 증식 및 양식 대상 생물이 되는 어류의 자치어를 비롯하여, 무척추동물 중 일부는 수정난에서 부화된 후 먹이로서 로티퍼를 섭취해야만 생존할 수 있다. 이처럼 로티퍼 없이는 수산 증양식 분야의 생물들을 사육하는 것 자체가 불가능하므로, 로티퍼는 이들 수서생물 종묘의 대량 생산 시 유용한 먹이생물로서 그 산업적 가치를 인정받고 있다.

한편, 해산어의 종묘 생산 과정에서 먹이생물로 이용 가능한 로티퍼는 배양하는 과정에서 로티퍼의 먹이가 되는 미세조류의 종류에 따라 큰 영향을 받고 있어(Hirayama et.al., 1979) 본 발명에서는 영양학적으로 우수한 신규한 로티퍼 배양용 미세조류를 발굴하기 위해, 담수에서 식물플랑크톤을 수집한 후, 성장이 활발한 신규한 미세조류를 분리 및 동정하였고, 염기서열을 분석하여 계통학적 분류를 조사한 결과, 동일한 염기서열을 갖는 미세조류는 존재하지 않았으며, 계통학적으로 패오닥틸럼 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum)에 속하는 것을 확인할 수 있었다.

따라서 본 발명자들은 본 발명에서 분리 및 동정한 신규한 미세조류를 2012.03.14일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁하여 기탁번호 KCTC 12162BP를 부여받았고 이를 “패오닥틸럼 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum) KCTC 12162BP 미세조류”로 명명하였다.

본 발명에서 분리 및 동정한 상기 패오닥틸럼 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum) KCTC 12162BP 미세조류는 다른 균주에 비해 필수 아미노산 및 불포화지방산 함량이 우수하고 크기가 작은 특징이 있다.

본 발명자들은 신규한 패오닥틸럼 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum) KCTC 12162BP 미세조류가 영양학적인 면에서 로티퍼의 배양에 유용한지 확인하기 위해 본 발명의 미세조류에 함유된 아미노산 및 지방산의 성분과 함량을 부경대학교 한국해양미세조류은행(Korea Marine Microalgae Culture Center, KMMCC)으로부터 분양 받은 해수산 패오닥틸럼 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum) 균주 (KMMCC 0001, KMMCC 0626, KMMCC 0746, KMMCC 0807, KMMCC 0808, KMMCC 0447, KMMCC 1193 및 KMMCC 1194)들과 비교하였다.

본 발명의 일실시예에 따른 결과에 의하면, 본 발명의 신규 담수산 패오닥틸럼 트리코누툼의 필수아미노산 및 고도불포화지방산 특히 EPA, DPA 및 DHA는 모두 다른 해수산 대조군에 비해 월등히 높음을 알 수 있었다(표 3, 4 참조).

고도불포화지방산 중 EPA(eicosapentaenoic acid), DPA(docosapentaenoic acid) 및 DHA(decosahexaenoic acid)는 등푸른 생선류에 많이 포함되어 있는 것으로 알려져 있으며, 특히 어린 동물들의 성장발육과 면역력 증강에 필수적인 역할을 하는 것으로 알려져 있고, 양식용 어류의 경우에도 자치어기에 충분한 양의 EPA, DPA 및 DHA를 공급받지 못하면 면역기능이 저하되어 치사율이 높고 성어기에 성장 장애가 두드러질 뿐만 아니라 체색이 불량하여 상품성이 현저히 저하되는 문제가 있어 EPA, DPA 및 DHA는 치어의 먹이용 영양성분으로서 반드시 공급되어져야 하는 성분들이다.

또한, 본 발명의 일실시예에 따른 결과에 의하면 본 발명의 신규 담수산 패오닥틸럼 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum) 미세조류는 다른 해수산 패오닥틸럼 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum)에 비하여 크기가 작아 로티퍼의 먹이로 사용하기 적합함을 알 수 있었다(표 5 참조).

이러한 점에 비추어 볼 때, 본 발명에서 분리 및 동정한 신규한 패오닥틸럼 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum) KCTC 12162BP 미세조류는 로티퍼 내의 필수 아미노산과 불포화지방산, 특히 EPA, DPA 및 DHA의 함량을 풍부히 할 수 있고, 크기도 작아 본 발명의 미세조류로 양식한 자치어 등의 수산생물은 영양학적인 면에서 우수할 수 있다.

그러므로 본 발명은 본 발명에 따른 신규한 패오닥틸럼 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum) KCTC 12162BP 미세조류 또는 이의 배양액을 포함하는 로티퍼 사료용 조성물을 제공할 수 있다.

상기 로티퍼 사료용 조성물은 유효성분으로서 신규한 패오닥틸럼 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum) KCTC 12162BP 미세조류 또는 상기 미세조류의 배양액을 포함할 수 있는데, 상기 미세조류의 배양액은 미세조류를 포함한 배양액일 수 있고, 또는 배양액 중의 배양배지를 제거하고 농축된 균체만을 회수하기 위해 원심분리 또는 여과과정을 거쳐 수득한 농축 균체을 포함할 수 있으며 농축된 균체는 통상적인 방법에 따라 냉동(frozen)하거나 또는 냉동건조(lyophilized)하여 그 활성을 잃지 않도록 보존할 수 있다. 바람직하게 상기 미세조류 및 상기 미세조류의 배양액은 살아있는 미세조류를 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 로티퍼 사료용 조성물을 유효성분으로 포함하는 수산사료용 제제를 제공할 수 있다.

본 발명에 따른 상기 수산 사료용 제제는 양식 어류의 먹이생물, 사료첨가제 또는 각 양식 어류에 따라 시판되는 사료조성물에 상기 본 발명의 사료용 제제를 첨가한 형태로서 제조될 수 있으며, 상기 양식 어류 외에도 연체류(조개, 전복, 소라 등), 갑각류(새우, 게, 가재, 닭새우 등), 두족류(문어, 오징어, 낙지 등) 및 극피류(성게, 해삼) 등과 같은 무척추동물일 수 있다.

본 발명은 본 발명에서 발굴한 신규한 패오닥틸럼 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum) KCTC 12162BP 미세조류를 이용한 로티퍼의 대량 배양 방법을 제공할 수 있다.

상기 로티퍼의 대량 배양 방법은 로티퍼 배양 방법과정에서 종래 먹이 대신 본 발명의 신규 패오닥틸럼 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum) KCTC 12162BP 미세조류를 먹이로 사용하여 배양할 수 있으며, 로티퍼 배양 방법으로는 회분(batch)배양 방법, 반 연속 배양 방법 및 고밀도 배양 방법이 있으며, 이들 중 어느 하나의 방법으로 배양할 수 있다.

상기 회분 배양 방법은 가장 일반적인 배양 방법으로 비교적 소형의 배양수조를 여러 개 사용하여 배양하는 방법이고, 상기 반 연속 배양 방법은 비교적 대형의 수조에서 배양하고 일정기간 동안 매일 같은 수조에서 일정량의 로티퍼를 수확한 후 수확한 만큼의 양에 해당되는 배양수를 로티퍼의 먹이나 새로운 배양수를 보충하여 배양하는 방법이다. 또한 상기 고밀도 배양 방법은 로티퍼의 개체밀도를 ml당 10,000~20,000개체로 유지하면서 배양하는 방법으로 이는 로티퍼 개체수가 증가함으로써 발생되는 산소부족과 암모니아의 농도 증가를 제어하는 시스템을 설치하여 배양하는 방법이다.

따라서 본 발명에서 제공하는 로티퍼 대량 배양 방법은 상기 기술된 방법 중 어느 것으로도 배양 할 수 있으며, 본 발명의 신규 미세조류 또는 이를 포함하는 로티퍼 사료용 조성물을 로티퍼 배양수에 첨가하거나 로티퍼의 사료에 첨가하여 사용함으로써 배양할 수 있다.

나아가 본 발명은 단백질, 지질 또는 항산화제, 자외선 차단제 등의 기타 생리활성물질의 활용을 목적으로 배양하는 것을 특징으로 하는 신규 담수산 패오닥틸럼 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum) KCTC 12162BP의 대량 배양 방법을 제공할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시 예에 한정되는 것은 아니다.

< 참조예 >

통계분석

모든 실험 결과는 One-way ANOVA test를 실시하였으며, 평균간의 유의성(P<0.05)은 Duncan's multiple range test로 하였다. 모든 통계 분석은 SPSS (SPSS Inc., 2008; Ver. 17) program을 사용하였다.

< 실시예 1>

신균주인 패오닥틸럼 트리코누툼 KCTC 12162 BP 의 분리

<1-1> 균주의 분리

본 발명자들은 생육 발달이 활발하고 대량배양이 가능한 로티퍼, 무척추동물의 유생 및 치패의 배양용 먹이로 사용 가능한 새로운 미세조류를 발굴하기 위해 부산 부경대학교내 담수 양어장 연못에서 식물플랑크톤 망으로 채집, 한천 고체 배지(LDM 배지, 표1 참조)에 도말하여 배양한 후, 생장을 보이는 균주를 순수분리한 후, 담수용 배양액으로 알려진 JM배지(표 2 참조)를 이용하여 균주를 배양시켰다. 또한 형태학적 분석 및 균학적 특성을 분석하였다.

<1-2> 선별된 균주의 동정

a. 형태학적 동정

상기 실시예 <1-1>에서 분리된 균주를 대상으로 고배율현미경을 통해 균주의 형태학적 모양을 관찰하였다.

관찰 결과, 동정된 균주의 세포는 장축 12.1 ± 1.3 μm 단축 6.2 ± 0.6 μm의 크기로 규조류의 우상목(pennales) 니쯔시아과(Nitzschiaceae) 패오닥틸럼 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum)으로 관찰되었다(도 1 참조).

b. 분자생물학적 동정

상기 실시예 <1-1>에서 선별된 균주의 분자생물학적 동정을 위해 당업계에서 사용되고 있는 18S ribosomal RNA의 염기서열을 분석하였다.

그 결과, 본 발명에서 동정한 균주는 패오닥틸럼 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum)에 속하는 것으로 분석되었다. 이에 본 발명자들은 상기 동정한 균주의 염기서열을 분석하였고, 그 염기서열을 서열번호 1 에 나타내었으며, 이러한 염기서열을 갖는 담수산 패오닥틸럼 트리코누툼 균주는 기존에 존재하지 않는 신규한 담수산 패오닥틸럼 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum)균주임을 확인함으로써, 2012년 03월 14일자로 한국생명공학연구원 미생물자원센타에 기탁하여 기탁번호 KCTC 12162BP를 부여받았다. 이하 본 발명에서는 상기 동정한 신균주를 “Phaeodactylum tricornutum KCTC 12162BP”로 명명하였다.

< 실시예 2>

영양 성분 분석

본 발명자들은 본 발명에서 동정한 Phaeodactylum tricornutum KCTC 12162BP 균주 및 이를 먹이로 배양한 로티퍼의 영양성분을 분석하기 위해 아미노산과 지방산을 분석하였는데, 이를 위해 상기 기술된 동일한 방법으로 배양된 Phaeodactylum tricornutum KCTC 12162BP 균주를 대수성장기 종료 시에 수확한 다음, 수확한 세포들을 분석 전까지 -80℃에서 냉동 보관하여 이후 실험을 수행하였으며, 이때 비교분석을 위해 본 발명에서 동정한 Phaeodactylum tricornutum KCTC 12162BP 균주인 KMMCC 0278 이외에 해수산 균주인 KMMCC 0001, KMMCC 0626, KMMCC 0746, KMMCC 0807, KMMCC 0808, KMMCC 0447, KMMCC 1193 및 KMMCC 1194를 사용한 시료들을 사용하였다.

먼저 아미노산 분석을 위해 상기 냉동 보관한 각 수확 세포 20 mg을 시험관에 넣고, 6N HCl 15 mL를 가하여 밀봉한 후 110℃에서 24시간 가수분해하였다. 이 분해액을 여과한 후 감압 건조하여 HCl을 완전히 제거한 다음, sodium dilution buffer(pH 2.2)로 25 mL가 되도록 정량한 다음, 이 용액을 일정량 취하여 아미노산 자동분석기 S433(Sykam, Germany)를 이용하여 닌히드린(ninhydrin) 방법으로 분석하였다. 분석조건은 column size 4 mm× 150 mm, 흡광도 570 nm 및 440 nm, 용액 흐름 속도 0.25 mL/min, 버퍼 흐름 속도 0.45 mL/min, 반응기 온도 120℃, 반응기 크기 15 m, 분석시간을 65분으로 하여 분석하였다.

또한, 지방산 분석은 15 mL 시험관에 상기에서 사용한 동일한 일정량의 시료(20 ㎎ 이상)에 10% BF₃- methanol 2 mL를 첨가하고 질소로 충전한 다음, 85℃에서 1시간 30분간 가열하여 메틸 에스테르화 하였다(Morrison and Smith, 1964; Budge, 1999). 시료는 약 40℃로 냉각한 후 물과 헥산을 첨가하여 지방산을 분리 추출하였다. 추출된 지방산은 HP autosampler가 설치된 HP GC 6890 Plus(Agilent, USA)를 이용하여 분석하였는데, 지방산 분석에 사용된 GLC는 DB-225(20 m× 0.1 mm, i.d., 0.1 ㎛ film thickness, J&W Scientific, Agilent Technologies, USA)를 이용하였다. 분석 조건은 컬럼 온도가 60~195℃ (25℃/min)가 되도록 하였고, 승온 조건 195~205℃ (3℃/min), 205~230℃ (8℃/min), 주입 온도 250℃, 검출 온도 250℃, 수송 가스 He (60cm/sec)을 사용하였다. 지방산의 분석은 동일조건에서 분석한 standard(PUFA 1, 10 및 37 component FAME Mix, Supelco, Ontaro, Canada)를 이용하여 동정하였다.

분석 결과, 각 균주에 대한 아미노산 분석과 지방산 분석 결과는 하기 표 3 및 4에 기재하였으며, 신균주의 아미노산 함량은 발린(valine), 루신(leucine), 트립토판(tryptophan), 메티오닌(methionnine) 등의 각각의 아미노산 함량이 다른 균주들보다 높으며, 특히 필수 아미노산(essential amino acid, EAA)과 총 단백질 구성비율이 확연히 높아 본 발명의 신균주인 패오닥틸럼 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum KCTC 12162BP)인 KMMCC 0278의 아미노산 조성은 양적으로나 질적으로 우수하여 미세조류 중 영양성 단백질원으로서 이용되기에 적합한 종으로 생각된다(표 3 참조).

또한, 지방산 함량은 콜레스테롤 저하, 뇌기능 촉진 등 각종 질병의 예방에 중요한 불포화지방산 특히 C20:5n3(EPA)와 C22:6n3(DHA) 등의 오메가 3 고도불포화 지방산이 유의하게 높고 총 지방산과 총 지질함량 역시 다른 균주들보다 월등히 높아 본 발명의 신균주인 패오닥틸럼 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum KCTC 12162BP)인 KMMCC 0278은 영양학적으로 매우 우수하다는 것을 알 수 있었다(표 4 참조).

이러한 결과를 토대로 본 발명자들은 본 발명에서 분리 및 동정한 신균주인 Phaeodactylum tricornutum KCTC 12162BP 가 아미노산 성분과 지방산 성분이 다른 미세조류에 비해 풍족히 함유하고 있어 로티퍼의 먹이용 미세균주로 사용할 경우 영양학적인 관점에서 우수한 미세균주로 적합하다는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 3>

크기 분석

본 발명자들은 본 발명에서 동정한 Phaeodactylum tricornutum KCTC 12162BP 균주의 크기를 측정하여 로티퍼의 먹이로 적합한지를 알아보았다.

각 균주의 길이와 폭을 측정하기 위하여 고배율 현미경을 사용하였으며, Moticam Pro 205A(Motic Instruments Inc., Richemond, BC, Canada)를 이용하여 대수성장기의 세포를 무작위로 100개체 선정하여 측정하였다.

그 결과, 대조군인 다른 균주들에 비해 본 발명의 신균주인 패오닥틸럼 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum)인 KCTC 12162BP의 크기가 작아 로티퍼는 물론 다른 조개류의 먹이생물로 사용하기 적합함을 알 수 있었다(표 5 참조).

< 실시예 4>

본 발명에 따른 신균주의 로티퍼에 대한 먹이 효율 측정

본 발명자들은 본 발명에서 동정한 신균주인 Phaeodactylum tricornutum KCTC 12162BP 균주가 로티퍼(Brachionus plicatilis)의 먹이로 적합한지 조사하기 위해, 본 발명의 신균주를 로티퍼의 먹이로 공급한 후, 로티퍼의 성장률을 분석하였다. 이 때 비교를 위해 사용한 해수산 균주는 로티퍼 배양을 위하여 흔히 사용되는 균주인 크기가 작고 지질함량이 비교적 높은 KMMCC 0626를 사용하였다. 로티퍼 균주는 부경대학교 유용플랑크톤기탁등록기관(CCUMP)으로부터 분양받아 사용하였다. 대조군인 해수산 균주와 본 발명의 패오닥틸럼 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum) 균주를 7일간 배양했을 때 세포밀도와 성장 결과는 도 2에서와 같이 본 발명의 Phaeodactylum tricornutum KCTC 12162BP KMMCC 0278가 해수산 균주 KMMCC 0626보다 높음을 알 수 있었다.

로티퍼는 25℃, 20 psu, 60μmol m^-2s^-1 연속 조명으로 150 mL 삼각 flask(100 mL 수량)에 20 개체/mL로 접종하고 로티퍼 1마리 당 미세조류의 일일 공급량은 5× 10⁴cells의 양으로 충분히 공급하여, 3반복으로 14일간 정치배양하였다. 로티퍼의 성장은 매일 동일한 시간에 1 mL를 3회 무작위로 취하여 Lugol's 용액으로 고정한 후 입체현미경 하에서 1 mL 당 개체수를 계수하여 Guillard의 방법으로 성장률을 계산하였다[sgr 〓 3.322×log(N₁/N₀)/t, (t: 접종 후 배양 일수, N₀, N₁ : 접종 후 및 t 일 후의 세포 밀도)].

그 결과, 도 3에 나타낸 바와 같이 본 발명에서 동정한 신균주인 Phaeodactylum tricornutum KCTC 12162BP KMMCC 0278 균주를 공급한 로티퍼 균주의 경우 최고밀도 224개체/mL, 일간성장률이 0.23으로 해수산인 KMMCC 0626 균주의 최고밀도 80개체/mL, 일간성장률이 0.11인 것과 비교하여 월등히 높은 성장을 보임을 알 수 있었으며 또한, 배양 11일 이후부터는 해수산 KMMCC 0626 균주의 경우 성장률이 오히려 감소되었으나 본 발명의 신균주는 성장률이 계속 증가함을 알 수 있었다.

이러한 결과를 통해 본 발명자들은 본 발명에 동정한 담수산 Phaeodactylum tricornutum KCTC 12162BP 균주는 해수산 균주에 비하여 성장이 높을 뿐만 아니라 로티퍼의 성장도 월등히 향상시킬 수 있는 특징을 가지고 있어 종래 로티퍼 먹이용으로 사용되던 해수산 균주에 비하여 그 효과가 현저하게 우수하다는 사실을 확인할 수 있었다.

< 실시예 5>

본 발명에 따른 신균주를 먹이로 배양한 로티퍼의 영양성분 분석

나아가 본 발명자들은 본 발명에서 동정한 신균주인 Phaeodactylum tricornutum KCTC 12162BP 균주로 배양한 로티퍼의 영양성분을 분석하기 위하여 앞에서와 동일한 방법으로 지방산을 분석하였다. 이를 위해 상기 기술된 동일한 방법으로 배양된 Phaeodactylum tricornutum KCTC 12162BP 균주 및 이를 먹이로 배양한 로티퍼를 대수성장기 종료 시에 수확한 다음, 수득한 개체들을 분석 전까지 -80℃에서 냉동 보관하여 이후 실험을 수행하였으며, 이때 비교분석을 위해 상기 실시예 4에서 사용한 균주와 동일한 해수산 KMMCC 0626 균주를 먹여 배양한 로티퍼를 대조군 시료로 사용하였다.

분석 결과, 본 발명의 Phaeodactylum tricornutum KCTC 12162BP인 담수산 KMMCC 0278 균주 및 해수산 KMMCC 0626 균주를 먹이로 하여 배양한 로티퍼의 경우 총지질 축적은 서로 유의한 차이가 없었으나 두뇌작용을 활발하게 하고, 혈중 콜레스테롤을 낮추어주는 효과가 있는 고도불포화지방산(n-3 HUFA) 특히 DHA는 본 발명의 Phaeodactylum tricornutum KCTC 12162BP KMMCC 0278 균주를 먹이로 배양한 로티퍼가 해수산 KMMCC 0626 균주를 먹이로 하여 배양한 로티퍼보다 유의하게 월등히 높음을 알 수 있었다(표 6 참조).

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

한국생명공학연구원

KCTC12162BP

20120314

<110> Pukyong National University Industry-University Cooperation Foundation <120> Novel Phaeodactylum tricornutum derived from fresh water and use thereof <130> PN1202-017 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1741 <212> DNA <213> Phaeodactylum tricornutum <400> 1 gaattcgatt tacctggttg atcctgccag tagtcatacg ctcgtctcaa agattaagcc 60 atgcatgtct aagtataaat cttttacttt gaaactgcga atggctcatt atatcagtta 120 tagtttattt gatagtccct tcactatttg gataaccgta gtaattctag agctaataca 180 tgcgtcaata cccttctggg gtagtattta ttagattgaa accaacccct tcggggtgat 240 gtggtgattc ataataagct tgcggatcgc atggcttttg ccggcgatgg atcattcaag 300 tttctgccct atcagctttg gatggtaggg tattggccta ccatggcttt aacgggtaac 360 gggaaatcag ggtttgattc cggagaggga gcctgagaga cggctaccac atccaaggaa 420 ggcagcaggc gcgtaaatta cccaatcctg acacagggag gtagtgacaa taaataacaa 480 tgccgggcct ttctaggtct ggcttttgga atgagaacaa tttaaacccc ttatcgagga 540 tccattggag ggcaagtctg gtgccagcag ccgcggtaat tccagctcca atagcgtata 600 ttaatgttgc tgcagttaaa aagctcgtag ttggatttgt ggtgggcccg gtggctcggc 660 cttagttggc cgttgctgtt ttgggtccgc catccttggg tggaatcagt gtggcattaa 720 gttgtcgcgc tggggatgcc catcgtttac tgtgaaaaaa ttagagtgtt caaagcaggc 780 ttacgccgtt gaatatatta gcatggaaat aatgagatag gaccttggta ctattttgtt 840 ggtttgcgca ccgaggtaat gattaatagg gacagttggg gggtattcgt attccattgt 900 tcagaggtga aattcttgga tttttggaag acgaactact gcgaaagcat ttaccaagga 960 tgttttcatt atcaagaacg aaagttaggg gatcgaagat gattagatac catcgtagtc 1020 ttaaccataa actatgccga caagggattg gcggggtttc gttacgtctc cgtcagcacc 1080 ttatgagaaa tcacaagtct ttgggttccg gggggagtat ggtcgcaagg ctgaaactta 1140 aagaaattga cggaagggca ccaccaggag tggagcttgc ggcttaattt gactcaacac 1200 gggaaaactt accaggtcca gacatagtga ggattgacag attgagagct ctttcttgat 1260 tctatgggtg gtggtgcatg gccgttctta gttggtggag tgatttgtct ggttaattcc 1320 gttaacgaac gagacccctg cctgctaaat agcccagtga gtgaatttca ctgaccaggg 1380 cttcttagag ggacgtgcgt tctattagac gcaggaagat aggggcaata acaggtctgt 1440 gatgccctta gatgttctgg gccgcacgcg cgctacactg atgcattcaa cgagtgtttt 1500 tccttggccg agaggcctgg gcaatctttt gaacgtgcat cgtgataggg atagattatt 1560 gcaattatta atcttgaacg aggaattcct agtaaacgca gatcatcaat ctgcattgat 1620 tacgtccctg ccctttgtac acaccgcccg tcgcacctac cgattggatg gtccggtgaa 1680 gcctcgggat tgtgaccagt gcctttattg gtgttggttg cgagaacttg tctaaacctt 1740 a 1741

Claims

필수 아미노산 및 불포화지방산 함량이 풍부한 패오닥틸럼 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum) KCTC 12162BP 미세조류.
제1항에 있어서,
상기 필수 아미노산의 함량은 9 ~ 15 ug/mg, 불포화지방산은 EPA의 함량 20 ~ 26 ug/mg 및 DHA의 함량은 3 ~ 9 ug/mg인 것을 특징으로 하는 패오닥틸럼 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum) KCTC 12162BP 미세조류.
제1항에 있어서,
상기 미세조류의 크기는 길이 10 ~ 17 μm, 폭 5 ~ 7 μm 이고, 담수에서 배양 가능한 것을 특징으로 하는 로티퍼(Rotifer) 배양용 패오닥틸럼 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum) KCTC 12162BP 미세조류.
제1항의 패오닥틸럼 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum) KCTC 12162BP 미세조류 또는 이의 배양액을 포함하는 로티퍼(Rotifer) 사료용 조성물.
제4항의 로티퍼(Rotifer) 사료용 조성물을 유효성분으로 포함하는 수산사료용 제제.
제1항의 패오닥틸럼 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum) KCTC 12162BP 균주를 이용하여 EPA를 대량생산하는 방법.